牵张应变诱导人牙周膜细胞晚期凋亡的实验研究

目的研究机械牵张应变对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,HPDLCs）晚期凋亡的影响。方法体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置对HPDLCs加载1%、10%和20%的动态牵张应变6、12、24和48 h,通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜对经过TUNEL染色的细胞进行晚期凋亡检测。采用SPSS 11.0软件包对数据进行统计学分析。结果HPDLCs加载后,呈现栅栏状相互平行排列趋势,排列方向垂直于牵张力方向。各应变组细胞的晚期凋亡率在加载24 h时达到该应变组的峰值,且具有一定时间和应变依赖性。结论通过动态机械应变细胞加载装置对人牙周膜细胞的牵张加载,发现牵张应变可以诱导细胞发生晚期凋亡,具有时间和应变值依赖性,24 h时晚期凋亡率达到峰值。     

Bcl-2和Bax在牵张应变诱导HPDLCs凋亡中的表达研究

目的：研究牵张应变诱导人牙周膜细胞（HPDLCs）凋亡过程中细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达变化情况。方法：体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置对HPDLCs加载20%动态牵张应变24h,通过real-time PCR检测Bcl-2和Bax在mRNA水平上的表达差异。结果：HPDLCs加载后,呈现栅栏状相互平行排列趋势,排列方向垂直于牵张力方向。Bcl-2和Bax基因表达显著增加,Bcl-2/Bax比值显著下降,有明显统计学意义（P〈0.05）。结论：牵张应变诱导人牙周膜细胞凋亡过程中,Bcl-2家族起到了重要作用。     

机械牵张应变对人牙周膜细胞内游离钙离子浓度的影响

目的:观察机械牵张应变作用下,人牙周膜细胞(HPDLCs)内游离Ca2 浓度的变化。方法:体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置,对1%、10%和20%应变组的细胞分别进行30、60和120min的动态牵张加载,通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞内游离Ca2 浓度的变化,并应用SPSS13.0软件包对数据进行方差分析。结果:当HPDLCs加载30min时,各组检测到的胞内游离Ca2 浓度与对照组无显著差异(P>0.05);60min时,各个应变组的胞内Ca2 浓度明显升高,与对照组相比均有非常显著的差异(P<0.01);加载时间延长到120min时,各组Ca2 浓度又降至对照组水平(P>0.05)。结论:机械牵张应变可通过钙离子信号系统影响HPDLCs的生物学活性。     

牵张应变对人牙周膜细胞内磷脂酶C-γ1水平的影响

目的：观察在机械牵张应变作用下,人牙周膜细胞（HPDLCs）内磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）水平的变化。方法：通过原代和传代培养,获得性状稳定的HPDLCs,使用动态机械应变细胞加载仪对细胞进行1％、10％和20％动态牵张应变加载。加载于不同的时间段,通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行PLC-γ1水平的检测。应用SPSS13．0软件对数据进行方差分析。结果：使用流式细胞仪对细胞内PLC-γ1水平检测发现：加载初期,细胞内的PLC-γ1水平维持在较低水平,随着牵张应变加载时间的延长,牙周膜细胞内PLC-γ1水平逐渐升高。50min时PLC-γ1水平达到了各个应变组的最高值（P〈0．01）。随着加载时间的继续延长,60min时各应变组的PLC-γ1水平都有所下降（P〈0．01）。激光扫描共聚焦显微镜检测发现：对照组和动态加载组都有PLC-γ1的表达,但加载50min组表达相对较强。结论：机械牵张应变可以引起HPDLCs内PLC-γ1水平的变化。     

不同牵张力对成骨细胞增殖与合成功能的影响

目的:观察周期性牵张应变对成骨细胞增殖与合成功能的影响。方法:体外分离和培养新生大鼠颅顶骨成骨细胞,应用Flexcell 4000TM加力系统施加力学刺激,频率为0.5 Hz,牵张应变大小分别为1.5%、3%、6%及9%,作用时间分别为12、24及48 h。检测成骨细胞的增殖以及合成功能的变化。采用SAS 8.0软件包对结果进行统计分析。结果:①1.5%、3%的牵张应变可以促进成骨细胞I型胶原、骨钙素和总蛋白的分泌量增加,以3%牵张应变增加最为明显。同时,在3%牵张应变的初期可以促进成骨细胞的增殖,而促进成骨细胞的分化成熟的作用大于促进增殖的作用;②6%牵张应变下,成骨细胞骨钙素、I型胶原和总蛋白的分泌量减少,但在6%牵张应变作用的各时间段均使细胞增殖活性明显增高;③9%牵张应变下,成骨细胞增殖和分化功能均受抑制。结论:适度的牵张应变可促进成骨细胞的生长,较小的牵张应变促进分化成熟的作用较明显,较大的牵张应变促进增殖的作用较明显,但过大的牵张应变对细胞的增殖和分化均有抑制。     

周期性张应变对人牙周膜细胞迁移的影响

目的 探讨周期性张应变对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLC)迁移的影响及其相关机制,为进一步了解机械力对hPDLC功能的影响提供资料.方法 应用FX-4000T细胞应变加载系统,对体外培养的hPDLC施加周期性张应变,牵张幅度分别为10%和20%,加载时间为6 h和24 h,频率均为0.1 Hz,以未加载的静态细胞作为对照组,应用划痕法观察hPDLC的迁移,蛋白质印迹法检测hPDLC的基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)的表达变化;用细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的特异性抑制剂PD98059预处理hPDLC后,在0.1 Hz、10%幅度条件下,加载6 h,检测细胞p-ERK1/2和MMP-9表达的变化.用细胞迁移划痕法观察加载10%和20%幅度张应变,观察24 h后PD98059和MMP家族的抑制剂强力霉素(doxycycline,DOX)对hPDLC迁移的影响.结果 细胞迁移划痕实验结果显示,牵张幅度和加载时间均可显著促进细胞迁移.与静态组相比,施加牵张幅度分别为10%和20%的张应变6 h后,hPDLC迁移变化不明显,但加载24 h后,10%和20%幅度的张应变均显著促进了hPDLC迁移(P<0.05),细胞迁移率分别为(45 ±8)%和(66±14)%,且20%比10%幅度牵张对细胞迁移的促进作用更显著(P<0.05).蛋白印迹法结果显示,周期性张应变促进了hPDLC的MMP-9表达.牵张幅度对细胞MMP-9的表达有显著影响(P<0.05),但加载时间对细胞MMP-9的表达无显著影响.ERK1/2的抑制剂PD98059不仅可以明显抑制张应变诱导的p-ERK1/2活化,而且可通过ERK信号通路明显抑制张应变诱导的细胞MMP-9表达.细胞迁移划痕实验还证实,加载幅度分别10%和20%的张应变24 h后,抑制剂PD98059和DOX均能有效抑制周期性张应变诱导的hPDLC迁移.结论 周期性张应变可通过激活hPDLC的ERK信号通路,促进细胞的MMP-9表达,从而诱导体外培养的hPDLC迁移.     

牵张应变作用下人牙周膜细胞形态及钙离子浓度变化的实验研究

目的：观察机械牵张应变作用下,人牙周膜细胞（HPDLCs）形态及游离Ca2＋浓度的变化。方法：通过原代和传代培养获得性状稳定的人牙周膜细胞,使用动态机械应变细胞加载仪对细胞进行1%、10%和20%动态牵张应变加载,并加载不同时间,通过流式细胞仪对细胞进行Ca2＋浓度的检测。应用SPSS13.0软件对数据进行方差分析。结果：细胞内游离Ca2＋浓度随牵张应变时间的延长逐渐升高,至60min时达到该组的峰值（P〈0.01）;以后随加载时间的延长逐渐下降,120min时降至对照组水平（P〉0.05）。结论：牵张应变可以引起细胞形态的改变和细胞内游离Ca2＋浓度的变化。     

静态牵张应变对人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响

目的:探讨牵张应变对体外培养的人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响。方法:牵张应变量设为0%、8%、13%、18%、23%共5组,每组分别加载1 h8、h、16 h、24 h后收集细胞,免疫组化检测细胞中COX-2的表达,灰度分析并进行统计学处理。结果:8%~18%牵张应变范围,细胞内COX-2表达随着加载时间和应变量的增高而增强,23%应变量作用下COX-2表达降低,且与加载时间无关联。结论:在细胞的生理应变范围(8%、13%、18%)内,静态牵张应变促进人牙周膜成纤维细胞COX-2的表达,当牵张应变量超过生理应变范围(23%),则COX-2的表达量降低。     

牵张应变作用下人牙周膜细胞内磷脂酶C-γ1水平的变化

目的:观察机械牵张应变作用下,人牙周膜细胞(HPDLCs)内磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)水平的变化。方法:通过原代和传代培养,获得性状稳定的人牙周膜细胞,使用动态机械应变细胞加载仪对细胞进行1%、10%和20%动态牵张应变加载。加载不同时间,通过流式细胞仪对细胞进行PLC-γ1水平检测。采用SPSS13.0软件包对数据进行方差分析。结果:在加载牵张应变初期,细胞内的PLC-γ1水平维持较低水平;随着牵张应变加载时间的延长,牙周膜细胞内的PLC-γ1水平逐渐升高。50min时,PLC-γ1水平达到各应变组的最高值(P<0.01)。随着加载时间的继续延长,60min时,各应变组的PLC-γ1水平都显著下降(P<0.01)。结论:牵张应变可引起细胞内PLC-γ1水平的变化。     

人牙周膜成纤维细胞的培养及牵张应变诱导凋亡研究

目的:探讨人牙周膜成纤维细胞的分离、培养及在牵张应变作用下发生早期凋亡的情况。方法:刮取健康人前磨牙牙周膜,进行牙周膜成纤维细胞的分离、培养及生长曲线描绘。经3～4代传代培养后,对细胞加载1%～20%的牵张应变,加载时间分别为30min,1h、6h、12h然后通过流式细胞仪检测Annexin V-FITC(异硫氰酸荧光素)及激光扫描共聚焦显微镜进行细胞的早期凋亡鉴定。结果:人牙周膜成纤维细胞传代到12代以后,细胞逐渐呈衰老生状,胞体变大,细胞生长缓慢。人牙周膜成纤维细胞的凋亡率在30min组低于对照组,但两者间无统计学差异。在6h内,人牙周膜成纤维细胞的凋亡情况随加载时间和加载应力的增加而增加(P<0.05)。在12h时所有组的细胞凋亡均减少。结论:人牙周膜成纤维细胞的使用最好在12代以内,尤其是3～4代细胞的活力、增殖能力较好。牵张应变可以诱导细胞发生早期凋亡。     

Cyclic stretching force induces apoptosis in human periodontal ligament cells via caspase-9

The response of periodontal ligament (PDL) cells to mechanical stimulation is important in the periodontal tissue remodelling. Our previous study showed that cyclic stretching force on PDL cells induced early apoptosis. However, the mechanism of stretching force-induced cell death is unclear. In the present study, we examined whether PDL cells undergo apoptosis by stretching force using the terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP-biotin nick-end-labellling method (TUNEL) and investigated the mechanism by which cyclic stretching force initiated apoptosis. We found that PDL cells became aligned regularly and the number of apoptotic cells increased significantly in a time-and force-dependent manner after the application of cyclic stretching force. Caspase-3 activity increased in proportion to the magnitude of the stretching force, and this effect was reduced significantly by a caspase-9 inhibitor, whereas a caspase-8 inhibitor had no such effect. We therefore concluded that the in vitro application of cyclic stretching force can induce apoptosis in PDL cells by activating the caspase-3 via the caspase-9 signalling cascade. Our findings may provide a novel insight into the mechanism of apoptosis induced by stretching force in PDL cells.     

机械力作用下人牙周膜细胞Osterix mRNA和蛋白的表达

目的研究在机械力作用下人牙周膜细胞内Osterix（Osx）mRNA和蛋白的表达变化,探讨Osx与正畸牙周组织骨改建的关系。方法组织块法培养人牙周膜细胞,采用离心加力装置对细胞分别加载1、2、4、6、8、12 h的机械力。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot及细胞免疫荧光化学技术分别检测不同时间点Osx mRNA和蛋白的表达变化及其细胞定位。结果在正常人牙周膜细胞中,Osx mRNA表达微弱,蛋白未见表达;在机械力加载4 h后,Osx mRNA表达开始明显增强（P<0.01）,蛋白呈现弱表达（P<0.05）;加载8 h时,Osx mRNA和蛋白表达显著增强（P<0.01）;持续增加至加力12 h。同时,加力4 h后,少量细胞的胞质内开始呈现微弱的绿色荧光;12 h后,阳性表达主要集中在胞核内。结论机械力可诱导人牙周膜细胞Osx表达增强及活化。Osx可能参与了细胞内生物力学信号的转导,从而可能在正畸牙周组织的骨改建过程中发挥着重要作用。     

Compressive force induces osteoblast apoptosis via caspase-8

Periodontal remodeling during orthodontic tooth movement is a result of mechanical stresses. The application of excessive orthodontic force induces cell death. However, the nature of compressive force-induced cell death is unclear. We examined whether the in vitro application of continuous compressive force would induce apoptosis in human osteoblast-like cells (MG-63 cells), and investigated the mechanism by which apoptosis was initiated. The cells became aligned irregularly, and cell viability decreased, indicating that the compressive force caused cell death. According to the TUNEL analysis, the number of apoptotic cells increased significantly in a time-and force-dependent manner. Caspase-3 activity increased with the magnitude of the compressive force, and this effect was reduced significantly by a caspase-8 inhibitor, whereas a caspase-9 inhibitor had no such effect. We conclude that the in vitro application of compressive force can induce apoptosis in MG-63 cells through the activation of caspase-3 via the caspase-8 signaling cascade.     

Cyclic stretching force-induced early apoptosis in human periodontal ligament cells

Objective:  Human periodontal ligament (PDL) cells occur changes in morphology and express relative protein by stretching force. However, whether stretching force, especially excessive stretching force, induces PDL cell apoptosis is not yet clearly understood. In the present study we investigated the relationship between early apoptosis and stretching force in human PDL cells in vitro.
Materials and methods:  The human PDL cells were obtained from healthy premolars. After three to five passages, the cells were stretched by strain 1%, 10% and 20% for 30 min, 1 h, 6 h and 12 h, then early apoptosis were detected through annexin fluorescein isothiocyanate (V-FITC) binding by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy.
Results:  The experiments indicated that human PDL apoptotic cells in the early stage increased in a time- and force-dependent manner in response to stretching strain within 6 h, and then apoptosis decreased at 12 h. Human PDL cells which stretched inclined parallel to each other and aligned their long axis perpendicular to the stretching force vector, but in the centre of the disc, cells showed minimal deformation and unidirectional alignment of PDL cells.
Conclusion:  The overall results suggested that stretching force not only influenced morphology but also induced early apoptosis in human PDL cells.     

牵张应变作用下人牙周膜细胞内磷脂酶C-γ1水平变化的实验研究

目的 观察人牙周膜细胞（HPDLCs）内磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）水平在机械牵张应变作用下的变化.方法 通过原代和传代培养,获得性状稳定的人牙周膜细胞,使用动态机械应变细胞加载仪对细胞进行1％、10％和20％动态牵张应变加载.并于加载后10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min,通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内PLC-γ1水平的变化.应用SPSS13.0软件包对数据进行统计分析.结果 流式细胞仪检测发现：加载初期,细胞内的PLC-γ1水平维持在较低水平,随着牵张应变加载时间的延长,牙周膜细胞内PLC-Y 1水平逐渐升高.50 min时PLC-Y 1水平达到了各个应变组的最高值（P＜0.01）,60 min时各应变组的PLC-γ1水平都有所下降（P.＜0.01）.激光扫描共聚焦显微镜检测发现：各组都有PLC-γ1的表达,其中50 min加载组表达相对较强.结论 机械牵张应变可以引起人牙周膜细胞内PLC-γ1表达量发生改变.     

凋亡蛋白酶依赖性凋亡途径在晚期糖基化终产物诱导人牙龈成纤维细胞凋亡中的作用

目的 观察晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGF)凋亡的诱导作用,同时通过检测胱天蛋白酶(caspase)-8,9,3酶活性改变及caspase抑制剂对凋亡作用的影响,探讨凋亡蛋白酶依赖性凋亡途径在AGE诱导HGF凋亡过程中的作用.方法 将AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-human serum albumin,AGE-HAS)与HGF共培养(以不加AGE-HAS的HGF为空白对照组),利用酶标仪分别测定12、24h后caspase-8,9,3酶活性的变化;分别添加caspase-8,9,3及caspase-8 +caspase-9抑制剂后(分别为caspase-8,9,3及caspase-8+ caspase-9抑制剂组,不添加caspase抑制剂的为阳性对照组),检测24h后Hoechst33258染色及膜联蛋白V-碘化丙啶双染检测细胞凋亡率,酶标仪测定caspase-3酶活性的变化.结果 caspase酶活性检测结果表明:HGF与AGE-HAS共培养后,caspase-8,9,3的酶活性分别为0.1097±0.0051、0.0965±0.0051及0.1280±0.0103,共培养24h后酶活性分别为0.1558±0.0053、0.1308±0.0035及0.1954±0.0051,组间差异均有统计学意义(P＜0.05);Hoechst33258染色结果显示caspase-9抑制剂组、caspase-8抑制剂组、caspase-8+ caspase-9抑制剂组、caspase-3抑制剂组阳性细胞数分别为(247.7±32.4)、(200.1±14.6)、(154.1±14.4)及(131.3±14.6)个,与阳性对照组[ (350.4±20.0)个]间差异均有统计学意义(P＜0.05);膜联蛋白V-碘化丙啶双染结果显示,caspase-9抑制剂组、caspase-8抑制剂组、caspase-8+ caspase-9抑制剂组及caspase-3抑制剂组凋亡率分别为(38.87±3.31)％、( 25.57±2.20)％、(17.17±2.24)％和(14.73±2.48)％,与空白对照组及阳性对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);caspase-3酶活性在caspase-8、caspase-9及caspase-8+caspase-9抑制剂组分别为0.1274±0.0076、0.1465±0.0062、0.1044±0.0051,组间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 AGE-HAS主要通过激活caspase依赖性凋亡途径诱导HGF凋亡;其中死亡受体途径可能在凋亡过程中占主导地位.     

周期性机械应力诱导的自噬抑制caspase通路依赖的成肌细胞凋亡

目的 观察大鼠成肌细胞（L6 myoblast,L6）在周期性机械应力作用下细胞凋亡与自噬的水平变化,探讨机械应力诱导的细胞自噬对凋亡的作用。方法 构建大鼠成肌细胞力学刺激模型,加载参数为细胞拉伸形变率15%,加力周期包括 3 s 拉伸及 3 s 舒张,加力时间为 6、12、24 h,以不加力0 h组为对照组。通过Hoechst染色及AnnexinV-FITC/PI染色观察各组细胞凋亡情况;通过MDC染色及透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）评价各组细胞自噬变化;应用 Western 免疫印迹检测各组凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax及自噬相关蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62表达变化。加入自噬抑制剂3-MA后重复实验,检测各组细胞凋亡情况。采用 SPSS 17.0 软件包对数据进行统计学分析。结果 Hoechst染色及AnnexinV-FITC/PI流式结果表明,大鼠成肌细胞在周期性应力诱导下发生凋亡,24 h 时达到凋亡最大值。Western 免疫印迹结果显示,凋亡相关蛋白表达水平随加力时间延长而逐渐升高, caspase抑制剂z-VAD-fmk有效抑制应力诱导的细胞凋亡。MDC染色及TEM扫描电镜显示,大鼠成肌细胞在周期性应力诱导下发生自噬,24 h细胞自噬达到最大值。Western 免疫印迹结果显示,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ随加力时间延长而升高,P62的表达随着加力时间延长而降低。加入自噬抑制剂3-MA后重复试验,发现应力诱导的成肌细胞凋亡被明显抑制。结论 周期性机械应力诱导大鼠成肌细胞发生自噬与caspase通路依赖的细胞凋亡,细胞自噬作为一种代偿机制,保护性地抑制应力诱导的细胞凋亡。     

依那西普对牙龈卟啉菌内毒素作用下原代培养牙周膜细胞影响的实验研究

目的　观察依那西普（Etanercept）对牙龈卟啉菌内毒素（lipopolysaccharide,LPS)作用下体外培养的人牙周膜细胞(HPDLCs)的增殖能力的影响。方法　体外原代培养人牙周膜细胞,经免疫细胞化学鉴定,加入LPS和1 μg/ml Etanercept+LPS,LPS浓度分别为10、50、100、200、300 μg/ml检测（吸光度）A值。采用MTT法测定细胞增殖能力。结果　 人牙周膜细胞原代细胞生长状态良好。第3代细胞进行鉴定,Vimentin染色呈阳性,Ck(pan)染色呈阴性。MTT法检测加入梯度浓度的LPS 24 h后,HPDLCs增殖率随着LPS浓度的增加,对HPDLCs的增殖抑制逐渐增强,200 μg/ml LPS能最大程度抑制HPDLCS的增殖,抑制率为46.21%(P<0.01)。Etanercept + LPS组对HPDLCs细胞作用相对增殖率与LPS组比较（P＜0.01）,能明显抑制LPS对HPDLCs的抑制作用。结论　TNF-α抑制剂Etanercept能明显抑制牙周膜细胞在内毒素刺激下的死亡。