酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的 提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPIF)原代培养的成功率,快速建立体外细胞研究模型。方法 采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块,获取细胞;用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源,通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果 原代培养成功率为77．8％。获得的细胞呈梭形,抗波形丝蛋白染色呈阳性,抗角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性,生长良好。结论 酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率,方法可行。     

人牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的 建立人牙周膜细胞原代培养方法.方法 取因正畸需要拔除的健康前磨牙根面中1/3的牙周膜组织,分别运用组织块法(n=12)、酶消化法(n=10)及组织块一酶消化联合培养技术(n=12)培养人牙周膜细胞.运用免疫组化染色法对培养细胞的生物学特征加以鉴定.绘制生长曲线,观察细胞生长并计算细胞群体倍增时间.结果 组织块法、酶消化法和织块一酶消化联合培养的细胞培养成功率分别为16.67%、20.00%和33.33%.培养细胞的抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;碱性磷酸酶染色阳性.细胞生长曲线有明显的滞留期、指数生长期和平台期,群体倍增时间为109.79 h.结论 成功进行人牙周膜细胞的原代培养,培养细胞具有牙周膜细胞的生物学特征.组织块-酶消化联合培养可提高人牙周膜细胞原代培养的成功率.     

人牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的 建立人牙周膜细胞原代培养方法.方法 取因正畸需要拔除的健康前磨牙根面中1/3的牙周膜组织,分别运用组织块法(n=12)、酶消化法(n=10)及组织块一酶消化联合培养技术(n=12)培养人牙周膜细胞.运用免疫组化染色法对培养细胞的生物学特征加以鉴定.绘制生长曲线,观察细胞生长并计算细胞群体倍增时间.结果 组织块法、酶消化法和织块一酶消化联合培养的细胞培养成功率分别为16.67%、20.00%和33.33%.培养细胞的抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;碱性磷酸酶染色阳性.细胞生长曲线有明显的滞留期、指数生长期和平台期,群体倍增时间为109.79 h.结论 成功进行人牙周膜细胞的原代培养,培养细胞具有牙周膜细胞的生物学特征.组织块-酶消化联合培养可提高人牙周膜细胞原代培养的成功率.     

体外培养人牙周膜细胞方法的探讨

目的:研究如何提高体外培养人牙周膜细胞(hPDL)的成功率,为简便、快速地获得大量成活率高的hPDL膜细胞,建立体外细胞模型提供一定的实验方法.方法:利用3种不同方法(组织块法、酶消化组织块法、全牙消化法)进行牙周膜细胞的原代培养,用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源;通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性.结果:3种方法获得的细胞形态和生物学行为大致相同;波丝蛋白抗体染色阳性,角蛋白抗体染色阴性.组织块法培养的细胞同源性好,但初代培养时间长;全牙消化法的原代培养成功率高于其他2种方法.结论:通过对牙周膜细胞培养方法的改良,可以显著提高hPDL原代培养的成功率.     

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的：提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPLF)原代培养的成功率，快速建立体外细胞研究模型．方法：采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块，获取细胞；用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源，通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性．结果：原代培养成功率为77．8％．获得的细胞呈梭形，抗波形丝蛋白染色呈阳性，抗角蛋白染色呈阴性，     

新生大鼠成纤维细胞原代培养

目的探讨新生sD大鼠成纤维细胞的培养方法。方法采用胰酶消化法和组织块贴壁法原代培养成纤堆细胞。采用HE染色及波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定。结果两种方法均能培养出成纤维细胞,其中酶消化法一次性可获得较多细胞,但细胞状态较差,贴壁慢,生长慢;组织块贴壁法短时间内可长出大量成纤维细胞,一周即可传代。HE染色后倒置相差显微镜下观察细胞形态典型,免疫细胞化学染色结果显示Vimentin呈阳性反应。结论组织块贴壁培养法是获取成纤维细胞简单,可行,快速的方法。     

联合培养法进行人牙周膜细胞的比较培养与鉴定

目的 比较消化法与组织块法联合培养与单纯组织块法两种方法获得人牙周膜细胞的成功率及细胞来源鉴定情况.方法 刮取因正畸需要而拔牙的牙周膜,分别进行组织块法和消化法与组织块法联合培养进行人牙周膜细胞的原代培养,并进行波形丝蛋白、角蛋白和碱性磷酸酶(ALP)的检测,以鉴定细胞来源.结果 组织块法在1～2周内有原代细胞游出.在第2或第3天,联合培养法消化游离出来的细胞开始贴壁,消化后的疏松状牙周膜亦可贴壁,且有细胞爬出.组织块法的成功率为27％,联合培养法成功率为70％.ABC免异组化法及ALP鉴定其为非牙龈来源的中胚层细胞.结论 联合培养法可显著提高原代细胞培养的成功率,并在短期内获得大量和相对纯化的实验用细胞.     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

酶消化组织块法培养人牙髓细胞

目的建立用酶消化组织块培养人牙髓细胞的方法。方法用酶消化组织块进行人牙髓细胞体外培养,倒置显微镜和透射电镜分别观察牙髓细胞形态、生长情况和超微结构,取第5代牙髓细胞测定生长曲线、免疫组化法鉴定组织来源,并检测其矿化能力。结果用酶消化组织块培养的人牙髓细胞成纤维细胞样,接种4天大部分组织块能有效贴附于培养瓶壁,第7天可见组织块边缘有细胞延展生长,第14天复层生长,呈网状,可顺利传代;牙髓细胞抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;细胞I型胶原染色阳性,连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节,符合牙髓细胞的形态学特征和生物学特性。结论酶消化组织块培养人牙髓细胞方法简单可行,具有较高的成功率。     

人大肠癌细胞体外分离与培养

目的:探讨人大肠癌细胞体外分离培养的方法.方法:采用组织块法和Ⅳ胶原酶消化法体外培养人大肠癌细胞,HE染色、免疫细胞化学判断细胞的组织来源、TEM观察细胞形态,MTT法绘制细胞生长曲线.结果:采用组织块法细胞培养成功,HE染色显示核大蓝染, 细胞角蛋白鉴定胞浆黄染,细胞角蛋白阳性;透射电镜下,见细胞内丰富的线粒体、表面微绒毛、细胞间连接复合体结构;细胞生长曲线为"S".结论:组织块法原代培养细胞成功率高,需注意在取材、分离操作过程中保持无菌,所培养的细胞进行初步鉴定证明为大肠癌细胞.     

全牙酶消化法原代培养人牙周膜成纤维细胞及鉴定

目的 探讨一种快速简便、原代培养成功率高、可重复性高的人牙周膜成纤维细胞培养方法。方法将处理后的牙齿整个用酶进行消化,原代培养人牙周膜成纤维细胞,对培养出的细胞进行形态学观察,免疫组化方法鉴定其来源,通过生长曲线研究其生物学特性。结果 8~14 d内可获得实验用成纤维细胞,原代培养成功率为90%,细胞形态呈长梭形。波形丝蛋白染色呈阳性,角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性。结论采用全牙酶消化法可以快速、成功地培养出人牙周膜成纤维细胞,且简单易行,可重复性高。     

补肾中药醇提活性成分对人牙周膜细胞生物学性状的影响

目的:观察补肾中药醇提活性成分对体外培养人牙周膜细胞增殖和功能的影响.方法:应用组织块法和酶消化法体外培养人牙周膜细胞,以MTT法检测补肾中药活性成分对人牙周膜细胞的增殖率和中药活性成分对ALP活性的影响.结果:补肾中药醇提活性成分对人牙周膜细胞增殖能力和ALP活性有增强作用.结论:补肾中药醇提活性成分对体外培养人牙周膜细胞的增殖和功能有促进作用.     

Effects of Shuanghuangbu on the total protein content and ultrastructure in cultured human periodontal ligament cells

Background Successful periodontal regeneration depends on the migration, proliferation and differentiation of periodontal ligament cells in periodontal defects. The total protein content and the ultrastructure demonstrate the metabolizability and activity of periodontal ligament cells. This study wasconducted to observe the effects of Shuanghuangbu, a mixture of medicinal herbs, on the total protein content and the ultrastructure of human periodontal ligament cells.Methods Periodontal ligament cells were grown to confluence and then cultured in Dulbecco‘ s modified eagle medium (DMEM) supplemented with Shuanghuangbu over the concentration range of 0 to 1000 μg/ml. The total protein content in cultured cells was determined by using Coommasie brilliant blue technique. Periodontal ligament cells were incubated in 0 and 100 μg/ml Shuanghuangbu decoction for 5 days, then observed through transmission electron microscope.Results The total protein content of human periodontal ligament cells increased in each experiment group added 10 -1000 μg/ml Shuanghuangbu respectively, and the effect of 100 μg/ml was excellent. Under the transmission electron microscope, there were more rough endoplasmic reticulumsand mitochodrias in the experiment group than those in the control group.Conclusion Shuanghuangbu stimulates the protein synthesis of human periodontal ligament cells and improves human periodontal ligament cells‘ metabolizability and activity.     

原代人牙周膜成纤维细胞的培养及培养方法的改进

目的：探讨如何提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率。方法：组织来源于11～15岁青少年因正畸而拔除的前磨牙，刮取牙根中1／3的牙周膜组织，组织贴壁培养法进行培养采用冠根分离控制取材中的污染，首次传代前进行细胞分散的方法来提高传代的成功率，并对培养细胞的形态及超微结构进行了观察。结果：经免疫组化染色证实所培养的细胞为牙周膜成纤维细胞，通过冠根分离法可有效的控制组织污染，首次传代前进行细胞分散可提高细胞传代成功率，从而使细胞培养成功率提高。结论：获得人牙周膜成纤维细胞，培养成功率在15％～20％。     

周期性牵张力对人牙周膜细胞中成骨样细胞表型碱性磷酸酶和骨钙素mRNA表达的影响

目的：了解机械力介导的牙周膜细胞中成骨样细胞特性的改变,以利于深入研究正畸牙齿移动的机制。方法：应用地高辛标记寡核苷酸探针进行细胞原位杂交,检测在间歇性机械牵张力作用下人牙周膜细胞中的成骨样细胞表型蛋白碱性磷酸酶和骨钙素在mRNA转录水平的表达改变。结果：间歇性牵张力作用增强人牙周膜细胞碱性磷酸酶和骨钙素基因的表达。结论：间歇性牵张力作用诱导人牙周膜细胞向成骨样细胞的分化。     

胰岛素样生长因子Ⅰ对体外培养人牙周膜细胞骨钙素分泌的影响

目的：观察胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF－Ⅰ）对体外培养的人牙周膜细胞骨钙素分泌的影响,以探讨IGF－Ⅰ在人牙周膜细胞向成骨样细胞分化中的作用。方法：体外培养牙周膜细胞,放免法测定人牙周膜细胞骨钙素分泌量。实验分为空白对照组、IGF－Ⅰ3．125ng/ml组、IGF－Ⅰ6．250ng/ml组,IGF－Ⅰ2．500ng/ml组、IGF－Ⅰ25．000ng/ml组。结果：在含β－甘油磷酸钠和L－抗坏血酸的的下,人牙周膜细胞体外培养可产生并分泌骨钙素;随着培养时间的延长,骨钙素分泌增加,在第3周时分泌量达最大。加入生长因子IGF－Ⅰ,骨钙素分泌量呈剂量依赖性增加,结论：IGF－Ⅰ可增加人牙周膜细胞骨钙素的分泌。     

釉基质蛋白对人牙周膜成纤维细胞矿化相关蛋白的影响

目的通过检测釉基质蛋白（Enamel matrix proteins,EMPs）作用于体外培养牙周膜成纤维细胞,对细胞骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连素、牙骨质附着蛋白（Cementum attachment protein,CAP）表达及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性的影响,探讨EMPs促进牙周组织再生的作用机制。方法酶消化法获得人牙周膜成纤维细胞（Human periodontal ligament fibroblast,hPDLF）用100mg/L的EMPs诱导,镜下逐日观察细胞形态变化,在3天、7天两个时间点利用免疫组化方法和图像分析技术检测和分析诱导条件作用后细胞骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连素表达的影响,检测细胞牙骨质附着蛋白的表达。利用ALP法检测诱导后细胞成骨活性的变化。结果 100mg/L的EMPs对hPDLF具有上调骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连素的作用,随时间延长这种促进作用愈明显;EMPs作用hPDLF 3天即表达牙骨质附着蛋白;EMPs可促进hPDLF碱性磷酸酶活性的增强。结论 EMPs在一定浓度下可促使hPDLF向成骨、成牙骨质样细胞分化。     

牙周膜干细胞膜片复合生物陶瓷纳米载体修复兔牙槽骨缺损

目的探讨PDLSCs细胞膜片与纳米级B-TCP复合叠层三维结构对牙槽骨缺损的相关修复及治疗作用。方法分离及培养牙周膜干细胞,制备牙周膜干细胞生物膜片,构建PDLSCs细胞膜片与纳米级B-TCP复合叠层三维结构模型,将其植入新西兰兔缺损骨模型内,于术后第4周、第8周、第12周处死新西兰兔并分离牙周组织,通过形态学分析评判修复效果。结果 WB结果示,Runx2、ALP蛋白的表达量比对照组分别增加9.2倍和4.3倍;移植后第8周,苏木精-伊红染色示PDLSCs细胞膜片与纳米级B-TCP复合叠层三维复合结构组新骨形成的百分比显著高于对照组及空白对照组(P0.05);免疫组化染色示构建PDLSCs细胞膜片与纳米级B-TCP复合叠层三维复合结构组成骨相关标志物OCN、ALP、Runx2蛋白表达高于对照组及空白对照组(P0.05)。结论牙周膜干细胞膜片与B-TCP三维叠层结构复合结构可促进兔牙槽骨缺损部位的修复及再生,为临床牙槽骨缺损的治疗提供一种新的思路,有广阔的应用前景。     

老年人牙周膜细胞生长增殖的比较研究

目的 :观察老年人牙周膜细胞生长增殖能力的变化情况。　方法 :采用牙周膜细胞原代培养 ,并用四唑盐(MTT)比色法检测老年人牙周膜细胞生长增殖能力的变化 ,并与青年人牙周膜细胞增殖情况比较。　结果 :①老年组牙周膜细胞生长极其缓慢 ,细胞呈现衰老状态 ,与青年组牙周膜细胞表现比明显不同。②老年组牙周膜细胞在 1、3、5、7、9天时测得的光密度值 (A570 )均明显低于青年组牙周膜细胞的A570 ,两组比较差异显著 (P <0 .0 0 1)。　结论 :由于衰老的影响 ,老年人牙周膜细胞生长增殖功能明显降低 ,与青年人牙周膜细胞区别较大 ,提示衰老造成的老年人牙周膜细胞生长增殖功能降低 ,可能是老年人牙周组织疾病发病率高、破坏程度重、修复再生功能降低的重要原因