草莓轻型黄边病毒CP基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆草莓轻型黄边病毒CP基因,并构建其原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达CP蛋白。利用SMYEV的检测引物,通过RT-PCR技术筛选带SMYEV的草莓植株;根据NCBI中SMYEV序列设计扩增CP基因全长引物,通过RT-PCR获得SMYEV沈阳分离物CP基因全长序列;将CP基因克隆到原核表达pGEX-6P-1上,利用IPTG诱导CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白。利用RT-PCR扩增获得SMYEV分离物SY05的CP基因全长序列,由729个核苷酸组成,编码242个氨基酸残基。SY05与其他SMYEV分离物的核苷酸同源性为80.1%～97.4%,氨基酸同源性为92.1%～99.6%,其中,与SMYEV分离物SY03的氨基酸一致性为98.3%。将SY05的CP基因成功克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建了重组表达载体p6P-EV-CP,并将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导SMYEV分离物SY05的CP基因在大肠杆菌中表达出分子量为52.0 kDa的融合蛋白。克隆出SMYEV分离物SY05的CP基因,实现了其在原核细胞中的表达,为SMYEV抗血清的制备奠定了重要基础。     

陆地棉两个同源基因GhBlind的克隆与表达分析

Blind同源基因对植物株型调控起着重要作用。本研究用同源克隆策略,在陆地棉(Gossypium hirsutum L.) 腋芽部位cDNA中克隆出2个Blind同源基因GhBlind1(GenBank登录号为HQ115643)和GhBlind2(登录号为HQ115644)。GhBlind1和GhBlind2由3个外显子和2个内含子组成,分别编码359个和262个氨基酸残基。组织特异性表达分析表明, GhBlind1在腋芽部位和茎尖分生组织部位优势表达,在根、叶、茎尖、幼嫩纤维表达,而在茎部不表达;GhBlind2在腋芽部位以及根、茎、叶片、茎尖表达,而在纤维不表达。通过重组PCR技术,构建表达载体Psuper-gus-b1和Psuper-gus-b2;应用根癌农杆菌EHA105介导转化棉花胚性愈伤组织进行瞬时表达分析。将棉花胚性愈伤组织共培养4 d后,2个表达载体转化的胚性愈伤组织中均能检测到GUS活性,但Psuper-gus-b2表达活性强于Psuper-gus-b1。对Blind同源蛋白的保守结构域比对发现,GhBlind1和GhBlind2与Blind同源蛋白的一致性分别达94%和91%。以Blind同源蛋白作为外参,结合NCBI已公开的23个棉花MYB蛋白构建系统发生树,发现GhBlind1和GhBlind2与棉花大多数MYB蛋白遗传距离较远,和Blind同源蛋白组成一个较小的分支。     

樱桃番茄Cf9基因调控元件预测及同源基因系统发育分析

为探明Cf9基因的表达调控元件和同源基因进化关系,从樱桃番茄品种京番红星中克隆了Cf9上游序列,利用PlantCARE启动子预测工具对转录起始位点上游1500 bp序列进行顺式调控元件分析。结果表明,Cf9启动子不仅含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,而且含有光响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件等。Cf9基因可能受光、水杨酸和茉莉酸甲酯等诱导表达。Cf9同源基因系统进化分析结果表明,当同源指数为0.65时,番茄、马铃薯、辣椒、烟草中含有Cf9同源基因,同源基因既包括旁系同源基因,也包括直系同源基因,分析结果也进一步说明番茄与马铃薯的亲缘关系最近,其次为辣椒、烟草。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

草莓乙烯受体FaEtr2基因植物表达载体构建

为通过转基因技术改善草莓的贮运性能,以全明星草莓为试材,克隆了与草莓成熟有关的FaEtr2基因的2个片段,并构建了该基因的反义和正义植物表达载体。根据已克隆的草莓乙烯受体FaEtr2基因序列及表达载体pBI221上的酶切位点设计2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个全明星草莓FaEtr2基因片段。两片段经双酶切消化后分别以正、反两个方向插入到植物表达载体pBI221的35 S启动子和NOS终止子之间,分别构建成All Star-FaEtr2基因的正、反义植物表达载体。     

草莓果实多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶。它是诱导许多果蔬等农产品产生酶促褐变的主要原因,同时在植物的生长发育、抗病虫害及果实品质形成等方面也起到了一定的作用。本文用RACE的方法,从草莓幼果cDNA中成功扩增出PPO基因的3′端部分序列。序列分析表明该基因片段编码424个氨基酸。与其他物种PPO核苷酸序列比较相似性为72％-80％,氨基酸相似性为82％～87％。草莓多酚氧化酶基因的成功克隆,为草莓抗褐变的研究及果实品质的改良打下了坚实的理论基础。     

森林草莓FvWRKY46基因的克隆及表达分析

WRKY转录因子在调控植物生长发育方面有重要作用,但是对于其参与草莓果实品质的影响尚不明确。本研究以森林草莓‘Hawaii4’为材料,克隆转录因子Fv WRKY46并进行生物信息学分析,利用烟草叶片瞬时转化法对FvWRKY46进行亚细胞定位,用RT-qPCR分析FvWRKY46在草莓不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明：FvWRKY46基因全长1 107 bp,共编码368个氨基酸,从森林草莓‘Hawaii4’中克隆到FvWRKY46基因,进行亚细胞定位得知FvWRKY46分布在细胞核中。RT-qPCR分析结果显示FvWRKY46在植物体内各个器官组织均有表达,但在果实中表达量最高,且表达量随着时间的延长在果实成熟期达到最大值。本研究表明,FvWRKY46基因可能参与调控草莓果实成熟的过程。     

黄毛草莓丝氨酸/苏氨酸基因FnSTPK1和启动子克隆及表达分析

为探究丝氨酸/苏氨酸基因STPK1在黄毛草莓(Fragaria nilgerrensis Schltdl.)抗炭疽病中的作用,采用RT-PCR技术从黄毛草莓中克隆了FnS TPK1基因的cDNA (GenBank登录号:MN709781)及其启动子序列(GenBank登录号:MN709783),序列分析结果表明:FnSTPK1基因开放阅读框长为1581 bp,编码526个氨基酸,包含1个STKc结构域,该基因起始密码子上游启动子pFnSTPK1序列为752bp,预测包含TATA-box、CAAT-box、激素响应元件、光响应元件、环境胁迫顺式作用元件等.同源性分析结果显示:FnSTPK1基因编码的氨基酸序列与森林草莓(Fragaria vesca)编码的氨基酸序列相似性为97.92％.RT-qPCR结果表明,黄毛草莓叶片接种胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosprioides)后,FnS PK1基因在接种后不同时间点的相对表达量均显著增加,且在接种48 h时达到最高值,为0 h的10.3倍;黄毛草莓叶片在外源喷施水杨酸(SA) 12 h时,FnSTPK1基因的相对表达量达到峰值,为0 h的2.9倍.因此,FnSTPK1可能在草莓抗炭疽病和SA诱导等过程中发挥重要的作用.本研究为进一步探究STPK1基因在野生黄毛草莓抗炭疽病中的功能提供了参考.     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因同源片段的克隆与序列分析

在盐和干旱等渗透胁迫条件下,一些植物会积累甘氨酸甜菜碱(简称甜菜碱)作为渗透调节物质,甜菜碱在植物体内由胆碱经两步氧化形成,催化这两步反应的酶分别是胆碱单氧化物酶(cholinemonooxyge-nase,CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase,BADH)。由于甜菜碱的合成途径简单,进行遗传操作方便,在诸多抗逆性基因中甜菜碱合成酶基因被看作是最有希望的胁迫抗性基因。其中,BADH基因的全长cDNA序列首先被从藜科植物菠菜(Spinaciaoleracea)中克隆到,此后人们相继以该基因为参照,研究其它植物中的BADH基因。本文作者在以菠菜BADH基因为对照研究菊科植物的BADH基因时,根据已发表BADH基因的保守区序列设计了一对PCR兼并引物,以菠菜基因组DNA为模板,采用PCR法扩增出长分别为825bp(seq1)和822bp(seq2)的两个DNA片段,经测序和序列分析,seq1与GenBank中登录的菠菜BADH基因的基因组序列(U69142)一致,其外显子区与已发表的该基因的cDNA序列(M31480)一致,seq2与U69142序列的同源性为68%,其外显子区与M31480序列的同源性为83.93%。而且,在由该核苷酸序列推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶高度保守的十肽VTLELGGKSP,说明该基因为菠菜BADH基因的同源基因。根据现有文献分析,菠菜中可能存在两个BADH的同工酶,作者所克隆基因片段所属的基因可能编码菠菜BADH的另一个同工酶。该序列已在GenBank中登录,登录号:DQ070842。     

TcLr24小麦STK类抗病基因同源片段的分离和特征分析

利用根据STK类植物抗病基因类似序列保守结构设计的引物,对TcLr24小麦叶片cDNA进行扩增,通过RT-PCR扩增得到STK类抗病基因同源片段长度811bp,开放阅读框长804bp,编码268个通读的氨基酸序列,大小29.6kDa,理论等电点6.14,该氨基酸序列与多个小麦和燕麦蛋白激酶序列高度同源,含有激酶特征结构疏水信号序列及胞外结构域。     

千代田草莓乙烯受体Etr2基因克隆及序列分析

克隆了与草莓成熟有关的乙稀受体FaEtr2基因片段,为进一步研究FaEtr2基因功能并通过基因技术改善草莓贮运性能奠定基础。以千代田草莓成熟果实中分离到的基因组DNA为模板,经PCR扩增到1条约1．0kb的特异片段,将该片段克隆到pGEM-T easy vector上经测序分析,基全长共1049bp,编号349个氨基酸残基。序列分析结果表明,该序列与Chandler-Etr2的cDNA序列同源性99％、氨基酸序列同源性为98％。     

草莓FvARF2的克隆、组织表达分析及对外源激素的响应

ARFs家族基因广泛参与植物生长发育的调控过程。为了研究草莓生长素响应因子FvARF2在草莓生长发育过程中的功能,以‘丰香’草莓为实验材料,利用RT-PCR技术克隆草莓FvARF2基因,对其序列特征进行生物信息学分析,并利用Real-time PCR技术分析了Fv ARF2在草莓不同组织(包括根,茎,叶,花,绿果, 1/2红果及红熟果)及外源激素生长素(IAA)、乙烯利(C2H4)、脱落酸(ABA)处理下的表达模式。结果表明,Fv ARF2基因开放阅读框为2 469 bp,编码822个氨基酸;预测其分子量和等电点分别为91.1 kD和6.11,具有保守的B3 DNA结合结构域和生长素响应因子保守结构域;该基因启动子区含有生长素、ABA、茉莉酸甲酯及胁迫相关的顺式作用元件。进化分析表明FvARF2与甜樱桃ARF2B基因亲缘关系最近;Real-time PCR结果表明,FvARF2基因表达量存在组织表达差异,且对外源IAA、ABA和乙烯有显著性应答反应,说明该基因可能参与了生长素、ABA和乙烯调控草莓发育的信号转导过程。本研究为后继研究草莓FvARF2的功能和作用机制作为参考依据。     

莲瓣兰大雪素FT基因克隆和系统发育分析

控制植物开花的途径有光周期现象、GA、春化途径、自主途径,在光周期途径中,CO基因促进开花通过直接上调FT和SOC1基因表达,FT(FLOWERING LOCUS T)是光周期途径植物开花时间决定关键基因,并认为FT基因表达产物可能就是长期追寻的开花刺激物质,这种开花刺激物质经过叶片到茎尖的长距离运输,最终引起茎顶端花器官分化的起始.本研究以莲瓣兰大雪素作为实验材料,用RACE方法快速地克隆全长cDNA,生物信息学分析全长eDNA为662 bp,含有编码框和3'UTR,具有完整的开放阅读框(ORF) 522 bp,编码173氨基酸的蛋白质.通过系统发育分析获得一个FT同源基因.本研究为进一步对这个基因的功能研究奠定了基础.     

高CO2浓度对稻田CO2排放影响的初步分析

大气CO2浓度升高显著增加作物生物量,从而使进入土壤的有机碳增加,这势必会影响土壤碳的稳定和积累。此项研究主要通过高CO2浓度对作物生物量的直接影响,利用δ13C技术间接地初步分析土壤呼吸CO2排放不同来源贡献的差异。研究表明,在水稻生长季,高CO2浓度降低田间CO2的排放,但不显著;种有水稻,根系对土壤总的呼吸影响主要体现在成熟期之前,且有相互消长的现象。在种有水稻的情况下抽穗期之前分解新有机质为主;高CO2浓度促进土壤原有有机质的分解,在水稻生长的中后期分解更为明显,且高N水平对老有机质的分解有促进作用。鉴于此项研究中的不足之处,将会不断得到完善。     

玉米中QM同源基因的克隆及其差异表达分析

利用cDNA-AFLP技术和5'' RACE技术在玉米自交系黄早四Ht2上分离并克隆了QM（编码核糖体蛋白L10）同源基因(命名为ZmQM)。其cDNA全长为967 bp, 开放阅读框为738 bp,。该基因编码245个氨基酸的ZmQM蛋白,分子量为27.78 kD, 等电点(pI)为10.69, 预测含蛋白酶C磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化等位点。玉米ZmQM蛋白与包括人类等l3个物种QM蛋白的同源性比较发现, 氨基酸序列相似性为66%~92%。RT-PCR分析表明, 在接种玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum) 1号小种12 h后, 黄早四Ht2中ZmQM基因表达量较黄早四中明显上调,推测ZmQM基因可能参与黄早四Ht2对玉米大斑病菌1号小种的抗性反应。     

簇毛麦新型HMW-GS的序列分析及加工品质效应鉴定

利用设计的HMW-GS特异引物,从簇毛麦TA10220中克隆到6条HMW-GS基因序列(1.0~1.7 kb, GenBank登录号为KF887414~KF887419),比普通小麦HMW-GS基因序列小,其中KF887414~KF887417为能正常表达的基因,KF887418和KF887419是编码区出现终止信号的假基因。综合推导氨基酸的序列分析以及基于编码蛋白全序列、N-端和C-端域的进化树分析,认为KF887414属于y型HMW-GS,KF887415~KF887419的氨基酸序列同时具有x和y型的结构特征。将具有完整编码区的4个基因在宿主菌Escherichia coli Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析表达的蛋白质和种子提取的HMW-GS,经Western blot进一步检测表达产物,证明蛋白质表达成功。通过His-Trap HP柱纯化表达蛋白,回收产物经SDS-PAGE分析后,低温冷冻干燥备用。将冷冻干燥的回收产物加入中国春基础面粉中,利用微量掺粉试验通过测定粉质参数来鉴定簇毛麦来源的HMW-GS对面粉品质的影响,结果表明,簇毛麦来源的4个HMW-GS对于面粉加工品质具有显著的正向效应。     

乳酸粪肠球菌的分离鉴定与系统进化分析

目的 分离鉴定一株疑似乳酸粪肠球菌;方法 通过对表型特性包括培养特性、形态学观察、生化试验等鉴定,同时结合16S rDNA系统进化分析;结果：该株革兰氏阳性菌能在10℃和45℃生长,接触酶阴性,发酵葡萄糖产酸不产气,可生长于6.5%NaCl和PH9.6的环境等,16S rDNA系统进化分析与粪肠球菌有最高同源性;结论 分离株为乳酸粪肠球菌。     

一株商品肉鸡腺胃H9N2的分离鉴定及HA基因序列分析

从30日龄商品肉鸡腺胃分离到一株具有血凝特点的病毒,经HI交叉抑制试验证实为H9N2病毒,命名A/Chicken/Shandong/KD/09,病毒对SPF鸡无致病性,IVPI为0.对其HA基因进行克隆测序,HA基因氨基酸裂解位点的基序为RSSR↓ GL,与弱毒基序一致.A/chicke/Shandon/KD/09分离...