糖基转移酶UGT73C5在大肠杆菌中的可溶性表达研究

络塞是一种抗高原反应药物的主要活性成分，可通过尿苷二磷酸糖基转移酶UGT73C5催化肉桂醇糖基化反应合成。然而UGT73C5在大肠杆菌宿主中可溶性表达极差，严重限制了其工业应用。该研究分别通过与分子伴侣共表达和与助溶蛋白标签融合表达的方式，提高UGT73C5在Escherichia coli BL21(DE3)中的可溶性表达。结果显示，除质粒pKJE7外，与分子伴侣质粒pG-KJE8、pGro7和pG-TF2共表达后均可提高UGT73C5酶活力，分别为原始酶活力(18.56 U/g细胞)的1.27、1.18、1.37倍。此外，利用硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)和谷胱甘肽巯基转移蛋白(glutathione S-transferase, GST)两种助溶蛋白标签，构建的融合酶Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5的酶活力为原始酶活力的1.45、2.54倍，且纯化后的比酶活力为原始酶的80%～90%。最后，在2 mmol/L肉桂醇合成络塞的反应中，相同浓度细胞破碎液(粗酶)融合酶GST-UGT73C5比原始酶催化效率更高，4 h后转化率可以达到90%以上，最终转化率...     

底物亲和设计提高腈水解酶Nit6803活性

腈水解酶(Nitrilase, EC 3.5.5.1),是一类可以将腈类物质一步水解为羧酸的酶,是多种重要大宗化工品、药物中间体的理想生物催化剂。但是天然酶活性低、热稳定性差限制了其在工业上的应用。近年来通过蛋白质改造来解决酶活性与稳定性间的“trade-off”效应以提升催化性能的研究较多。该研究提出一种酶-底物亲和设计改造策略,以来源于Syechocystis sp.PCC6803的腈水解酶Nit6803作为改造对象,结合基于Rosetta的Cartesian＿ddG方法和基于自由能微扰的酶-底物亲和力计算,对Nit6803的催化口袋进行单点突变及组合突变设计。基于此获得了活性显著提升的单点突变体F64Y、W170G,及组合突变体F64Y/W170G。其中,F64Y/W170G的比酶活力达到(22.48±0.64) U/mg,为野生型的4.56倍,且该突变体的热稳定性不低于野生型。通过分批补加3-氰基吡啶进行全细胞催化表明F64Y/W170G催化能力强于野生型,在达到相同转化率情况下极大的缩短了催化时间。结果表明,该研究提出的设计策略可以有效提升酶的活性而不影响其稳定性,为酶的理性...     

酶法降解氨基甲酸乙酯及其在白酒中的应用研究进展

白酒的酿造过程会产生氨基甲酸乙酯(EC)，这种致癌物的存在严重影响其食品安全性，如何有效消减白酒中的EC成为了研究热点。酸性脲酶及EC水解酶可降解EC及前体物尿素，具有直接、高效的特点，因此酶法降解成为控制白酒EC含量的最有效方法之一。该研究从酸性脲酶和EC水解酶研究现状、白酒的EC现状分析、白酒中EC的形成机制及酶法降解消减EC在白酒中的应用等方面进行综述，同时，对酸性脲酶和EC水解酶酶产量低、需镍离子(Ni²⁺)作为辅助因子而带来的食品安全问题，提出通过异源表达、底物特异性改造EC水解酶和酸性脲酶等策略以提高酶产量及催化效率，为提高白酒安全性提供重要的理论和实践参考。     

植物乳杆菌漆酶的酶学性质及其对生物胺的降解作用

为研究乳酸菌来源的漆酶酶学性质及其在生物胺降解中的应用潜力,以来源于植物乳杆菌的漆酶编码基因为研究对象,对其进行异源表达及酶学性质的研究,测定其最适温度和pH值、金属离子及螯合剂对漆酶活性的影响、重组漆酶对不同体积分数的乙醇的耐受性以及重组酶对生物胺的降解作用。结果表明,重组漆酶最适温度为40℃,最适pH值为4.0;低浓度的Mg²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺对重组漆酶活力具有不同程度的促进作用,其中Zn²⁺和Ca²⁺的促进作用最为明显;反之,高浓度的Mn²⁺、Fe²⁺和乙二胺四乙酸能够抑制重组漆酶活力至原本的15%甚至更低;2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)为底物时重组酶的米氏常数为2.49 mmol/L,最大反应速率为0.22 mmol/(L·min);重组漆酶对低体积分数乙醇具有很好的耐受性,在含有20%乙醇的体系中保存1 h后相对酶活力仍可达75%以上。生物胺降解实验表明,重组漆酶对酪胺和色胺的降解率达到了100%,对亚...     

大豆乳清废水中β-淀粉酶工业生产工艺的研究

大豆乳清废水中含有较高含量的β-淀粉酶,分别用超滤和乙醇沉淀方法分离大豆乳清废水中的β-淀粉酶,并确定其最佳条件。选用截留分子量为20000 u的超滤膜,在跨膜压差(Δp)为0.25 MPa下,2级超滤9倍,然后先加入冰无水乙醇至乙醇体积分数为30%(v/v)沉淀以除去杂质,再加入冰无水乙醇使乙醇体积分数为70%(v/v)沉淀β-淀粉酶。沉淀用50 mmol/L、p H6.0醋酸钠缓冲液复溶,复溶体积为超滤后体积的1/10,最后得到的β-淀粉酶酶液单位酶活为118600 U/m L,酶活得率为77.54%。应用超滤和乙醇沉淀相结合的方法,使得从大豆乳清废水中大规模地生产β-淀粉酶成为可能。     

多糖奈瑟球菌淀粉蔗糖酶突变株F191M的构建及酶学性质表征

目的:通过定点突变提高淀粉蔗糖酶的活力,研究酶学性质表征,为淀粉蔗糖酶的规模化制备和应用提供试验依据。方法:利用基因工程技术,将来源于多糖奈瑟球菌(Neisseria polysacchare)的AS基因在大肠杆菌BL21上异源表达。对F191位点进行定点突变,筛选获得F191M,再对F191M和野生型淀粉蔗糖酶诱导表达和非变性镍柱纯化后进行酶学性质表征。结果:成功构建突变株F191M,该突变株比酶活为202 U/mg,较野生型提高1.44倍。通过对比F191M与野生型酶学性质发现,F191M最适p H值由野生型的7.0提高为8.0,两者最适温度均为35℃,该温度下,F191M半衰期由野生型的20h降低到19h,F191M对金属离子及有机试剂具有更好的抗性。酶动力学研究显示,F191M的Vmax较野生型提高了1.45倍。结论:突变株F191M在大肠杆菌中得到有效表达,活力较野生型提高了1.44倍。     

一种SUMO-Heparinase I融合酶的可溶性表达与纯化

克隆自肝素黄杆菌（Flavobacteriumheparinum）的肝素酶I（Heparinase I,EC4.2.2.7）广泛应用于低相对分子质量肝素（LMWH,low molecular weight heparin）制备研究。然而,该酶在大肠杆菌表达体系中易形成包涵体,限制了其大量应用。将可溶性配体SUMO（small ubiquitin?鄄like modifier,小泛素类似修饰蛋白质）与C端带有6×His标签的肝素酶基因片段N?鄄端融合表达,菌体总蛋白质和可溶性蛋白质SDS?鄄PAGE电泳表明,N端融合SUMO的肝素酶I可溶性表达比率显著提高;通过镍?鄄亲和柱层析得到均一纯化的融合肝素酶I,融合酶酶学性质表明该融合酶可直接应用于肝素降解而无需切除SUMO标签,为肝素酶I的广泛应用提供了良好的技术基础。     

嗜热杜邦菌α-淀粉酶的定向进化及高效表达

目的:对嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶进行分子改造,以提高其耐热性和产酶水平。方法:基于易错PCR技术构建嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶（Td-amy）的随机突变文库,高通量筛选耐热性和比酶活提高的突变体,通过定点突变及同源结构模拟对突变体进行分析,并将其在毕赤酵母中表达。结果:筛选得到一个正向突变体（mTd-amy）。该突变体最适温度（60 ℃）较野生型（55 ℃）提高了5 ℃,比酶活（466.3 U/mg）较野生型（227.9 U/mg）提高至2.0倍。经序列对比,mTd-amy有四个氨基酸发生了变化,分别为Ala4Val、Ala122Val、Lys194Arg和Ala468Asp,定点突变结果表明Ala122Val和Ala468Asp位点为影响其比酶活和最适反应温度的关键。进一步将突变体mTd-amy在毕赤酵母中高效表达,经高密度发酵其酶活达64696 U/mL。结论:定向进化获得了嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶的正向突变体,该突变体的最适温度和比酶活力均明显提高,为α-淀粉酶的分子改造以及工业化应用等提供了理论参考。     

氨基甲酸乙酯水解酶异源表达及酶学性质分析

将合成的来源于长孢洛德酵母菌（Lodderomyces elongisporus）属的氨基甲酸乙酯水解酶基因在大肠杆菌中实现异源表达,并进行纯化及其酶学性质研究。摇床培养后酶的比活力为4.52 U/mg,经过镍离子亲和层析柱纯化至显示单一条带后酶的比活力为9.86U/mg。酶学性质研究表明,氨基甲酸乙酯水解酶的最适反应温度为30℃;最适pH值为7.0;金属离子Mg2+对该水解酶的酶活有微弱的促进作用,而Cu2+以及Fe3+对酶的活性有强烈的抑制作用;对低含量的乙醇溶液与NaCl溶液有一定的耐受性;并且该水解酶可以对不同底物的酰胺类化合物进行有效降解,以氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate,EC）为底物进行反应时测得水解酶的动力学参数Km值为6.64 mmol/L,最大反应速率Vmax值为8.24 μmol/min。     

苦荞芦丁水解酶的最适作用条件及Cu2+对酶活性的抑制

干燥的苦荞麦种子粉碎后经20mmol/L的醋酸盐缓冲液抽提,Resource Q和Superdex G75 HR 10/300凝胶柱分离纯化,得到一种芦丁水解酶,测定该酶的最适作用条件,研究Cu2+对该酶的抑制作用。结果表明:苦荞芦丁水解酶的分子质量约70kD,最适作用pH值为5.0。反应体系选择20%乙醇时,可保留酶的活性不被抑制,当乙醇体积分数大于50%时,对酶的活性抑制率达90%以上,表明可选用低体积分数乙醇作为芦丁的溶剂,用于芦丁水解酶测活体系及后续槲皮素制备研究。荧光光谱表明,Cu2+与芦丁水解酶以物质的量比1:1的形成稳定的复合物,可以使酶的荧光发生猝灭,水解芦丁的活性降低。表明Cu2+对芦丁水解酶有抑制作用。     

重组融合蛋白MBP-BSH 在大肠杆菌中的表达及其纯化、功能鉴定

选择IF2融合标签,另选择含SUMO、GST、NusA和MBP融合标签的质粒构建表达载体。SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Escherichia Rosetta(DE3) (pLS932-BSH)的诱导表达细胞提取液上清出现了明显的融合蛋白MBP-BSH条带,经诱导表达条件优化后,MBP-BSH可溶性大幅度提高。用Ni-NTA Resin和Amylose Resin分别进行目标蛋白纯化,结果显示前者效果更好,并且C端融合His-Tag更有利于其与Ni离子结合,MBP-BSH蛋白纯化量更大,杂带更少。茚三酮显色反应测定酶活力,结果显示纯化后的MBP-BSH的酶比活力为2.4282U/mg。     

一种SUMO-Heparinase Ⅰ融合酶的可溶性表达与纯化

克隆自肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)的肝素酶Ⅰ(Heparinase Ⅰ,EC4.2.2.7)广泛应用于低相对分子质量肝素(LMWH,low molecular weight heparin)制备研究。然而,该酶在大肠杆菌表达体系中易形成包涵体,限制了其大量应用。将可溶性配体SUMO(small ubiquitin-like modifier,小泛素类似修饰蛋白质)与C端带有6×His标签的肝素酶基因片段N-端融合表达,菌体总蛋白质和可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳表明,N端融合SUMO的肝素酶Ⅰ可溶性表达比率显著提高;通过镍-亲和柱层析得到均一纯化的融合肝素酶Ⅰ,融合酶酶学性质表明该融合酶可直接应用于肝素降解而无需切除SUMO标签,为肝素酶Ⅰ的广泛应用提供了良好的技术基础。     

一株航天诱变玉米秸秆降解菌——黑曲霉的选育

在以玉米秸秆为主要原料的固体发酵培养基中,对经过航空诱变的黑曲霉(Aspergillus niger)进行筛选,得到纤维素酶高产突变株z-8,测得其滤纸酶活力(FPU)为1.84u/mL,纤维二糖水解酶活力(CMCase)为8.16u/mL,葡聚糖内切酶活力(C.)为0.27u/mL,p-葡萄糖苷酶活力(D-Glase)为20.14u/mL,比出发菌株各组分的酶活分别高了2.1倍、3.5倍、1.7倍和1-8倍,并证明该菌株具有较好的产酶稳定性.该菌株对玉米秸秆中纤维素、半纤维素的降解率分别为20.92%和23.99%,对木质素几乎不降解,其酶解得糖率为3.80%,比出发菌株提高了约80%.     

杨梅果渣醇提物降糖活性组分筛选及其功能评价

目的:筛选杨梅果渣醇提物降糖活性组分,评价其体内降糖活性.方法:采用AB-8大孔树脂吸附杨梅果渣粗提物,采用不同体积分数的乙醇(10％,30％,50％,70％和90％)洗脱,筛选主要活性成分含量和α-葡萄糖苷酶抑制活性高的组分,采用糖尿病小鼠模型评价其体内降糖活性.结果:30％乙醇洗脱组分(EC30)的总花色苷、总黄酮...     

氨基甲酸乙酯降解酶的固定化研究

为了制备固定化酶,以体积分数5%的戊二醛溶液与壳聚糖交联8 h制备的载体对氨基甲酸乙酯(EC)降解酶粗酶液进行固定化,并对固定化EC降解酶的酶学性质展开分析。结果表明:固定化EC降解酶的最适温度和最适pH分别是42℃和3.6;该酶在乙醇体积分数7%～25%的范围内和使用次数在8次以内的酶活均保持在50%以上,说明该固定化酶的乙醇耐受范围广,催化活性高;而且分别在4℃和20℃下贮藏6周后的酶活损失率分别不足30%和40%。基于以上特性,为了考察实际应用效果,采用双水相萃取结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)法和顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC/MS)法分析了游离酶和固定酶对"美乐"葡萄酒中EC和挥发性风味物质的影响。结果表明,固定化EC降解酶的EC去除率达30.90%,是游离酶的81.53%;EC降解酶的处理方式对葡萄酒中挥发性物质的相对含量没有显著影响,只是引起了香气物质种类的减少和香气成分的改变,但固定化酶对挥发性风味物质的不利影响远低于游离酶。     

γ-CGTase酶学性质及产物特异性影响因素

将γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)的特有区域作为判断依据,在美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中,通过序列比对及生物信息学分析,筛选出一种新型基因,并将其克隆表达得到一种酶。利用高效液相色谱-质谱联用进行产物鉴定,表明该酶为γ-CGTase;酶分子质量大约为80 kDa,最适温度50℃,最适pH 10.0;无α-环糊精生成;甲醇、乙醇、环己烷、十二醇激活γ-CGTase活力,异丙醇和正丁醇抑制γ-CGTase活力;反应时间、淀粉质量浓度及乙醇体积分数均会影响γ-CGTase的产物特异性。HPLC结果显示,在10%的乙醇最终体积分数条件下,γ-CGTase催化产物中γ-环糊精的比例由40.11%增加至78.20%,专一性提高了94.96%。该研究提供了一种新型的γ-CGTase,为提高γ-CGTase产物特异性提供研究基础。     

易错PCR技术提高源于/Sulfolobus acidocaldarius麦芽寡糖基海藻糖合成酶活性

利用易错PCR技术结合高通量筛选技术对源于Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909的MTSase进行定向进化,获得一个酶活提高的突变体酶D-6。基因分析表明,突变体酶发生了2个位点突变:G432D/G586D,其中突变位点G586D位于Aβ8与AEα14的loop环上。将野生型MTSase和突变体酶D-6进行蛋白质纯化后,测定其酶学性质,结果表明:突变体酶D-6的比活力为野生型MTSase的1.22倍;野生型的Km值为4.74 mmol/L,而突变体D-6为2.77 mmol/L,表明其对底物亲和性较野生型有所提高。     

棉花枯萎病菌产角质酶的连续诱导

角质酶(EC3.1.1.74)是水解酶,可以降解角质产生脂肪酸,属于α/β水解酶,也可以水解甘油三酯等化合物.角质酶的应用十分广泛,但菌株对角质酶的表达量非常有限,因此提高角质酶表达量的研究具有广泛的理论与实践意义.角质酶是一种诱导酶,角质的存在能激活产该酶病菌的角质酶基因,诱导其高效转录表达.本实验经过角质诱导及诱导强度的变化,真菌的角质酶基因转录量大大增加,而未经过角质诱导的真菌角质酶基因转录量非常少.本研究中诱导棉花枯萎病菌的产酶量最高可以达到29.46U/mL,比未诱导的提高至4倍.     

梅奇酵母氨基甲酸乙酯酶分离纯化与酶学性质分析及其对葡萄酒香气的影响

为了研究梅奇酵母所产生氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate,EC）酶的性质,通过硫酸铵盐析、离子交换层析的方法对EC酶进行分离纯化,并对纯化后EC酶的酶学性质进行了分析。结果表明,纯化后EC酶对比纯化前的酶活提高了约1.2倍。纯化后EC酶最适反应温度为35 ℃,在25~45 ℃之间热稳定性较强;最适pH为5.5,在pH5~6时该酶稳定性强,即酸稳定性强,碱稳定性较差。当乙醇体积分数为12%~14%时,EC酶具有一定酶活。底物特异性结果表明,该EC酶对EC及其前体物质（尿素）具有较高的降解能力,且对于成品葡萄酒挥发性香气成分影响不显著。     

米曲霉谷氨酰胺酶在黑曲霉中的重组表达与酶学特性

该研究将米曲霉RIB40（Aspergillus oryzae RIB40）来源的谷氨酰胺酶（GahB）在黑曲霉（Aspergillus niger）宿主中分泌表达。基于该研究所建立表型鉴定板与孔板培养的通量鉴定筛选方法成功得到重组表达谷氨酰胺酶的转化子H-GahB,最高酶活力达到1.35 U/mL。为了增加目的基因在宿主中的拷贝数,采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术重新构建高拷贝的谷氨酰胺酶表达菌株C-GahB,其酶活力提高到3.56 U/mL,约为H-GahB的2.64倍。进一步采用ARTP诱变技术对C-GahB进行传统诱变育种,获得了谷氨酰胺酶工程菌株A-GahB,其酶活力提升到4.16 U/mL,比出发菌株C-GahB的酶活力提高了0.17倍。纯化后的重组GahB的比酶活达到40.63 U/mg,最适温度为37 ℃,最适pH值为7.0,其在20~40 ℃及pH值5.5~8.0之间稳定性较好。K+对GahB的酶活力具有激活作用,Zn2+和Mn2+则对GahB的酶活力有较为强烈的抑制作用。当盐质量分数为18%时,GahB表现出35.38%的相对酶活力。该研究第一次在黑曲霉中实现了来源于米曲霉RIB40的谷氨酰胺酶GahB的重组分泌表达,为此后对米曲霉谷氨酰胺酶的研究提供了基础。