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【目的】克隆产碱假单胞菌的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌中异源表达并进行酶学性质研究。【方法】通过基因文库构建和PCR,获得脂肪酶基因,并以pET30a(+)为表达载体、E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在大肠杆菌中进行异源表达,表达产物经HisTrapTM亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从产碱假单胞菌中克隆得到一个脂肪酶基因,大小为1 575 bp(GenBank登录号为JN674069)。该酶分子量为55 kD,最适底物为p-NPO,最适反应温度和pH分别为35°C、pH 9.0。重组酶经1 mmol/L的Cu2+处理30 min可使酶活提高至156%。在最适反应条件下重组酶的比活力为275 U/mg,Km和Vmax分别为80μmol/L和290 mmol/(min.g protein)。【结论】产碱假单胞菌脂肪酶基因的克隆与表达不仅积累了脂肪酶基因的资源,并为其在手性拆分中的应用奠定基础。 相似文献
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将类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligene)总DNA经Sau3AI部分酶解后的35~50kbDNA片段与经BamHI线性化及CIAP处理过的粘粒pIJ285连接,以大肠杆菌LE392为受体,构建类产碱假单胞菌的基因文库。通过三丁酸甘油酯平板和橄榄油平板法检测克隆子,获得一株具有耐热碱性脂肪酶活性的菌株LE392(pHZ1401)。随后将pHZ1401上的外源DNA片段进行亚克隆,从而获得了具有脂肪酶活性的菌株HB101(pHZ1402)和HB101(pHZ1403),它们分别携带有2.9kb和3.0kb的外源片段。两外源片段约有2kb的重叠区。HB101(pHZ1403)所分泌的脂肪酶活性比HB101(pHZ1402)高4倍,是出发菌的5倍。 相似文献
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嗜盐脂肪酶产生菌的筛选及其粗酶性质 总被引:3,自引:0,他引:3
从内蒙古锡林浩特地区盐湖菌种样品分离获得一株嗜盐脂肪酶高产菌, 结合生理生化试验和16S rDNA序列分析结果, 鉴定并命名为Haloterrigena thermotolerans Z4。该菌最适生长NaCl浓度为3.5 mol/L, 最高生长温度为60°C, 属于嗜盐耐热古生菌。粗酶性质研究表明, 金属离子(Ba2+、Fe2+、Cu2+)对酶有激活作用, 酶活不同程度的提高了20%~30%; 该酶受EDTA的抑制, 酶活下降了20%, 受PMSF的完全抑制。该酶对NaCl有较高的依赖专一性, 至少需要0.5 mol/L NaCl维持活性并且高浓度NaCl可以提高其耐热水平。醇类物质对于提高酶的热稳定性有一定作用, 丙三醇效果最好。该酶对短链底物对硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)的最适水解条件为:pH 8.0、70°C、3.5 mol/L NaCl; 而对长链底物对硝基苯酚十六酸酯(p-NPP)的最适水解条件为:pH 8.0、80°C、2.5 mol/L NaCl。 相似文献
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一个产木质素酶的嗜碱细菌新种 总被引:5,自引:0,他引:5
从内蒙古盐碱湖分离到一株产木质素酶的嗜盐碱菌F10。其形态为杆状或短杆状 ,革兰氏染色阳性 ,最适生长pH为 9 5 ,最适生长温度为 37℃。通过生理生化特征、胞壁氨基酸成分、基于 16SrDNA序列的系统发育学分析和DNA DNA杂交同源性比较发现菌株F10是双芽孢杆菌 (Amphibacillus)属中一个与其它成员不同的新种 ,命名为好纪双芽孢杆菌Amphibacillushaojiensissp .nov . 相似文献
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产脂肪酶菌株C7828-5的筛选、鉴定以及产酶条件的优化 总被引:1,自引:0,他引:1
以花生油为唯一碳源,从海口市各地被油脂污染土样中分离筛选出1株中温碱性脂肪酶菌株C7828-5。形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定结果表明,该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。该菌所产脂肪酶的最适温度为37℃,最适pH为8.0。优化了菌株的产酶条件,最适产酶培养基(g/L)为:蔗糖5、牛肉膏20、(NH_4)_2SO_41、MgSO_4·7H_2O 0.5、CaCl_20.5,聚乙烯醇花生油乳化液120 mL,发酵72 h,获得高达8.08 U/mL的脂肪酶表达量。 相似文献
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产低温脂肪酶非极端细菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究 总被引:1,自引:1,他引:1
目的:筛选产低温脂肪酶非极端细菌菌株,扩大脂肪酶的应用范围。方法:利用维多利亚蓝B平板显色法和摇瓶发酵法,从土壤中筛选产脂肪酶菌株,通过菌落形态和菌体特征观察初步对菌种进行鉴定,并对该菌株的产酶发酵培养基进行了优化。结果:得到一株产低温脂肪酶非极端细菌菌株sybc—li一1,该菌株适宜产酶培养基(%)为淀粉1、牛肉浸膏1、NaNO3 0.08、CaCl2 0.04、MgSO4 0.04、橄榄油2和OP1;初始DH8、30℃、200r/min培养72h,脂肪酶活力可高达到30.2U/mL;所产脂肪酶粗酶最适作用温度20℃,最适pH9.5,0℃时仍能保持70%的酶活性,属于低温酶;该酶与目前报道的低温脂肪酶相比,有较好的热稳定性,粗酶在pH8.5、70℃条件下保温60mla,酶活力损失30%。结论:该菌株为自然环境中筛选的非极端细菌,所产脂肪酶为低温脂肪酶,在开发应用上有良好的前景。 相似文献
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目的:对一株低温耐热脂肪酶产生菌Pseudomonas RT-7进行产酶、纯化和特性研究.方法和结果:该菌的发酵液经50%硫铵沉淀、DEAE-Sepharose及Sephacryl S-100分离获得了纯化的脂肪酶(PL-7).SDS-PAGE电泳估算其表观分子量为44kDa,对底物特异性、作用温度、作用pH和耐热性的研究表明该酶为碱性脂肪酶,最适温度在15~20℃.该酶对C≤12链长的甘油三酯有较好的水解能力.该酶具有在低温和高温下稳定而在中温下不稳定的特点:表现为该酶经60℃30min处理后残余酶活高达93.33%,90℃处理30min后残余酶活仍有35.19%,而在40℃处理30min酶活仅残余28.23%.结论:该酶为低温碱性脂肪酶并在高温条件下具有很好的耐热性. 相似文献
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脂肪酶产生菌的选育及产酶条件的优化 总被引:19,自引:0,他引:19
A lipase-producing bacterium strain was isolated from soil and was identified as Pseudomonas sp.. Its lipase yield was improved 2.25-fold by combined beatment of UV irradiation and NTG. The lipase fermentation condition for the mutant strain was optimized with Plackett-Burman design and Response Surface Analysis(RSA), and the formula of the optimum medium suitable for industrial scale fermentation was thereby established. A maximum yield of 87.5 U/ ml was obtained. 相似文献
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脂肪酶可以催化甘油三酯水解成脂肪酸和甘油,已广泛应用在工业领域,而获得产酶微生物是研究的基础。采用油脂平板法筛选出1株脂肪酶产生菌。经16S rRNA序列分析可知,该菌株属于柠檬酸杆菌(Citrobacter werkman and Gillen)。单因素试验对其进行产酶条件优化,优化后产酶条件(g/L):淀粉2.0,KH2PO4 1.0,K2HPO4·3H2O 2.2,(NH4)2SO4 1.0,MgSO4·7H2O 0.1,牛肉膏2.0,橄榄油10.0 mL,pH 7.5,接种量1.5%(v/v),37 ℃培养43 h。获得最大酶活为384 U/mL,是优化前的13倍。可以利用该菌制备脂肪酶。 相似文献
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筛选到4株可产生脂肪酶的真菌菌株,分别是153—1、13—2、30425和西1-1,经形态观察、ITS序列测方法鉴定,30425、153—1鉴定为Trichoderma harzianum,西1-1、13—2鉴定T.longibrachiatum。研究了脂肪酶的基本酶学性质,153—1、13-2、30425和西1-1酶的最适作用温度为45℃、40℃、20℃、20℃,最适pH为9.5、10.0、7.5、9.5,金属离子对153—1、13—2、30425和西1-1酶活的影响存在差异,其中Mn^2+、Cu^2、Pb^2+对4株菌株的酶活均为抑制作用,而Ba^2+对4株菌株的酶活均为不同程度的激活作用。 相似文献
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Yasuo Aizono Masaru Funatsu Michihiro Sugano Katsuya Hayashi Yukio Fujiki 《Bioscience, biotechnology, and biochemistry》2013,77(9):2031-2036
The enzyme showed the optimum pH between 7.5 and 8.0, and the optimum temperature at about 37°C. It was stable over the pH range from 4 to 9 and below 40°C, but completely lost the activity by heating 60°C for 15 min. The enzyme was activated by low concentration of calcium ion but inhibited partially by high concentration of calcium ion and by EDTA. With respect to substrate specificity, the enzyme exhibited a high specificity toward triglycerides and hydrolyzed ester bonds of short-carbon chain triglycerides faster than long-carbon chain triglycerides, whereas it catalyzed the hydrolysis of the oils from rice bran, olive and coconut. When 2-oleo-1,3-distearin was used as substrate, the enzyme was capable of preferentially hydrolyzing fatty acid ester bonds at the 1,3-position. 相似文献