皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建

提取采自甘肃玛曲皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出皮蝇素A(Hypodermin A,HA)基因片段,用Xho Ⅰ、Xba Ⅰ消化,将消化后的目的基因HA纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的裁体pPICZa连接并转化,获得重组表达质粒pPICZa-HA,经PCR、酶切、测序表明,目的基因插入位置、方向和阅读框正确.     

毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白

建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A（Hypodermotin A，HA）的技术，并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒pPIC9k上，构建了重组转移质粒pPIC9k—HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后，用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含0．5％甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白，培养3d后收取上清，用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS—PAGE检测，所表达的蛋白相对分子质量约为30000。Western—blotting表明，该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示，该蛋白具有酶活性。单因素改变表达条件的结果表明，甲醇浓度在0．5％～1％、溶氧量在70％以上、诱导2～3d的情况下表达产量最高，达1500mg／L左右。该研究结果对防治牛皮蝇蛆痛疫苗的深入研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用有一定价值。     

用阴离子交换层析纯化牛皮蝇素A蛋白的研究

建立了用阴离子交换层析AKTAFPLC纯化果蝇S2细胞分泌的重组牛皮蝇素A(Hypodermotin A，HA)的方法。将诱导培养3天的S2细胞上清液浓缩后，经25mMpH8.5Tris-HCl缓冲液透析，在MonoQ柱上以Tris-HCl NaCl为流动相进行分离。在检测波长280nm处获得蛋白峰。经SDS-PAGE分析，第一峰的分子量与原重组蛋白HA分子量相符，并对明胶大分子具有酶活性；用斑点免疫金渗滤法检测证实对牛皮蝇抗体具有免疫原性。用阴离子交换层析纯化HA的方法具有获得的蛋白质纯度高、操作简便、生产效率高等特点。     

黄牛牛皮蝇病防治试验

近几年,青海省民和县养牛业得到了迅速发展,但寄生虫病的流行也较严重（特别是牛皮蝇）,为给黄牛寄生虫病的防治提供有关科学依据,我们于2007年10月～2008年5月,对民和县黄牛牛皮蝇病进行了防治试验。     

皮蝇素A基因DNA疫苗的构建及其免疫特性研究

本研究以实验室保存的原核表达载体pET-HA为模板,PCR扩增皮蝇素A(HA)基因,将克隆基因插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中构建DNA疫苗pcDNA-HA。构建的DNA疫苗pcDNA-HA和空载体pcDNA3.1(+)体外转染小鼠胎儿成纤维细胞,间接免疫荧光试验检测细胞内目的基因的表达。将pcDNA-HA、空载体pcDNA3.1(+)和PBS免疫BALB/c小鼠后,对免疫小鼠的体液免疫水平进行了检测。结果表明,构建的DNA疫苗能在小鼠胎儿成纤维细胞中表达,能被抗HA抗体识别,可诱导小鼠产生特异性体液免疫反应,说明HA可作为牛皮蝇蛆病的候选疫苗抗原。本研究为牛皮蝇蛆病的DNA疫苗研究奠定了基础。     

不同免疫程序对猪瘟免疫效果的影响试验

为探讨不同免疫程序对猪瘟免疫效果的影响,随机选择大长母猪5头,从每头母猪所产仔猪中各选健康仔猪6头,共30头,每头母猪各选所产仔猪1头组成1组,共分5组,每组6头。A1、A2组,30日龄首免,50日龄二免;B1、B2组,40日龄首免,60日龄二免;C1、C2组,50日龄首免,70日龄二免。经试验,采用30日龄首免,50日龄二免,180日龄免疫抗体保护力仅为75%,已低于80%的技术要求;50日龄首免,70日龄二免,则在50日龄首免时,免疫抗体的有效保护力已降至80%;40日龄首免,60日龄二免,80日龄、110日龄和180日龄测定,免疫抗体的有效保护率均在80%~100%,故从新昌县养猪生产的实际情况出发,采用40日龄首免,60日龄二免程序较为适宜。     

猪瘟免疫和抗体消长规律的跟踪试验

猪瘟是我国养猪业的主要传染病之一 ,具有传染性强、流行广、发病率和死亡率高等特点 ,是我国目前进行强制免疫的主要传染病之一。我国生产的猪瘟弱毒疫苗享誉国内外 ,为世界上许多国家消灭和控制猪瘟起了重要作用。近年来 ,我国某些地区出现了以温和型为主的猪瘟 ,本市在抗体监测过程中同样发现猪瘟抗体水平低下现象。本文通过抗体跟踪监测和不同剂量比较试验等 ,系统地反映猪瘟免疫注射后抗体的消长规律和免疫效果。1　材料和方法1 .1　材料猪瘟阳性血清 (中国农科院兰州兽医研究所 ,批号 :2 0 0 10 80 9、2 0 0 2 0 4 30 )。猪瘟阴性血清…     

策勒县家禽禽流感免疫后抗体消长规律研究

以笼养、散养为试验对象,利用禽流感凝集抑制反应,研究分析在禽流感疫苗免疫后散养鸡和笼养鸡两组抗体产生的时间、抗体峰值、免疫保护期及其他因素影响等方面的规律。     

轮状病毒和大肠杆菌不同免疫方式免疫奶牛乳中抗体消长规律的研究

以引起婴儿腹泻的轮状病毒RV和大肠杆菌E.coli免疫妊娠后期的奶牛，使之产生抗这两种病原的抗体。免疫方式分为两种：一种是分别用E.coli和RV作免疫原免疫奶牛，另一种以两者同时免疫奶牛。然后定期采乳，分别以试管凝集反应和反应间接血凝抑制试验检测大肠杆菌抗体和轮状病毒抗体，并比较这两种不同免疫方式免疫奶牛乳中抗体的消长规律。试验结果表明：单独以大肠杆菌或轮状病毒作免疫原与这两者同时作免疫原，免疫奶牛乳中抗体消长规律相似，抗体效价也相近，且均可维持近两个月。     

禽流感疫苗免疫肉种鸡效果对比试验

为在实际生产过程中准确把握不同厂家禽流感疫苗是否会因为生产工艺和油佐剂的不同而造成免疫后抗体消长规律和离散度的不同,我们设计了本试验,为详尽了解疫苗实际应用中的抗体水平,及时补免确保家禽安全生产提供指导.     

牛皮蝇Hypodermin A基因在大肠杆菌中的表达

从牛皮蝇Ⅱ期幼虫中提取总RNA,进行RT-PCR扩增牛皮蝇Hypodermin A基因.将扩增基因进行克隆测序,构建原核表达栽体pET30-HA,转化大肠杆菌BL21(DE3).用IPTG诱导表达,得到表达量达到全菌蛋白35%以上的特异性蛋白.SDS-PAGE分析表明,表达产物大部分以包涵体形式存在.Western-blot检测结果表明,获得的重组蛋白为重组Hypodermin A,具有较好的免疫活性.     

皮蝇素A基因的克隆与序列分析

首先提取采自甘肃玛曲的皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出Hypodermin A(HA)基因片段,将此片段与PGEM-T Easy载体连接,构建克隆载体PGEM-HA,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,进行测序与分析。结果表明,扩增的HA基因长678bp,编码229氨基酸。克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登陆的皮蝇HA基因序列核甘酸同源性为96.6%,推导氨基酸同源性达97.8%。该基因的成功克隆为其进一步表达打下了坚实的基础。     

牛皮蝇HA抗原基因转化紫花苜蓿的研究

以“甘农1号”紫花苜蓿(Medicago sativa)7 d苗龄子叶和下胚轴为受体材料,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系,筛选出MS+2,4 D 2.0 mg/L+6 BA 0.5 mg/L和MS+6 BA 0.5 mg/L+NAA 0.03 mg/L+GA3 2.0 mg/L为苜蓿子叶愈伤组织诱导和分化的适宜培养基;探讨了农杆菌浓度OD600约0.5、感染时间8~10 min、共培养时间2 d为适宜的转化条件。采用农杆菌介导法将Hyperdomin A（HA）基因导入紫花苜蓿,经PCR检测和Southern分子杂交分析,结果表明HA基因已经整合到苜蓿基因组中,可为牛皮蝇蛆病可食性疫苗的研究提供理论基础。     

皮蝇Hypodermin A基因的克隆及表达质粒构建

参照牛皮蝇HypoderminA(HA)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以皮蝇总RNA为模板进行RT--PCR扩增牛皮蝇HA基因,将扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,所克隆获得的基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.2%和99.3%。同时,将该基因与表达载体PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

将牛病毒性腹泻病毒(BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2.重组质粒pPIC9K-sE2经Sal Ⅰ酶切线性化,电穿孔导入P.Pastoris GS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.Pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2.经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性.免疫原性研究证明P.Pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生特异抗体.     

表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，用设计带有限制性酶切位点的特异地扩增子人起始密码子开始的１．８ｋｂ新城疫病毒（ＮＤＶ）血凝素－神经氨酸（ＨＮ）基因开放式阅读框（ＯＲＦ），然后插入ｐＴＫ２Ｂ的Ｎｂｅ１位点，构建了含ＮＤＶＨＮ基因的插入载体ＰＴＫＨＮ１和ＰＴＫＨＮ２，将其与感染火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）细胞的总ＤＮＡ共转民纤维细胞（ＣＥＦ），经有限稀释法和Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ筛选，得到含有ＨＮ基因的重组体ｒＨ     

Development of enzyme immunoassay for chromogranin A (CgA) and profiling of plasma CgA concentrations in the cow

The objectives of this study were to establish and characterize a homologous immunoassay for bovine chromogranin A (bCgA) and to profile plasma bCgA concentrations during early pregnancies. We synthesized oligopeptide corresponding to the amino acid sequence 341–355 of bCgA for immunizing rabbits and peptide corresponding to the amino acid sequence 336–365 of bCgA for both a biotinylated tracer and reference standards. Recombinant bCgA protein was also generated in Escherichia coli lysate. Dose-dependent displacement curves were obtained from 1 to 1,000 nM of the reference standards. The displacement curves showed a good relationship between the reference standards of the synthetic peptide and the serially diluted plasma sample or recombinant bCgA protein generated in the present study. The assay sensitivity defined as the value of two standard deviations below the zero standard was calculated as 0.46 nM. The intraassay and interassay coefficients of variation were 6.48% and 13.4%, respectively. Changes in the plasma bCgA concentrations in early pregnancies undulated in nonpregnant animals. The results of the present study suggest that assaying plasma bCgA concentrations could be utilized as measures to evaluate the physiological status of cattle.     

新城疫病毒弱毒骨架表达强毒F基因的重组病毒生物学特性研究

为了解目前中国新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）优势基因VIId型的毒力机制,应用反向遗传技术将我国优势流行基因VIId型强毒株I4的F基因替换弱毒LX的F基因,获得表达NDV强毒株I4F基因的重组病毒NDV/LX-If。测定重组病毒的致病指数和组织分布,结果发现,重组病毒NDV/LX-If毒力比骨架病毒有了显著的提高。NDV/LX-If的鸡胚平均致死时间（mean death time,MDT）为56 h,雏鸡脑内接种致病指数（intracebral pathogenicity index,ICPI）为1.49,属于中等毒力,毒力比亲本病毒毒力低,但都能使自然途径感染的鸡100%死亡,同时获得了亲本毒株的组织嗜性。可见,新城疫病毒F基因是毒力和组织嗜性的主要决定因素,但是其它基因对新城疫病毒的毒力也可以产生影响。