辣椒转录因子CaNAC083对高温胁迫的响应

【目的】分析辣椒NAC转录因子CaNAC083在高温胁迫响应中的作用,为阐明辣椒耐高温机理奠定基础。【方法】以辣椒P70为材料,扩增CaNAC083基因,对其进行生物信息学分析,在辣椒中构建基因沉默载体沉默该基因,用RT-qPCR检测沉默效率以及高温胁迫相关基因CaHsfA2、CaHsfB5、CaHsp25.9和CaHSP90的相对表达量,测定42 ℃高温胁迫处理10 h前后丙二醛（MDA）含量、相对电导率、F_v/F_m、活性氧（H₂O₂和O^-₂·）含量以及抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT））活性的变化,观测二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑（NBT）染色情况;同时构建过量表达载体转化拟南芥,测定42 ℃高温处理12 h前后的MDA含量、活性氧含量、相对电导率以及抗氧化酶活性的变化,探讨CaNAC083基因对植株耐高温能力的影响。【结果】CaNAC083属于NAP亚家族的一员,且与典型的NAP亚家族成员的结构一致。CaNAC083基因沉默辣椒植株在高温胁迫后叶片损伤较轻,MDA、相对电导率以及活性氧均低于对照植株,而POD、SOD和CAT活性高于对照植株,CaHsfA2、CaHsfB5、CaHsp25.9和CaHSP90相对表达量均高于对照植株。过表达CaNAC083拟南芥株系在高温胁迫下受害程度较WT严重,MDA、相对电导率以及活性氧含量均高于WT,而POD、SOD和CAT活性均低于WT。【结论】CaNAC083基因沉默可以增强辣椒植株的耐高温性,过表达该基因则减弱植株的耐高温性,判断CaNAC083在植物高温胁迫中可能起负调控作用。     

GhCDPK4基因的克隆和功能分析

为了研究棉花中GhCDPK4基因在响应非生物胁迫中所起的作用,通过PCR的方法克隆GhCDPK4基因,利用基因重组技术,构建植物过表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,分析干旱和盐胁迫处理对转基因烟草表型和生理生化指标的影响。本研究成功克隆了属于棉花CDPK家族的基因GhCDPK4,构建了植物过表达载体pCAMBIA2300-GhCDPK4。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现转基因烟草中GhCDPK4基因高水平表达,并且转基因烟草相比于野生型烟草表现出较强的耐旱和耐盐性,其中SOD、POD和CAT活性显著升高,而相对电导率和MDA含量降低。研究结果表明GhCDPK4基因可正向参与应答干旱和盐胁迫。     

马铃薯 StMKK1基因RNAi干扰载体的构建及遗传转化

丝裂原活化蛋白激酶MAPK级联反应在植物响应生物与非生物胁迫中发挥着重要作用。为了获得转基因马铃薯,进一步探索 StMKK1在信号转导和胁迫响应中的功能,从四倍体栽培品种马铃薯Desiree 的cDNA中克隆到 StMKK1基因302 bp的目的片段,并将目的基因的正向片段利用EcoRⅠ和KpnⅠ,反向片段利用HindⅢ和XbaⅠ与重组载体35s-pART27进行连接,构建成35s- StMKK1-pART27-RNAi表达载体;利用农杆菌介导的遗传转化方法,将35s- StMKK1- pART27-RNAi载体导入马铃薯品种Desiree中,得到7株沉默的阳性马铃薯转基因植株,不同的转基因植株中 StMKK1基因的沉默效率经检测均在92%以上。     

MsRCI2A/B/C基因超量表达对紫花苜蓿耐旱性的影响

【目的】分析紫花苜蓿MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C的表达差异并研究其抗旱功能,为苜蓿抗旱机制解析及分子育种奠定基础。【方法】采用qPCR的方法,分析紫花苜蓿MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因在20% PEG6000溶液模拟干旱条件下表达的差异,采用农杆菌介导法获得MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C基因超量表达的转基因苜蓿A12、A22、B13、B19、C2和C10,观察正常生长条件（干旱胁迫0 d）下和20% PEG6000干旱胁迫6,12 d的野生型株系WT（对照）及超量表达的转基因紫花苜蓿的表型,测定超表达苜蓿和WT的叶绿素含量、相对电导率、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT））活性及渗透调节系统（可溶性糖和脯氨酸含量）在干旱胁迫条件下的变化。【结果】在20%PEG6000模拟干旱条件下,MsRCI2A/B/C基因在紫花苜蓿叶和根中表达变化趋势相反,但3个基因在同一组织中的表达趋势相似。紫花苜蓿叶片中的MsRCI2A/B/C基因在干旱胁迫处理后均明显上调,其中MsRCI2A/C基因在干旱胁迫处理2 h时即极显著上升（P<0.01）,而MsRCI2B的表达相对缓慢,在处理8 h时极显著上升（MsRCI2A/B/C<0.01）。在根中,MsRCI2A/B/C基因在干旱胁迫处理2 h时相对表达量极显著下降（P<0.01）。在正常生长条件（干旱胁迫0 d）下,6个转基因苜蓿叶绿素含量、相对电导率和MDA含量、可溶性糖含量和脯氨酸含量与野生型苜蓿（WT）相比无明显差异,但转基因苜蓿SOD、POD、CAT活性明显高于WT（P<0.05）,其中转MsRCI2B/C基因苜蓿叶片中的SOD活性及叶和根中POD活性是WT的1.97~2.27倍。转基因株系A12、A22、B13、B19、C2和C10与野生型苜蓿(WT)同时进行20%PEG6000模拟干旱胁迫处理12 d后,各转基因株系的叶绿素含量极显著高于WT (P<0.01),为WT的3.00~3.46倍,而相对电导率和丙二醛含量则极显著下降了73%和55%。转基因苜蓿叶和根中的可溶性糖和脯氨酸含量及SOD、POD和CAT活性均显著升高（P<0.05）,其中MsRCI2A/C转基因苜蓿叶和根中的CAT活性是WT的2~3倍,MsRCI2B/C转基因苜蓿叶和根中的脯氨酸含量是WT的3倍。【结论】MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C的过表达可以增强苜蓿的耐旱性。     

小麦转录因子TaWRKY28基因克隆与抗旱性分析

【目的】克隆小麦TaWRKY28基因,通过农杆菌浸染法将其转化至拟南芥,研究转基因拟南芥植株生理生化指标变化,探究其在抵御非生物胁迫中的作用。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦百农207 cDNA中克隆得到TaWRKY28基因,利用ProtParam等软件对其氨基酸序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法,分析TaWRKY28基因的组织表达特异性及在NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温逆境胁迫下的表达情况;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,选取TaWRKY28基因相对表达量较高的转基因T₃拟南芥株系,测定拟南芥超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性以及丙二醛（MDA）、H₂O₂和脯氨酸含量,研究TaWRKY28对拟南芥抗旱性的影响。【结果】成功克隆获得小麦TaWRKY28基因,该基因ORF全长为978 bp,编码325个氨基酸,相对分子质量为34.87 ku,理论等电点为9.27,含有1个WRKY保守结构域和1个C₂H₂锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员。序列系统进化分析结果显示,小麦TaWRKY28与大麦HvWRKY2亲缘关系最近。亚细胞定位显示该基因位于细胞核中。qRT-PCR结果表明,TaWRKY28在小麦根、茎、叶、雌蕊和雄蕊组织中均有表达,但具有组织特异表达性,在叶中表达量最高,雄蕊中次之,雌蕊中表达量最低,且受NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温胁迫后TaWRKY28表达会增强。对TaWRKY28转基因拟南芥植株的抗旱性分析表明,在干旱条件下,转基因植株的表型优于野生型,SOD、POD活性和脯氨酸含量显著增加,而H₂O₂和MDA含量显著降低,转基因植株抗旱性显著提高。【结论】克隆了小麦TaWRKY28基因,该基因可以增强转基因拟南芥植株的抗旱能力。     

四季秋海棠BsMYB62的抗旱性功能研究

【目的】以前期从四季秋海棠叶片中克隆得到的R2R3型MYB转录因子BsMYB62为研究对象,分析其在干旱胁迫下的功能。【方法】对四季秋海棠MYB62蛋白进行亚细胞定位,并通过实时荧光定量PCR方法明确BsMYB62基因在四季秋海棠根、茎、叶、雄花和雌花5个组织部位中的表达情况;构建BsMYB62基因的过表达载体转化到拟南芥,观察过表达转基因株系与野生型植株在萌发期和幼苗期遭受干旱胁迫时的生长表型、种子萌发和根长情况,测定各株系在幼苗期干旱胁迫处理时的叶绿素荧光参数PSⅡ最大光化学效率（F_v/F_m）,叶绿素、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量,抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性以及转基因株系中BsMYB62基因的相对表达量变化。【结果】BsMYB62定位于四季秋海棠的细胞核,其在根、茎、叶和雌雄花中均有表达,其中以根和茎中的表达水平较高。在MS培养基中,野生型拟南芥和3个BsMYB62过表达转基因株系（OE1、OE2和OE3）的发芽率和长势均无显著差异,而在200 mmol/L甘露醇（模拟干旱胁迫）培养基中,OE1、OE2和OE3在胁迫处理后前2 d的发芽率及主根长均显著高于野生型拟南芥,幼苗长势也明显优于野生型。置于培养土中干旱胁迫1 d时,OE1、OE2和OE3的BsMYB62即被显著诱导;干旱胁迫13 d时,OE1、OE2和OE3的F_v/F_m、叶绿素含量、Pro含量以及SOD、POD和CAT活性均显著高于野生型拟南芥,而MDA含量则显著低于野生型拟南芥。【结论】BsMYB62基因通过提高转基因拟南芥的光合潜能和抗氧化能力,显著增强其对干旱胁迫的抗性。     

黑果枸杞LrPIP1基因的克隆鉴定及外施水杨酸对其在干旱胁迫下表达的影响

植物质膜水通道蛋白（plasma membrane intrinsic proteins, PIPs）是一类参与植物众多生理活动的多功能蛋白。为探究PIP基因在黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）响应干旱胁迫中的作用,以黑果枸杞为试验材料分离得到PIP基因,命名为 LrPIP1 。使用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、序列进化进行分析,以及预测蛋白质的二级和三级结构并构建基因树等。将幼苗进行不同程度干旱胁迫与外施水杨酸处理,实时荧光定量PCR结果显示,无外源SA处理下,轻度干旱胁迫D1可诱导LrPIP1 基因的相对表达量较CK处理显著上调,中度D2、重度胁迫D3时,LrPIP1 基因的相对表达量较CK有一定程度的上调,但相较于D1表现为显著下降;外源喷施SA可影响干旱胁迫下黑果枸杞LrPIP1 基因的相对表达量,轻度胁迫下,外源SA诱导LrPIP1 基因表达量较CK下调;较CK处理,中、重度胁迫下SA可诱导LrPIP1 基因表达量上调。上述表明,LrPIP1 基因可能在黑果枸杞非生物胁迫响应过程中发挥重要调控作用。     

桂花OfWRKY120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究

【目的】根据前期基因家族鉴定分析得到OfWRKY120,对该基因盐胁迫响应的功能进行分析,为桂花盐胁迫下的调控机制研究奠定基础。【方法】利用生物信息学方法对OfWRKY120保守结构域、系统进化进行分析,并采用qRT-PCR技术研究盐胁迫下OfWRKY120在桂花叶片中的相对表达量。构建OfWRKY120超表达载体,使用亚细胞定位、酵母自激活检测等探究其特性,将该基因瞬时转化本氏烟草后,对烟草进行盐处理,利用DAB、NBT染色和相关生理指标的测定,解析瞬时转化OfWRKY120对本氏烟草耐盐性的影响。【结果】OfWRKY120基因全长为1 422 bp,编码474个氨基酸,存在WRKY superfamily保守结构域。盐胁迫能够激活桂花叶片中OfWRKY120的表达,在72 h时相对表达量最高,与对照有显著差异。亚细胞定位结果表明,OfWRKY120定位于细胞核。酵母自激活结果显示OfWRKY120无自激活活性。盐胁迫后,OfWRKY120瞬时过表达植株的超氧阴离子(O^-₂·)和脯氨酸含量显著高于空载对照,且DAB和NBT染色表现出更深的颜色。本氏烟草中的qRT-PCR结果显示,OfWRKY120显著降低了NbCAT的表达,而显著提高了NbP5CS1、NbP5CS2和NbP5CR的表达。【结论】OfWRKY120过表达增加了盐胁迫下本氏烟草中活性氧（ROS）的含量,导致植物对盐胁迫的敏感性提高。     

拟南芥AtWRKY33基因启动子的克隆及表达分析

以野生型拟南芥为材料,采用PCR技术克隆得到了拟南芥AtWRKY33基因起始密码子ATG上游1 629 bp启动子序列,并利用该启动子驱动GUS基因在野生型拟南芥中表达,对获得的转基因拟南芥采用重金属Cd处理不同时间,进行GUS染色及定量分析。结果表明：AtWRKY33基因启动子与GUS融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达;拟南芥植株中的AtWRKY33基因在根中大量表达;定性与定量实验均显示经重金属Cd处理后的拟南芥幼苗中AtWRKY33基因随着时间增加而被显著诱导表达。说明该基因响应重金属Cd胁迫。     

类黄酮合成关键基因MeF3H在木薯块根采后腐烂中的功能分析

为探究MeF3H在木薯块根采后生理腐烂（PPD）中的功能,以‘华南9号’（‘SC 9’）为试验材料,通过qRT-PCR技术分析MeF3H在叶片、叶柄、茎、脆性胚性愈伤组织（FEC）、花、腋芽、纤维根、块根及块根PPD中的表达情况,确定MeF3H的亚细胞定位,结合病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）分析MeF3H沉默后块根中类黄酮含量及块根腐烂情况。结果表明,MeF3H在腋芽及纤维根中高表达,MeF3H定位在细胞质,MeF3H基因表达及块根中类黄酮含量随着PPD程度加深而升高。qRT-PCR结果显示MeF3H沉默效率在39%~67%。MeF3H沉默后,与对照植株相比,沉默植株叶片及块根中类黄酮含量均显著下降（P<0.05）,且MeF3H基因表达与块根中类黄酮含量呈显著正相关（P<0.05）。在采后储存第3天,块根超过50%的面积出现腐烂,而对照植株块根腐烂率为36.67%。综上,MeF3H表达与木薯块根中类黄酮含量及块根耐PPD能力存在显著正相关（P<0.05）,MeF3H基因沉默后导致木薯块根PPD显著加速。     

棉花干旱诱导MYB类转录因子GhRAX3的功能分析

【目的】挖掘、分析响应干旱诱导的MYB转录因子的功能,为棉花抗旱研究和育种提供参考。【方法】以已知受干旱诱导表达的GbMYB5为检索项,Blastx检索NCBI的非冗余蛋白nr数据库中与GbMYB5具有相似序列的棉花MYB转录因子,通过荧光定量PCR验证获得干旱应答相关的MYB转录因子GhRAX3。将GhRAX3-GFP融合蛋白表达载体通过农杆菌注射法在烟草叶片瞬时表达,观察亚细胞定位荧光信号。将棉花曲叶病毒CLCrV介导的基因沉默载体CLCrV﹕GhRAX3通过农杆菌浸润法注射棉花子叶,荧光定量PCR检测棉花GhRAX3表达水平,对GhRAX3沉默的棉花植株进行干旱胁迫处理,观察表型变化,并检测其叶片失水率、叶片含水量、总抗氧化物酶活性、丙二醛含量和离子渗透率等抗旱相关生理指标。【结果】Blastx检索结果发现,与GbMYB5相比,GhRAX3覆盖率达38%,与GbMYB5有79%的相似性,编码一个R2R3-MYB转录因子。GhRAX3响应干旱诱变表达,在18%（v/v）PEG 6000诱导处理0.5 h后即显著上调表达5倍,在48 h后达上调表达33倍。亚细胞定位结果显示GhRAX3-GFP4融合蛋白仅在细胞核有明显的绿色荧光信号,表明GhRAX3定位在细胞核中。CLCrV病毒诱导GhRAX3沉默后,GhRAX3在沉默株的表达量仅为野生型的41%,表明GhRAX3表达已被抑制。取干旱处理前的棉花植株同部位的叶片,测定单位重量叶片在0-7 h内的失水量,发现GhRAX3沉默植株的叶片失水率显著高于野生型和空载体对照植株。在18%（v/v）PEG 6000水溶液处理24 h或在自然干旱15 d后,GhRAX3沉默的棉花植株萎蔫程度比野生型和空载体对照植株严重。自然干旱处理7 d后,检测叶片含水量、总抗氧化物酶活性、丙二醛含量和离子渗透率等抗旱相关生理指标,发现GhRAX3沉默植株的叶片相对含水量为82%,总抗氧化物酶活性为1.29 U·mg^-1,而野生型和空载体对照植株的叶片相对含水量则分别为89%和91%,总抗氧化物酶活性分别为3.44和3.19 U·mg^-1,GhRAX3沉默植株的叶片相对含水量和总抗氧化物酶活性都显著低于野生型和空载体对照植株;相反,GhRAX3沉默植株叶片的离子渗漏率为78.54%,丙二醛含量为74.20 nmol·mg^-1 FW,而野生型和空载体对照植株叶片的离子渗漏率分别为44.98%和47.45%,丙二醛含量分别为44.90和47.29 nmol·mg^-1 FW,GhRAX3沉默植株叶片的离子渗漏率和丙二醛含量均显著高于野生型和空载体对照。【结论】GhRAX3响应干旱胁迫诱导,抑制GhRAX3表达致使棉花在干旱胁迫条件下的叶片相对含水量和总抗氧化物酶活性显著降低,叶片离子渗漏率和丙二醛含量显著升高,使棉花耐干旱胁迫能力下降。     

棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析

【目的】分析棉花中钠尿肽GhPNP1的结构特征、表达模式以及耐旱功能,并分析其耐旱机制,为将该基因应用于作物改良奠定基础。【方法】通过对从植物中水平转移到大丽轮枝菌中的钠尿肽基因AVE1进行同源性搜索,得到与AVE1蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5软件对AVE1蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用MEGA和expasy在线工具进行蛋白序列分析;并根据编码该蛋白的核酸序列设计引物在陆地棉品种奥3503中克隆到其同源基因GhPNP1。使用多种生物信息学软件分析GhPNP1的分子特性,包括GhPNP1编码蛋白的等电点、分子量、信号肽、进化关系等进行预测分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析GhPNP1在不同器官部位的组织表达模式以及受到PEG模拟干旱胁迫处理后的表达模式。将GhPNP1的cDNA序列连入CLCrV沉默载体中,构建GhPNP1的病毒诱导基因沉默载体CLCrV:GhPNP1,转入农杆菌,并通过和辅助载体CLCrVB共侵润2叶期幼苗进行叶片注射,获得GhPNP1的沉默植株。利用PEG模拟干旱处理沉默植株检测其耐旱性,并测定沉默植株的失水率、相对含水量、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化活性（T-AOC水平）、离子渗漏率等与植物抗逆相关的生理指标。【结果】从陆地棉奥3503中克隆到的GhPNP1的开放阅读框长度为396 bp,编码131个氨基酸,信号肽长度为15个氨基酸,通过系统进化树分析GhPNP1编码的蛋白含有保守的钠尿肽结构域,与可可树的PNP蛋白进化关系最近。GhPNP1在棉花植株的根、茎、叶中均表达且在茎中表达量较高,PEG模拟干旱处理后根、茎、叶中的GhPNP1均上调表达。GhPNP1沉默后棉花植株耐旱性显著降低。在干旱条件下,GhPNP1沉默植株的MDA含量、离子渗漏率、叶片失水率均高于对照的未沉默植株;而沉默植株的总抗氧化能力（T-AOC水平）、相对含水量显著低于对照的未沉默植株。【结论】从棉花中克隆得到一个植物钠尿肽基因,受干旱胁迫诱导上调表达,沉默后耐旱性降低。推测GhPNP1可能通过cGMP信号途径参与棉花的干旱胁迫,在干旱胁迫下对棉花耐旱性起正调控作用。     

玉米ZmSKIP基因的克隆转化

随着淡水资源的匮乏,干旱已成为影响玉米产量众多因素中最主要的非生物因素。而植物的耐旱性又属于数量遗传性状,这给广大遗传育种工作者带来了一个很大的难题。SKIP基因属于RNA调控基因,它参与调节生物体内多种RNA的剪切调控,进一步调整植物状态,应对逆境环境。利用BLAST搜索玉米基因组,得到相似度99%的玉米基因,命名为ZmSKIP。对该基因克隆和生物信息学分析,构建过量表达载体,使用原位转化法得到过表达该基因的转基因株。对转基因株进行耐旱性实验,并使用ELISA方法检测转基因株的ABA含量。结果显示,转基因株中ABA相对野生型上升明显,具有更高的耐旱性。初步推断ZmSKIP在玉米中可能调控相应的耐旱基因表达从而调节植物对逆境的适应能力。     

棉花VIGS病毒载体的构建及其在抗病基因功能鉴定的应用

【目的】利用农杆菌介导的VIGS基因沉默技术,研究陆地棉抗病相关基因在棉花抗黄萎病中的功能。【方法】利用分子生物学技术构建VIGS病毒载体,建立VIGS病毒诱导沉默体系;利用此体系将棉花中的一个钙依赖蛋白(CDPK)基因,通过农杆菌介导在陆地棉中沉默,根据此基因沉默植株在病原菌环境下的发病情况研究该基因在棉花抗病中的功能。【结果】利用包含有GhCPK抗病基因片段的VIGS病毒载体的农杆菌侵染棉花子叶,病毒载体上的目的基因片段由RNA聚合酶识别并合成双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),dsRNA由Dicer酶识别并于其它RNA形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC),RISC对内源GhCPK mRNA进行识别和切割作用,内源GhCPK mRNA降解而发生基因沉默。GhCPK基因沉默导致棉苗对黄萎病敏感性增加,证明GhCPK基因参与调控棉花抗病功能。【结论】病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)能够快速有效的研究GhCPKs基因在棉花抗病中的功能。     

转抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）菊苣抗旱相关生理特性

在获得转抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)菊苣株系的基础上,对3个转基因株系的抗旱相关生理特性进行分析。结果表明：正常供水条件下,转基因株系与非转基因植株各项生理指标差异不显著;干旱条件下, 3个转基因株系菊苣叶片APX质量摩尔浓度均显著高于非转基因对照。3个转基因株系中有2个株系丙二醛（MDA）质量摩尔浓度低于非转基因对照,表明APX基因可显著提高菊苣APX活性,降低氧自由基浓度,减轻对细胞的伤害。3个转基因株系叶片相对含水量、脯氨酸质量分数、叶绿素质量分数、单株幼苗的根系生长量,均高于非转基因对照。可见,转APX基因菊苣具有较强的抗旱能力,从而验证APX基因的抗旱功能,为转基因材料应用于菊苣的抗旱育种提供依据。     

过表达番茄Sly-miR397基因增强拟南芥的耐旱性

为研究番茄miRNA在非生物逆境胁迫下的表达模式和功能分析。利用Real-time PCR检测番茄miRNA397在非生物逆境(干旱、盐害、ABA)条件下的表达量变化,发现Sly-miR397响应这些逆境胁迫,尤其在干旱胁迫下表达最明显。故将Sly-miR397过表达载体转入拟南芥中,进行转基因功能验证。结果表明:与野生型相比,转基因拟南芥植株叶片相对含水量下降速率更缓慢,保水能力更好,且在干旱胁迫下,转基因植株的长势明显优于野生型,其最大光合效率、3种抗氧化酶活性SOD、POD、CAT均明显高于野生型,同时胁迫所产生的丙二醛含量明显低于野生型拟南芥。表明Sly-miR397能提高拟南芥对干旱胁迫的耐受性,在植物抗旱过程中起着重要作用。     

棉花DNA甲基转移酶GhDMT9抗逆性分析

为探究GhDMT9基因的功能,深入了解DNA甲基转移酶在植物表观遗传方面的作用及其作用机制,利用PCR技术从陆地棉TM-1中克隆GhDMT9基因,构建p YL156:GhDMT9 VIGS沉默载体并侵染棉花;构建PBI121:GhDMT9过表达载体转染拟南芥。生物信息学分析结果为:GhDMT9蛋白质相对分子质量为57 691.44 k Da,等电点为5.45,总平均亲水性是-0.359,不存在跨膜结构域。GhDMT9是一种具有亲水能力的酸性稳定蛋白,不是分泌型蛋白,不能在细胞中发生迁移。二级结构预测显示含有α螺旋(29.61%)、无规则卷曲(45.29%)、延伸链(19.22%)、β-转角(5.88%)。干旱和盐胁迫处理VIGS沉默GhDMT9基因的棉花幼苗出现明显的表型差异。实时荧光定量PCR的表达模式分析结果表明:干旱和盐胁迫处理p YL156:GhDMT9侵染过的棉花与对照相比,GhDMT9的转录水平明显降低。干旱和盐处理转GhDMT9基因的拟南芥T3代幼苗叶片失水、发黄、长势较弱。棉花幼苗沉默GhDMT9基因后与对照相比耐盐性降低,过表达GhDMT9基因的拟南芥与野生型的拟南芥相比耐盐性降低。上述结果表明GhDMT9基因在棉花响应胁迫过程中发挥重要作用,为进一步研究棉花的抗逆机制,挖掘功能基因奠定基础。