抑制5-脂氧合酶表达对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术阻断5-脂氧合酶(5-LOX)的表达,观察其对人胰腺癌细胞SW1990增殖及凋亡的作用.方法 构建4个靶向5-LOX的小干扰RNA(small interference,siRNA)和1个阴性对照siRNA质粒表达载体,采用Lipofectamine TM2000法转染SWl990细胞,RT-PCR和Western blot检测RNAi后SWl990细胞的5-LOX mRNA和蛋白表达,MTT法检测细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 阴性对照和4个序列特异性的siRNA对SWl990细胞5-LOXmRNA表达的抑制率分别为(3.0±1.4)%、(18.8±1.5)%、(53.5±2.3)%、(56.1±2.0)%、(52.4±2.5)%;5-LOX蛋白表达抑制率分别为(4.5±2.0)%、(18.1±2.5)%、(50.4±4.3)%、(48.9±4.4)%、(45.9±4.0)%.转染24 h后癌细胞增殖抑制率分别为(2.1±1.0)%、(5.5±1.3)%、(11.9±1.2)%、(13.4±1.1)%、(13.8±1.3)%.;48 h的增殖抑制率分别为(3.0±1.3)%、(16.0±2.2)%、(25.7±2.5)%、(25.3±3.1)%、(27.2±3.2)%.转染24 h细胞凋亡率分别为(2.0±0.8)%、(5.3±1.0)%、(10.6±1.2)%、(12.4±1.0)%、(10.6±0.9)%;转染48 h的凋亡率分别为(3.0±1.0)%、(7.1±1.1)%、(17.5±0.9)%、(21.5±1.1)%、(15.7±1.0)%.结论 通过RNAi可以有效、特异地阻断SWl990细胞5-LOX的表达,并可以有效抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡.     

雷公藤内酯醇对5-LOX代谢通路和胰腺癌细胞凋亡的影响

目的:探讨雷公藤内酯醇(triptolide,TL)通过抑制5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)代谢通路对胰腺癌细胞生长增殖及凋亡的影响.方法:台盼蓝染色检测TL对胰腺癌细胞PANC-1、ASPC-1和SW1990的杀伤作用;流式细胞术分析凋亡率;Real-time PCR和Western blot检测TL对5-LOX表达的影响;ELISA检测5-LOX下游产物LTB4的含量.构建5-LOX表达质粒,筛选稳定转染的Sw1990细胞株(SW1990/5-LoX),western blot检测野生型、转染空质粒、转染5-LOX基因的SW1990细胞5-LOX蛋白表达水平,并检测胰腺癌细胞高表达5-LOX对TL诱导凋亡的影响.结果:TL能诱导胰腺癌细胞凋亡,TL 50 μg/L作用24 h后活细胞比例为PANC-1 70.5%±6.8%,ASPC-1 61.2%±5.6%,SW1990 52.8%±5.3%,比对照组显著减少(P<0.05);凋亡细胞数12 h组与对照组相比,有差异(24.2±3.23vs 9.5±2.18,P<0.05).TL能显著抑制5-LOX表达及LTB4生成.稳定转染后,细胞内5-LOX蛋白表达量是Wt组的4倍左右,培养上清中LTB4表达水平也显著高于Wt组(P<0.01).过表达5-LOX使SW1990细胞增强了对TL诱导凋亡的抵抗作用,细胞死亡和凋亡率均明显低于对照组(P<0.01或0.05).结论:TL可以在体外诱导胰腺癌细胞增殖抑制和细胞凋亡,该效应与TL抑制5-LOX代谢通路的活性可能有直接关系,提示TL可能开发成临床治疗胰腺癌的有效药物.     

5-脂氧合酶抑制TNF-α诱导的胰腺癌细胞凋亡

目的:检测胰腺癌细胞中5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)及其代谢产物的表达情况,分析高表达5-LOX及LTB4对胰腺癌细胞生长凋亡的影响.方法:体外培养人胰腺癌细胞株ASPC-1,PANC-1和SW1990,并构建5-LOX基因稳定转染细胞株.用RT-PCR和Western blot检测细胞5-LOX mRNA和蛋白的表达,ELISA检测细胞培养上清中LTB4的含量,采用流式细胞仪、Annexin V/PI双染法检测TNF-α诱导细胞的细胞凋亡.结果:三种胰腺癌细胞株均表达5-LOX mRNA和蛋白,细胞上清中也都检测到一定量LTB4分泌.5-LOX基因稳定转染细胞株表达5-LOX和LTB4的水平上升.TNF-α(20μg/L)处理野生型SW1990细胞,12和24 h后凋亡率分别为25.4%±3.65%和43.5%±5.23%,但该效应在高表达5-LOX的细胞株中明显减弱,分别为13.2%±2.01%和21.7%±3.65%.在野生型SW1990细胞培养中加入外源性LTB4(10 nmol/L)能抑制TNF-α诱导的细胞凋亡,野生型与处理组细胞24 h后凋亡率有显著性差异(47.6%±5.32%vs 18.5%±5.69%,P<0.01).用LTB4受体阻断剂处理5-LOX高表达细胞株,能恢复其对凋亡诱导的敏感性.结论:胰腺癌细胞均能表达5-LOX并产生LTB4,高表达5-LOX能抑制TNF-α诱导的胰腺癌细胞凋亡.     

雷公藤内酯醇诱导胰腺癌细胞凋亡及对5-脂氧合酶和凋亡基因表达的影响

目的 探讨雷公藤内酯醇(TL)在胰腺癌化学预防和治疗中的应用价值.方法 采用人胰腺癌细胞株SW1990作为研究对象,MTT法和吖啶橙(AO)染色分别检测SW1990细胞的增殖和凋亡,采用半定量RT-PCR法检测5-脂氧合酶(5-LOX) mRNA、bcl-2 mRNA和bax mRNA的表达.结果 10 μg/ml的TL对SW1990细胞生长的抑制率达30%以上,0.1 μg/ml TL处理24 h后,SW1990细胞凋亡指数达38.5%,显著高于对照组的14.97%.5-LOX、bcl-2、bax mRNA表达从0.7160 ± 0.0251,0.2446 ± 0.0311和0.0260 ± 0.0065分别变化为0.2400 ± 0.0316,0.0700 ± 0.0158和0.0700 ± 0.0158.结论 TL能抑制胰腺癌细胞增殖和诱导细胞凋亡,其凋亡机制可能与下调5-LOX mRNA和bcl-2 mRNA、上调bax mRNA基因表达有关.     

靶向survivin基因siRNA在食管癌细胞增殖和凋亡中作用的研究

目的 研究survivin基因特异性RNA干扰对食管癌Eca-109细胞株体外增殖能力和凋亡的影响. 方法 构建靶向survivin的小干扰RNA(siRNA)表达载体,用脂质体法转染Eca-109细胞后,采用半定量RT-PCR、Western Blot检测转染前后survivin mRNA及蛋白表达水平的改变,采用噻唑兰(MTT)法检测细胞的生长增殖情况,采用流式细胞术测定细胞的凋亡情况. 结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制Eca-109细胞survivin基因的表达.转染靶向survivin的siRNA表达质粒可以显著抑制Eca-109细胞的增殖(细胞接种24 h、48 h后增殖抑制率分别为21.05%和33.96%),诱导明显的细胞凋亡[转染24 h、48 h后的凋亡率分别为(8.03±1.05)%和(6.22±1.06)%]. 结论 survivin基因特异性RNA干扰可以显著抑制食管癌Eca-109细胞的体外增殖并诱导明显的细胞凋亡.     

5-脂氧合酶抑制TNF-α诱导的胰腺癌细胞凋亡

目的: 检测胰腺癌细胞中5-脂氧合酶(5-lipoxygenase, 5-LOX)及其代谢产物的表达情况, 分析高表达5-LOX及LTB4对胰腺癌细胞生长凋亡的影响. 方法: 体外培养人胰腺癌细胞株ASPC-1, PANC-1和SW1990, 并构建5-LOX基因稳定转染细胞株. 用RT-PCR和Western blot检测细胞5-LOX mRNA和蛋白的表达, ELISA检测细胞培养上清中LTB4的含量, 采用流式细胞仪、Annexin V/PI双染法检测TNF-alpha诱导细胞的细胞凋亡. 结果: 三种胰腺癌细胞株均表达5-LOX mRNA和蛋白, 细胞上清中也都检测到一定量LTB4分泌. 5-LOX基因稳定转染细胞株表达5-LOX和LTB4的水平上升. TNF-alpha(20 mug/L)处理野生型SW1990细胞, 12和24 h后凋亡率分别为25.4%±3.65%和43.5%±5.23%, 但该效应在高表达5-LOX的细胞株中明显减弱, 分别为13.2%±2.01%和21.7%±3.65%. 在野生型SW1990细胞培养中加入外源性LTB4(10 nmol/L)能抑制TNF-alpha诱导的细胞凋亡, 野生型与处理组细胞24 h后凋亡率有显著性差异(47.6%±5.32% vs 18.5%±5.69%, P<0.01). 用LTB4受体阻断剂处理5-LOX高表达细胞株, 能恢复其对凋亡诱导的敏感性. 结论: 胰腺癌细胞均能表达5-LOX并产生LTB4, 高表达5-LOX能抑制TNF-alpha诱导的胰腺癌细胞凋亡.     

雷公藤内酯醇诱导胰腺癌细胞凋亡及对5-脂氧合酶和凋亡基因表达的影响

目的探讨雷公藤内酯醇(TL)在胰腺癌化学预防和治疗中的应用价值。方法采用人胰腺癌细胞株SW1990作为研究对象,MTT法和吖啶橙(AO)染色分别检测SW1990细胞的增殖和凋亡,采用半定量RT-PCR法检测5-脂氧合酶(5-LOX)mRNA、bcl-2 mRNA和bax mRNA的表达。结果10μg/ml的TL对SW1990细胞生长的抑制率达30%以上,0.1μg/mlTL处理24h后,SW1990细胞凋亡指数达38.5%,显著高于对照组的14.97%。5-LOX、bcl-2、bax mRNA表达从0.7160±0.0251,0.2446±0.0311和0.0260±0.0065分别变化为0.2400±0.0316,0.0700±0.0158和0.0700±0.0158。结论TL能抑制胰腺癌细胞增殖和诱导细胞凋亡,其凋亡机制可能与下调5-LOXmRNA和bcl-2mRNA、上调bax mRNA基因表达有关。     

脂氧合酶对胰腺癌细胞增殖和凋亡的调节作用

目的观察5-脂氧合酶（LOX）及12-LOX在人胰腺癌中的表达，并初步探讨LOX的作用底物——多不饱和脂肪酸（PUFA）及LOX抑制剂对胰腺癌细胞增殖及凋亡的调节作用。方法用免疫组织（细胞）化学、逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法研究5-LOX及12-LOX在胰腺癌组织和细胞株SW1990中的表达，用四甲基偶氮唑蓝（MTT）还原法及溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记法研究不饱和脂肪酸包括花生四烯酸（AA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）以及5-LOX抑制剂MK-886和12-LOX抑制剂Baicalein对SW1990细胞增殖的影响；并用末端脱氧核苷酰转移酶介导的d-UTP-生物素缺口末端标记法（TUNEL）及流式细胞术方法研究上述物质对SW1990细胞凋亡的影响。结果5-LOX及12-LOX在胰腺癌组织和SW1990人胰腺癌细胞呈高表达，显著高于人正常胰腺组织对照。AA促进胰腺癌细胞株SW1990的增殖，且呈剂量依赖性；而DHA及EPA抑制SW1990细胞增殖，均呈剂量依赖性，DHA及EPA尚可促进SW1990细胞凋亡。MK-886及Baicalein均能抑制胰腺癌细胞株SW1990的体外增殖，并呈剂量依赖性，两者均可促进SW1990细胞凋亡，作用24h后凋亡细胞比例增高。结论5-LOX及12-LOX在胰腺癌中表达上调，PUFA对胰腺癌细胞增殖与凋亡存在调节作用，并且不同脂肪酸作用存在差异。从促进胰腺癌细胞增殖，而DHA及EPA抑制其增殖，促进其凋亡。LOX抑制剂体外可抑制胰腺癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡。LOX可能是胰腺癌生物化学治疗的新靶点。     

SMO基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对胰腺癌细胞SMO基因表达的影响

目的:Hegdehog信号通路在胰腺癌发生发展过程中发挥着重要的作用,针对其调控机制的研究将对胰腺癌发病机制的阐明奠定良好的理论基础.构建携带SMO靶向si RNA慢病毒表达载体,并证实其对胰腺癌细胞中SMO基因表达的抑制作用.方法:设计并合成3条SMO基因靶向si RNA片段,利用基因重组技术构建携带此3条片段的慢病毒表达载体并测定其滴度,构建好的慢病毒表达载体转染人胰腺癌细胞株SW1990后,采用RT-PCR法检测SMO基因的表达以筛选出效果最佳的干扰表达载体,并以此载体转染SW1990细胞后采用Western blot法检测SMO蛋白表达.结果:基因测序与酶切电泳结果提示成功合成SMO靶向siRNA片段且其正确插入慢病毒表达载体,无碱基缺失错排与突变,测定病毒滴度分别为5.31×10~8TU/m L,1.49×10~9TU/m L及8.50×10~8TU/m L,经转染SW1990细胞后,测定对SMO基因表达的抑制率分别为86.00%、74.85%及19.22%,效果最优的干扰表达载体转染SW1990细胞后对SMO蛋白表达的抑制率80%.结论:成功构建携带SMO基因靶向si RNA的慢病毒表达载体,且该载体可有效抑制胰腺癌细胞中SMO基因的表达,为进一步的研究提供了良好的实验工具.     

TMPRSS4基因沉默对胰腺癌SW1990细胞生长及侵袭的影响

目的 观察TMPRSS4基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞体外生长增殖和侵袭的影响.方法 体外合成4个靶向TMPRSS4基因和阴性对照的真核表达载体,瞬时转染到SW1990细胞,实时定量PCR法检测转染细胞的TMPRSS4 mRNA表达.以干扰效率最高的真核表达载体转染SW1990细胞,G418筛选出稳定的TMPRSS4基因沉默的细胞株,蛋白质印迹法检测稳定细胞株TMPRSS4蛋白抑制效率,CCK-8法检测细胞生长抑制率,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 成功构建了稳定下调TMPRSS4表达的细胞株SW1990/psi-TMPRSS4,细胞转染效率为82.9%.与亲本SW1990细胞比较,TMPRSS4 mRNA和蛋白水平分别下调了80.1%、60%.SW1990/psi-TMPRSS4组穿膜细胞数为(118.6±13.4)个,显著低于阴性对照组的(157.4±12.9)个和亲本细胞组的(157.0±9.5)个(P值均<0.01).SW1990/psi-TMPRSS4组细胞的侵袭抑制率为24.5%.但各组细胞增殖无明显变化.结论 成功筛选出稳定下调TMPRSS4表达的细胞株.下调TMPRSS4表达能有效抑制胰腺癌SW1990细胞的侵袭能力,但对细胞增殖无影响.