肿瘤坏死因子-α对体外血脑脊液屏障模型通透性的影响及其机制研究

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对体外血脑脊液屏障(BBB)模型通透性的影响及其调控机制。方法利用脑微血管内皮细胞与星型胶质细胞共培养建立大鼠体外BBB模型,并随机分为正常对照组、TNF-α干预组和Y-27632预处理组。采用γ计数仪检测125I-BSA的通透量观察TNF-α对血脑脊液屏障通透性的影响。结果TNF-α使体外BBB模型对125I-BSA通透量明显增加,Y-27632预处理能明显拮抗TNF-α的上述作用(P<0.01)。结论TNF-α可导致BBB通透性增高,Rho/Rhok细胞信号传导通路可能参与此过程的调控。     

肠黏膜屏障与粪sIgA及其在相关疾病中的研究进展

肠黏膜屏障能防止肠腔内有害物质穿过肠黏膜进入体内其他组织器官和血液循环,而粪便中sIgA是肠黏膜屏障中重要部分,是肠黏膜免疫屏障的主要免疫球蛋白,是维持肠道黏膜稳态的第一道防线,具有强化肠道的免疫屏障、阻止肠道病原体入侵、减轻肠道炎症反应等生物学功能.该文对粪便sIgA在相关疾病的研究进行综述,通过测定粪便中sIgA含量为相关疾病诊断及治疗提供理论依据.     

死亡结构域相关蛋白和E2启动子结合因子在儿童急性白血病中的表达及其临床意义

目的探讨死亡结构域相关蛋白(Daxx)和E2启动子结合因子-1(E2F1)在急性白血病(AL)患儿骨髓细胞中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin peroxidase,SP)法,分别检测40例AL患儿和20例非恶性血液病儿童Daxx和E2F1的表达情况。结果 (1)AL组患儿骨髓细胞Daxx和E2F1阳性表达率分别为40%和57.5%,均显著高于对照组的10%(P<0.05)和20%(P<0.01);Daxx表达水平在急性髓细胞白血病组(58.8%)明显高于急性淋巴细胞白血病组(26.1%,P<0.05);E2F1在两组患儿中的阳性表达率差异无显著性(P>0.05)。(2)Daxx表达阴性者的完全缓解率高于阳性者(P<0.05),但E2F1表达阳性者与阴性者的完全缓解率相比差异无显著性(P>0.05)。(3)AL患儿Daxx与E2F1的表达水平有相关关系(P<0.05)。结论 Daxx和E2F1在儿童急性白血病中高水平表达,在儿童急性白血病的发生发展过程中可能存在某种协同作用,可能与儿童AL的疗效及预后相关。     

Toll样受体2对肠上皮细胞屏障通透性的保护作用及机制

目的 肠上皮细胞屏障的损伤与多种胃肠道疾病的发生密切相关,有效维持屏障功能是治疗这些疾病的关键.本研究试图通过体外实验探讨Toll样受体2(toll-like receptor,TLR2)对肠上皮细胞屏障通透性的保护作用及其机制.方法 正常组将未转染Caco-2细胞,TLR2基因沉默Caco-2细胞,TLR2基因过表达Caco-2细胞培养21d形成单层,检测跨膜电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)值,其反应上皮细胞屏障的通透性.炎症组3类细胞分别于培养第19d给予10 ng/ml IL-1β刺激48 h,于第21d检测TEER值.抑制剂组3类细胞分别在IL-1β前再给予PI3K/Akt通路抑制剂处理1h,于第21 d检测TEER值.结果 TLR2基因沉默能够显著减低Caco-2细胞单层的TEER值(P＜0.01),而TLR2基因过表达能够升高TEER值,但不具有统计学意义.TLR2能够防止IL-1β造成的TEER值下降(P＜0.01),此作用在给予PI3K/Akt通路抑制剂后消失.结论 TLR2对肠上皮细胞屏障通透性具有调节作用,并且能够防止炎症造成的通透性增高,这种保护作用由PI3K/Akt通路参与介导.     

The effect of phospholipase A2 on bacterial translocation in a cell culture model

 The activity of phospholipase (PL)A₂ is elevated in the intestinal epithelia of patients with inflammatory bowel disease (IBD). Recently, we reported that lysophosphatidylcholine (L-PC), the PLA₂ hydrolysis product of phosphatidylcholine (PC), stimulates bacterial translocation (BT) in an enterocyte cell-culture model. These two observations stimulated us to examine the effects of extracellular PLA₂ on intestinal epithelial permeability. Human Caco-2 enterocytes were grown to confluence on porous filters in the apical chamber of a two-chamber cell-culture system. Monolayer integrity and tight-junction permeability were measured by dextran blue (DB) permeability and transepithelial electric resistance (TEER). Monolayers were treated with PC, L-PC, or PLA₂ with and without PC. The magnitude of BT was determined 2 h after treatment by adding Escherichia coli to the apical chamber followed by quantitatively culturing basal chamber samples. Thin-layer chromatography (TLC) was utilized to verify PLA₂ hydrolysis of PC to L-PC. Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance. The magnitude of BT across monolayers pretreated with PLA₂ + PC significantly increased compared to either PC or PLA₂ (6.83 ± 0.069, 2.41 ± 0.46, and 3.06 ± 1.14 log10 colony forming units/ml, respectively, P < 0.05). Absence of DB-permeability in any group confirmed monolayer integrity. TLC of PL samples harvested from the apical monolayer surface confirmed PC hydrolysis. PLA₂ mediates hydrolysis of PC to L-PC when both are applied to the apical surface of cultured enterocyte monolayers, resulting in increased BT and increased TEER with no damage to monolayer integrity. These observations may have implications in the pathogenesis and treatment strategies for IBD.     

ATRA诱导神经母细胞瘤细胞分化及TrkA表达的研究

目的 观察全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)体外对神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)细胞增殖的抑制和可能的分子机制及NGF-TrkA信号传导途径在NB细胞分化中的作用。方法 取本院住院2岁男性NB患儿新鲜手术标本，进行原代细胞培养，并对培养细胞进行分离与纯化，建立细胞系，作为细胞模型。通过台盼蓝拒染法计数活细胞；观察ATRA干预前后细胞形态学变化；RT-PCR分析TrkA表达情况。结果 ATRA作用NB细胞后，细胞形态发生显著变化，并可抑制细胞增殖，2d时TrkA表达增加，4d时出现TrkA表达的明显增加。结论 所建立的NB细胞系为可诱导分化型，即N型；≥5μmol／L，ATRA对NB细胞体外增殖有抑制作用并诱导其分化且表现剂量依赖关系；ATRA可诱导NB细胞分化成熟及TrkA mRNA表达水平增高，可能是ATRA体外诱导NB细胞分化逆转的分子生物学机制之一.     

Morphological and biochemical changes induced by arsenic trioxide in neuroblastoma cell lines

Arsenic trioxide has recently been shown to inhibit growth and induce apoptosis in a variety of hematologic malignancies, but very little is known about its effects on solid tumors and especially on neuroblastoma cells that have self-differentiating characteristics. To demonstrate the growth inhibition induced in neuroblastoma cells (the SH-SY5Y and SK-N-AS cell line) and acute promyelocytic leukemia cells (HL-60) by arsenic trioxide (As₂O₃), the viable cell numbers were counted after trypan blue staining. Apoptosis was assessed by the cell morphology, by flow cytometry with annexin-V staining, and by Western blot analysis for the apoptosis-related proteins (bcl-2 and PARP). To decide the dose for the clinical application of As₂O₃, normal peripheral blood lymphocytes were also examined. The growth and survival of the SH-SY5Y and SK-N-AS cells were markedly inhibited by As₂O₃ treatment at a 3 μM concentration before the changes of the normal lymphocytes were observed. The apoptotic cells showed a shrunken cell nucleus, and an increase in the number and balloon-like swelling of the mitochondria at 72 h after the As₂O₃ was added. Apoptosis of the annexin-V-positive cell proportion in the neuroblastoma cell lines was increased with increasing the exposure time and the concentration of As₂O₃, just like the HL-60 cells. Bcl-2 downregulation and PARP degradation were also noted all the cell lines, but these changes were not statistically significant among the 3 cell lines. Taken together, these results indicate that As₂O₃ is an excellent candidate as a therapeutic agent for the treatment of neuroblastoma.     

人巨细胞病毒感染对HEL细胞周期及Cdt1表达的影响

目的：研究人巨细胞病毒（HCMV）感染对人胚肺成纤维（HEL）细胞周期及复制允许因子Cdt1表达的影响,探讨HCMV感染可能的发病机制。方法：用血清饥饿法同步化HEL细胞于G0/G1期, 用HCMV感染同步化的HEL细胞作为感染组（n=106）,同时设模拟感染组为对照组（n=106）。于感染后12,24,48,72,96 h收获细胞。流式细胞术测细胞周期; RT-PCR法检测Cdt1 mRNA的表达水平。结果：①模拟感染组在感染后12 h,24 h 时处于G1期细胞比感染组明显增多,两组比较,差异有显著性（P﹤0.01）。②两组Cdt1 mRNA表达水平在12 h,24 h和48 h时差异均有显著性（P﹤0.05）。模拟感染组Cdt1 mRNA表达水平的高峰出现在感染后12 h,而感染组的高峰则出现在感染后48 h。结论： ①HCMV感染影响了HEL细胞周期,使大部分细胞停滞在G1期。②HCMV感染使HEL细胞复制允许因子Cdt1 mRNA的表达水平迟滞。③HCMV感染可能通过影响复制允许因子Cdt1的生成而干扰宿主细胞周期,影响宿主细胞DNA合成,导致器官功能障碍。［中国当代儿科杂志,2007,9（6）：580-582］     

1型糖尿病患儿T细胞亚群、细胞因子的变化及意义

目的　分析 1型糖尿病患儿外周血T细胞亚群 (CD3+ 、CD4 + 、CD8+ )及血清白细胞介素 2 (IL 2 )、可溶性白细胞介素 2受体 (sIL 2R)水平变化 ,以了解其在 1型糖尿病发病中的作用。方法　应用免疫荧光标记技术和流式细胞仪检测 30例 1型糖尿病患儿外周血T淋巴细胞亚群 ,同时用ELISA法定量检测患儿血清IL 2 /sIL 2R水平 ,并与正常对照组 16例作比较 ,且与胰岛功能进行相关分析。结果　 1.1型糖尿病患儿CD3+ 、CD4 + 细胞均显著升高 ,CD8+ 细胞显著降低 (P均 <0 .0 1)。 2 .1型糖尿病患儿血清IL 2明显高于正常对照组 (P<0 .0 1) ;sIL 2R较对照组明显降低 (P <0 .0 1)。IL 2与反映胰岛功能C 肽 (C P)、胰岛素呈负相关 ,而sIL 2R与C P、胰岛素呈正相关。结论　T淋巴细胞亚群失衡、IL 2及其受体参与介导胰岛 β细胞的损伤和 1型糖尿病发生     

α2β1整合素对神经母细胞瘤细胞侵袭迁移的影响

目的：近年来研究表明细胞间黏附分子整合素的变化与肿瘤细胞的侵袭迁移之间有着重要的联系,该研究进一步深入探讨α2β1整合素对神经母细胞瘤细胞侵袭和迁移能力的影响,为预防神经母细胞瘤细胞的转移和辅助治疗提供理论依据。方法：采用细胞倾斜实验、聚碳酸酯膜侵袭试验观察神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株细胞在整合素α2单克隆抗体(anti-α2)和β1单克隆抗体(anti-β1)作用下,瘤细胞迁移、侵袭能力的变化。迁移或侵袭的细胞通过姬姆萨染色,200倍显微镜下计数,计算不同条件下细胞迁移或侵袭抑制率。结果：anti-α2和anti-β1阻断组细胞的迁移能力较对照组98.1±7.4明显降低,分别为50.9±10.5和54.3±9.0(P<0.01),抑制率分别为48.1%和44.5%。anti-α2和anti-β1阻断组细胞的侵袭能力较对照组41.5±4.8明显减弱,分别为25.3±4.4和18.8±3.9(P<0.01),抑制率分别为39.0%和54.7%;结论：α2β1整合素在神经母细胞瘤细胞迁移侵袭过程中起着促进作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向肠神经细胞分化及胶质细胞源神经营养因子表达的变化

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞向肠神经分化的条件及胶质细胞源神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor,GDNF)及其受体RET基因表达的变化.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),传至第四代,进行诱导分化.以10ng/ml GDNF和10%FBS的稀释胎肠培养基(fetal gut culture medium,FCCM)以及仅含有10 ng/ml GDNF的L-DMEM诱导7 d,对照组为含10%FBS的L-DMEM完全培养液,免疫组化的方法鉴定细胞的神经特异性烯醇化酶(neural specific enolase,NSE)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)及一氧化氮合酶(nit ric oxide synthase,nNOS)的表达.RT-PCR检测GDNF及RET mRNA的变化,Westem Blot方法检测GDNF蛋白的表达情况.结果 BMSCs能在体外成功培养及纯化,诱导7 d后,实验组均可见NSE、VIP及nNOS的表达,两实验组的阳性率有统计学差异,而对照组为阴性.RT-PCR检测示,BMSCs向肠神经细胞诱导后,GDNF表达显著增强,并促使RET基因表达Western Blot结果提示,诱导后的细胞GDNF在蛋白水平上表达增强.结论 GDNF联合FCCM可诱导BMSCs分化为肠神经细胞,在向神经细胞分化的过程中,能促进GDNF表达的增强,并促使RET基因的表达,GDNF-RET信号通路在肠神经分化过程中可能发挥着重要作用.     

EZH2对先天性巨结肠结肠组织中GFRα1表达的影响

目的 通过检测先天性巨结肠（HSCR）患儿结肠组织内胶质细胞源性神经营养因子受体α1（GFRα1）及果蝇Zeste基因增强子人类同源物2（EZH2）的表达水平,探讨EZH2在调控GFRα1基因表达及HSCR发病过程中的作用。方法 随机选取24例行巨结肠根治术的HSCR患儿,取痉挛段结肠组织为试验组。以同期18例因新生儿坏死性小肠结肠炎而接受手术治疗的患儿,取手术切除的坏死结肠组织作为对照组。利用实时荧光定量PCR及Western blot检测两组结肠组织内GFRα1、EZH2的表达水平。将人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y分为EZH2过表达组和阴性对照组,EZH2过表达组转染pCMV6-EZH2质粒,阴性对照组转染pCMV6质粒,检测转染后细胞中GFRα1、EZH2的表达水平。结果 与对照组相比,试验组GFRα1及EZH2 mRNA和蛋白的表达水平降低（P < 0.05）,且EZH2蛋白表达水平与GFRα1蛋白呈正相关（r=0.606,P=0.002）。与阴性对照组相比,EZH2过表达组EZH2及GFRα1表达水平明显上调（P < 0.05）。结论 HSCR患儿结肠组织中EZH2低表达可能是GFRα1表达不足,诱发HSCR的原因之一。