Aspergillus niger F-01和Aspergillus niger G-1125生淀粉酶糖化酶基因启动子的克隆与比较分析

从生淀粉低产菌Aspergillus niger F-01和高产菌Aspergillus niger G-1125中克隆到生淀粉糖化酶的启动序列,这两个菌种生淀粉糖化酶基因启动子序列长分别是651bp和613bp,两个启动子都含有真核生物启动子的典型序列CCAAT和TATAAAT,通过序列比对发现,这两个启动子的同源性为84.4%。     

黑曲霉SP7-2固态发酵产生淀粉糖化酶工艺优化

实验以生淀粉糖化酶活力为考察指标,采用单因素实验结合正交设计探索SP7-2固态发酵产生淀粉糖化酶优化工艺。结果表明,麸皮为基质,复配20%(质量分数)豆饼粉,料水比1∶1. 1(g∶m L),添加0. 3%(质量分数)植酸,初始p H自然,每24 h翻抛1次,双控温培养60 h。上述条件下,30 L固态发酵罐中生淀粉糖化酶活力为7 870 U/g,是优化前的1. 31倍。该结果为生料酒曲的制备及生料酿酒提供了一定的实验数据及理论指导。     

甘薯生淀粉糖化酶菌株的分离与诱变育种

以红薯淀粉作唯一碳源的察氏培养基,从腐烂甘薯分离筛选出1株产甘薯生淀粉糖化酶能力较强的黑曲霉菌株,出发菌株发酵液粗酶的生淀粉降解酶活力为55.10 U/mL.通过紫外线诱变,突变株的粗酶活提高36.70%.再经亚硝基胍诱变,生淀粉酶活达116.84 U/mL,进一步提高34.30%.     

生淀粉糖化酶的菌种筛选及酶学研究

从自然界分离到一株高酶活性的生淀粉糖化酶菌株黑曲霉Sx。在最适产酶条件;固体培养基pH6.5,固水比1：1.6,30℃发酵24h酶活达382u/g。经纸层析鉴定酶解产物为葡萄糖。粗酶液在贮藏时,当酶液中的SDS浓度达6mg/ml时,30℃保藏10天,酶活保持不变。分析经初步分离提纯的酶的性质得：以玉米淀粉为底物时,该酶最适pH4.5,最适酶反应温度为60℃。pH4.0-7.0范围内酶活力稳定,酶具有较强的热稳定性,80℃保温1h以后,酶活力仍能保持15％。金属离子等对酶的影响为：Ag^＋、Sn^2＋对酶有强烈抑制作用;Hg^2＋、Zn^2＋、Mn^2＋、Cu^2＋有抑制作用：EDTA、Ca^2＋、Fe^2＋对酶无影响;Co^2 、K^ 有一定的激活作用。     

生淀粉糖化酶的研究

具有水解生淀粉能力的糖化酶的霉菌包括黑曲霉、泡盛曲霉、根霉、罗尔伏格菌和扣囊拟内孢霉等.分析了各种酶的特性及作用机理.并对应用于工业化糖化发酵的各个影响因素作了阐述.     

黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母中的克隆和表达

从高产糖化酶的黑曲霉的cDNA文库中筛选出糖化酶基因,并研究在毕赤酵母中的表达情况。运用RT-PCR从黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pPIC9K相连,构建重组载体,电转化毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆并进行研究。阳性克隆在MM培养基中发酵72 h和1%的甲醇的诱导的情况下,重组毕赤酵母产生的糖化酶酶活最大为15.6 U/mL。测定结果显示,其糖化酶大小为1 908 bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质。经柱分离纯化其发酵上清液后,用SDS-PAGE电泳方法,测得分子质量大约为80 ku。黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母GS115中成功得到了表达。     

酒用生淀粉糖化酶产生菌的选育及酶学性质研究

以生甘薯淀粉为唯一碳源,从霉腐甘薯中分离纯化出一株产生淀粉糖化酶(RSGA)活力高、复合酶系协同作用强的菌株SP7。经形态学初步鉴定为黑曲霉。SP7经紫外线与氯化锂复合诱变,获得优良突变株SP7-2。SP7-2固体发酵产RSGA活力为3446U/g,生料酿酒酒精度为12.5%。分析初步提纯酶的性质得出:SP7-2所产RSGA对各类大、小生淀粉均有较强的水解能力,水解产物只有葡萄糖,其底物专一性顺序为玉米淀粉>甘薯淀粉>马铃薯淀粉>大米淀粉>木薯淀粉>小麦淀粉。以生甘薯淀粉为底物,最适酶解温度和pH值分别为40℃、4.0,60℃保温1h残余酶活低于5%,pH3.5时酶活力是其最适pH值条件下的90%以上,且pH3.5时室温放置1h仍保留90%以上酶活力,表明该酶有一定的热敏感性和很好的耐酸性,具有较好的工业应用前景。     

一株高产生淀粉糖化酶菌株的筛选与研究

通过分离和筛选,得到一株分解小麦生淀粉能力较强的黑曲霉,其生产淀粉糖化酶活力为１７１．５ｕ／ｇ,α－淀粉酶活力为６．３４７ｕ／ｇ。产酶条件的研究,发现尿素是较好的氨源,麦芽糖是理想的碳源,最适产酶初始ＰＨ值为４,最佳产酶时间为２．５－３天,该菌株对四种生淀粉的降解顺序为：糖为淀粉〉高梁淀粉〉玉米淀粉〉马铃薯淀粉。     

马铃薯生淀粉糖化酶高产菌株的筛选与诱变研究

为了筛选出1株生淀粉糖化酶活力高、性质稳定的优良菌株,使用以马铃薯为唯一碳源的培养基从自然界分离出1株产马铃薯生淀粉糖化酶较强的菌种.出发菌株产酶活力为30.56U/mL,通过紫外和亚硝基胍诱变,得到突变株AS-NTG3-3,产酶活力提高到100U/mL.经初步判定,该菌株为黑曲霉.     

无蒸煮生淀粉糖化酶霉菌的选育

从23份土样中筛选出105株野生型霉菌，其中有10株具有较高的糖化生淀粉的能力，尤以A－4（Ⅱ）、C和E6 3株菌酶活力最高，分别达112562，825．1和825．1个酶活性单位；对C株菌进行紫外光诱变，从诱变后的菌株中筛选出有较大正向突变的两株菌株C（1）和C（5），与诱变前相比，C（1）菌的生淀粉糖化酶活力提高了27．3％，经生淀粉酒精发酵试验，相同条件下酒精度提高了22．4％；C(5) 的生淀粉糖化酶活力提高了12．1％，酒精度提高了5．97％。     

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-1基因克隆和序列分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉XZ-3S中扩增并克隆了木聚糖酶(Xyn ZF-1)基因的cDNA片段,测序结果表明,Xyn ZF-1基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,推测分子量为24.06ku,等电点为5.20。以XZ-3S基因组DNA为模板扩增Xyn ZF-1的DNA序列,该序列仅存在一个内含子,长度为68bp。成熟肽基因推导的氨基酸序列与其他微生物来源的木聚糖酶一级结构进行比较,同源性最高达到了89.47%。系统进化树分析该酶属于G/11族糖基水解酶。又进一步对Xyn ZF-1二级结构进行了分析,并通过SWISS-MODEL预测了该酶的三维结构。     

黑曲霉木聚糖酶（xynZF-2）基因克隆、表达及酶学性质分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉（Aspergillusniger）XZ-3S中成功克隆出木聚糖酶基因（xynZF-2）的cDNA序列（Genbank登录号为：JQ700382）。该基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,其中成熟肽为107个氨基酸。以重组质粒pUCm-T—xynZF-2为模板,扩增得到编码xynZF－2成熟肽的cDNA片段（624bp）。将其与表达载体pET－28a连接,构建重组表达载体pET－28a—xynZF－2,并转化大肠杆菌（Escherichiacoh）BL21（DE3）,获得重组工程菌BL21／xynZF-2。经IPTG诱导表达,木聚糖酶的的比酶活最高可达42．33U／mg。重组表达的木聚糖酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为5．0,在碱性条件下具有良好的稳定性。Fe^3＋对酶的激活作用最为明显。     

黑曲霉低聚葡萄糖氧化酶的分子克隆与生化特征

低聚葡萄糖氧化酶能够氧化低聚葡萄糖末端残基生成相应的低聚糖酸,在低聚糖酸的制备、食品、化工等方面具有潜在的应用价值。从黑曲霉基因组中发现1个疑似编码低聚葡萄糖氧化酶开放读框,共编码473个氨基酸序列,包含2个保守结构域(FAD结合域和黄素结构域)和4个活性位点(His80、Cys141、Asp377和Try428);在毕赤酵母中表达的重组酶蛋白大小为61 kDa,比酶活0.33 U/mg。重组酶的最适作用温度和pH值分别为75℃和9.0;在55～85℃和pH 5.0～9.0范围内孵育4 h,仍能保持70%以上的酶活;Mn²⁺和Fe³⁺分别对酶活具有最强的激活和抑制作用。该酶的K_m和V_max为0.48 mmol/L和2.22μmol/(L·min),对麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖具有相对较高酶活。     

黑曲霉单宁酶发酵工艺

用黑曲霉Aspergilhus niger QG 0301进行单宁酶发酵，制得酶制剂。实验结果表明：Aspergillus niger QG 0301进行单宁酶发酵的适宜培养基包括：混合碳源（或玉米淀粉）、硫酸铵、磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸镁、单宁酸；在30℃、120r/min振荡培养5天，单宁酶产量平均为18．55u／mL。     

黑曲霉VVTP84生产果糖转移酶

从产果糖转移酶的 11株菌株中筛选出一株黑曲霉VVTP84菌 .该菌株在含蔗糖的培养基中 ,最佳摇瓶发酵时间为 30h ,pH值为 7.0 ;当蔗糖质量浓度在 2 5 0g/L以内时 ,产酶与蔗糖质量浓度呈正相关 ;MgSO4 ·7H2 O和KH2 PO4 的添加量分别以控制在 1.5 g/L和 1.0 g/L为宜     

岷山红三叶草异黄酮合酶基因的克隆及序列分析

从岷山红三叶克隆异黄酮合酶基因,并对序列进行比对和进化分析。建立岷山红三叶愈伤组织培养体系,采用RT-PCR扩增从愈伤组织总RNA中分离了异黄酮合酶基因,并将其克隆到pGEM-T Easy载体,测序,得到全长1575bp的片段。序列分析表明,异黄酮合酶基因含1575个核苷酸,和大豆等其他植物中异黄酮合酶具有很高的同源性。      

葡萄糖氧化酶基因在黑曲霉中的分泌表达

通过PCR扩增从一株葡萄糖氧化酶生产菌黑曲霉中克隆得到1818bp葡萄糖氧化酶基因GOD,将GOD基因与糖化酶基因的5’同源臂、3’同源臂进行重叠延伸,构建葡萄糖氧化酶基因的表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-GOD。将载体pSZH-GOD通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得8株重组菌株。对8株重组菌株的发酵液上清液进行酶活测定,结果表明葡萄糖氧化酶基因在高产糖化酶的黑曲霉中得到了分泌表达,静置培养6d后其分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活最高可达1.166U/mL,而在出发菌株中检测不到葡萄糖氧化酶的分泌表达。同时,重组菌株胞内表达的葡萄糖氧化酶最高酶活可达11.45U/mL,是出发菌株的266倍。此研究结果为简化葡萄糖氧化酶发酵生产工艺、提高酶产量提供了新的途径。      

宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆和序列分析

依据宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001木聚糖酶(XynII)N末端氨基酸残基序列以及曲霉菌密码子的偏爱性和真核生物mRNA在3′端存在Poly(A)等所提供的生物信息,采用RTPCR技术扩增了XynII成熟肽和3′非编码区的cDNA片段,PCR产物直接克隆至pUCmT载体中。DNA序列分析表明,该cDNA全长733bp,其中3′非编码区178bp,成熟肽编码区555bp,编码184个氨基酸。成熟肽基因推导的氨基酸序列同Aspergillusniger、Emericellanidulans以及Trichodermaviride来源的木聚糖酶相比,同源性分别为89%、46%和36%。又进一步对XynII二级结构进行了分析,并通过SWISSMODEL预测了XynII的三维结构。     

Cloning and identification of rutin-degrading enzyme genes from Aspergillus niger in wheat Qu

Tartary Buckwheat Huangjiu, one of the oldest wines in China, has unique health-promoting properties. One of its specific ingredients is rutin, which has antioxidative and anti-ageing activities and plays important roles in the treatment of human diseases. During Tartary buckwheat Huangjiu brewing, however, rutin is degraded by fungi in wheat Qu, thereby leading to a decrease in the wine's nutritional value. The consequent aim of this study was to identify effective rutin-degrading fungi and degrading enzyme genes in the Tartary buckwheat Huangjiu brewing process. Among these fungi isolated from wheat Qu, only Aspergillus niger exhibited rutin-degrading ability. Following protein purification, SDS-PAGE, mass spectrometry, Blast analysis and clone verification, we ultimately identified glucoamylase and α-L-rhamnosidase encoding genes were related to rutin degradation. To our knowledge, this is the first report of rutin-degrading enzyme genes in Tartary buckwheat Huangjiu. Our results provide insights for regulating the nutritional value of Tartary buckwheat Huangjiu.     

白曲酸性蛋白酶在无孢黑曲SH-2中的克隆表达及酶学性质分析

白曲霉酸性蛋白酶在白酒酿造发酵过程中具有溶解发酵原料的颗粒,促进微生物繁殖,分解蛋白质生成香味物质,降解酵母菌体蛋白等多种功能,可以提高白酒风味,因此被广泛应用于白酒生产中。本研究利用经基因工程改造的低内源蛋白背景的黑曲霉宿主SH-2,表达白曲霉酸性蛋白酶基因pepB。通过PCR技术获得pepB以及表达元件糖化酶启动子PglaA、糖化酶终止子TglaA、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶标记基因pyrG,在pMD18-T载体基础上,构建了pepB表达载体,通过PEG介导转化法转化无孢黑曲酶SH-2。重组菌株经发酵罐发酵240 h,发酵粗酶液酶活达9722 U/mL,是报道的白曲原始菌株酶活的8.5倍,SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为47 ku。酶学性质分析结果表明,该酸性蛋白酶最适反应温度为35℃,最适pH为4.0,Mn~(2+)、Cu~(2+)对酶活有显著地激活作用。最后,探究了在不同发酵初始pH下重组菌株酶活的变化,结果显示,在pH 4.5~6.5范围内,适当提高发酵初始pH,酸性蛋白酶酶活会提高。以上结果表明,本研究成功构建了一株能胞内高效表达白曲酸性蛋白酶的菌株。