不同冷冻方法对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

通过采用程序降温法(试验1:分步法10%甘油;试验2:直接法1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖)和玻璃化法(试验3:20%甘油+0.3M蔗糖+0.3M木糖+3%聚乙二醇+20%乙二醇)对牛体外受精胚胎进行冷冻保存及解冻后进行孵化培养试验,用囊胚孵化率对各方法进行了比较。结果表明,10%甘油组、1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖组及玻璃化组胚胎存活率分别为85%、82.5%、90%;囊胚孵化率分别为50%、55%和80%(P<0.05)。体外受精胚用玻璃化法保存显著优于程序降温法,可获得较高的胚胎存活率(90%)和囊胚孵化率(80%)。     

脱防冻剂方法对牛体外受精胚胎冷冻后成活率的影响

为了观察脱防冻剂方法对牛体外受精冷冻胚胎在体内、外发育率的影响,应用常规冷冻法在０．７５ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．５ｍｏｌ／Ｌ丙二醇溶液中冷冻受精后７、８ｄ的囊胚,解冻后在０．２５、０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中二步或在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中三步脱防冻剂的胚胎孵化率（分别为６８．６％、６２．２％、６８．７％）与用ＰＢＳ／ＦＣＳ六步脱防冻剂的差异不显著（７０．４％,Ｐ＞０．０５）,但在０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中三步脱防冻剂后,孵化率显著降低（４７．６％,Ｐ＜０．０１）。用０．２５ｍｏｌ／Ｌ或０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖或海藻糖预先使胚胎脱水后冷冻,解冻后可使胚胎直接在ＰＢＳ中一步脱掉防冻剂,胚胎孵化率（４５．０％～４９．５％）与在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中二步脱防冻剂的相似（５１．５％,Ｐ＞０．０５）。移植试验表明,在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中二步脱防冻剂获得的妊娠率与六步脱防冻剂相似,与在ＰＢＳ中一步脱防冻剂的亦无明显差异,但妊娠率均偏低（２１．４％～３７．５％）。     

不同浓度防冻剂和投液氮温度对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

比较了3种不同浓度的甘油（1.4,1.0,0.7mol/L）和投液氮温度（-25℃、-30℃和-35℃）对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响。结果发现,最终投液氮温度为-25℃时,胚胎冻后存活率以1.4mol/L甘油组为最高,同1.0mol/L甘油组相比,差异显著（78.5%vs 64.5%,P〈0.05）;与0.7mol/L甘油组相比,差异极显著（78.5%vs53.5%,P〈0.01）。以1.0mol/L的甘油冷冻,-30℃投液氮的效果优于-25℃的,它们之间冻后胚胎的孵化率差异显著（77.1%vs 64.5%,P〈0.05）。用0.7mol/L甘油冷冻,投液氮温度以-30℃的为最好,冻后胚胎的孵化率（73.3%）极显著（P〈0.01）高于-25℃的（53.5%）。用1.4mol/L甘油冷冻,以-25℃投液氮为最好,冻后胚胎的孵化率（78.5%）显著（P〈0.05）高于-35℃的（65.7%）。结果表明,不同的甘油浓度和投液氮温度对牛体外受精胚胎的冷冻效果有显著的影响。     

在不同溶液和容器中短期保存牛体外受精胚胎的效果

为提高室温保存牛体外受精胚胎的效果，特进行了３个试验。试验一分别用３种保存液（ＰＢ１，ＴＣＭ－１９９，Ｈａｍ′ｓＦ－１０）、两种容器（玻璃试管，ＡＡ２０１塑料细管）在２０℃保存胚胎２４ｈ。结果表明，保存液对保存效果无显著影响，在３种保存液中保存第７、８天囊胚的总孵化率分别为７４．７％，７１．８％，７５．５％（Ｐ＞０．０５）。用试管保存的胚胎总孵化率（８３．６％）明显优于用ＡＡ２０１塑料细管保存的（６０．８％）（Ｐ＜０．０１）。试验二比较了用ＰＢ１在两种型号的细管（ＡＡ２０１，ＺＡ４７５）中保存胚胎的效果。胚胎在ＺＡ４７５细管中保存后的孵化率（８９．４％）显著高于在ＡＡ２０１细管中保存的（７６．３％）（Ｐ＜０．０１）。试验三用ＰＢ１在ＺＡ４７５细管中保存第７天囊胚３～７ｈ或１８～２４ｈ，将１枚胚胎移入已授精的、处于发情周期第７天的受体母牛黄体对侧的子宫角内。两组受体牛的妊娠率（分别为６０．３％，６８．３％）和双胎率（分别为４５．７％，６９．８％）均较高，而且差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明胚胎可在ＺＡ４７５细管中成功地保存２４ｈ。     

不同因素对牛体外受精效果的影响

比较公牛个体、精子密度、精卵比例、受精前机械脱除卵丘细胞及胚胎培养液体积对体外受精效果的影响。结果表明:不同公牛个体的精子受精的卵裂率差异不显著(P>0.05),但囊胚率受到极显著的影响(52.24%vs28.13%,P<0.01);精子密度在(0.5~1.5)×106/mL间的卵裂率和囊胚率差异都不显著(P>0.05),但精子密度在0.25×106个/mL时的卵裂率显著低于其他3个试验组(52.17%vs91.23%,P<0.05);受精时,精卵比控制在2 000~10 000∶1之间,受精卵的卵裂率、囊胚率均无差异(P>0.05);受精前机械脱除卵丘细胞对受精效果没有影响(45.21%vs36.46%,P>0.05);每枚胚胎培养液体积在2.5~10μL之间的群体培养,对受精胚的发育没有显著影响(51.39%vs35.06%,P>0.05)。     

影响奶牛体外受精胚胎培养效果的胚胎因素

对胚胎因素影响奶牛体外受精胚胎培养效果进行了研究。结果发现,在胚胎因素中,胚胎类型(冻胚和鲜胚)与胚胎发育阶段对胚胎培养效果没有显著影响(P>0.05);冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响极显著(P<0.01);冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著(P<0.05),解冻后A级胚胎存活率(80%,128/160)、囊胚孵化率(58.75%,94/160)显著高于B级胚胎存活率(59.38%,95/160)和囊胚孵化率(37.5%,60/160)(P<0.05);解冻水浴温度(20℃、30℃)对培养效果有极显著影响(P<0.01)。     

和牛体外受精胚胎玻璃化冷冻与解冻孵化试验

用添加5％犊牛血清(FCS)的TCM-199进行卵母细胞成熟,BO液进行体外受精后,在5％犊牛血清的CR1aa液进行体外培养获得和牛体外受精胚胎。经玻璃化冷冻保存后解冻,进行孵化试验,解冻后透明带完整率为100％,解冻后存活率为90％。用含20％和5％犊牛血清(FCS)的TCM-199培养孵化,经24h、48h存活率分别为77．8％、74．1％;51．9％、49．1％。两者差异不显著。     

牛体外受精胚胎的玻璃化冷冻及一步脱防冻剂的研究

在过去的１０年中,体外受精技术进展很快,目前已可以利用该技术在实验室内大批量生产牛胚胎。研究简单、有效的冷冻方法无疑会加速体外受精胚胎在生产中的推广应用。玻璃化冷冻法由于操作简便,可以快速冷冻胚胎而日益受到重视。过去的研究已证实,用２５％乙二醇＋２５...     

影响受体牛冷冻移植胚胎效果的主要因素

试验研究影响受体牛移植冷冻胚胎效果的主要因素,目的是解决胚胎移植产业化中容易出现的技术问题,以提高牛胚胎移植妊娠率。在季节、饲养管理、同期发情处理和胚胎移植技术以及环境条件等基本相同的情况下,结果表明:西门塔尔杂交牛的移植利用率和移植妊娠率高于黄牛杂交牛和黑白花奶牛,但各组间无显著性差异(P>0.05);2～6周岁的受体牛移植利用率和移植妊娠率高于7周岁以上和2周岁以下的受体牛,但各组间无显著性差异(P>0.05);经产1～3胎受体牛移植利用率显著高于4胎以上的受体牛(P<0.05),而移植妊娠率则无显著性差异(P>0.05);体况上等与中等的受体牛移植利用率和移植妊娠率无显著性差异(P>0.05);同期发情处理时卵巢处于黄体期的移植利用率显著高于卵泡期,差异极显著(P<0.01);左侧卵巢有黄体的子宫角胚胎移植妊娠率显著高于右侧(P<0.05);胚龄对胚胎移植妊娠率高低依次为早期囊胚、桑椹胚和囊胚,但无显著性差异(P>0.05)。     

玻璃化冷冻牛体外受精胚胎不同解冻方法试验研究

用添加5％犊牛血清(FCS)的TCM-199进行卵母细胞成熟,BO液进行体外受精后,在5％犊牛血清的CR1aa液进行体外培养获得牛体外受精胚胎。经玻璃化冷冻保存,解冻后分别用分步脱出保护剂和一步脱出冷冻保护剂后,进行孵化试验,解冻后透明带完整率为100％,解冻后分步脱出保护剂和一步脱出保护剂存活率分别为90％(36／40)、50％(20／40);囊胚孵化率分别为80.6％(29／36)、35％(7／20);48小时存活率分别为52.8％(19／36)、20％(4／20);两者间差异极显著(P<0.01)。用含20％和5％犊牛血清(FCS)的TCM-199培养孵化,分步法脱出保护剂,培养囊胚孵化率分别为83.3％(15／18)、77.8％(14／18);48小时存活率分别为55.6％(10／18)、50.0％(9／18)。两者差异不显著(P>0.05)。用含20％和5％犊牛血清(FCS)的TCM-199培养,一步法脱出保护剂囊胚孵化率分别为40％、30％,两者差异不显著(P>0.05)。48小时存活率相同,为20％。本试验结果表明,玻璃化冷冻胚胎,分步法添加保护剂,解冻后分步脱出保护剂可以获得较高的存活率和囊胚孵化率。     

绵羊体内外受精胚胎玻璃化冷冻保存

用 EFS4 0溶液对绵羊体内外受精的早期囊胚进行了玻璃化冷冻保存的研究。经卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养获得的早期囊胚 ,分别作如下处理 :( A) 1 0 %EG中预处理 5min后 ,在 EFS4 0平衡 3 0 s(两步法 ) ;( B) EFS4 0中平衡 1 min(一步法 ) ;( C) EFS4 0中平衡 2 min(一步法 )。然后投入液氮中冷冻保存 ,解冻胚胎的继续发育率分别为 80 %、78%和 50 %,A、B2组的结果与对照组 ( 88%)无显著性差异 ( P >0 .0 5)。经超数排卵获得的体内受精早期囊胚用两步法冷冻保存 ,解冻后胚胎发育继续率为 89%,与对照组( 93 %)也无显著性差异 ( P >0 .0 5)     

牛的体外受精技术研究进展

本文阐述了体外受精技术在牛胚胎工程和育种研究中的意义,介绍了牛体外受精技术的研究历史和目前的研究进展,对牛IVF技术的技术指标现状及经济效益进行了评估,并就牛的体外受精技术当前研究存在的问题作了评述,对其前景做了展望。     

牛的体外受精技术研究进展

本文阐述了体外受精技术在牛胚胎工程和育种研究中的意义，介绍了牛体外受精技术的研究历史和目前的研究进展，对牛体外受精技术的技术指标现状及经济效益进行了评估，并就牛的体外受精技术当前研究存在的问题作了评述，对其前景做了展望。     

In vitro Fertilization of Bovine Oocytes Exposed to Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1)

Contents: Cumulus-oocyte complexes were matured for 24 hours in the presence or absence of bovine herpes virus-1 (BHV-1, 10⁶ TCID₅₀/ml), fertilized in vitro and then co-cultured on oviductal cells to the blastocyst stage. The percentages of oocytes which cleaved were 48% (n = 905) for oocytes matured in the presence of BHV-1, and 51% (n = 1004) for the control oocytes. Comparing BHV-1-treated to control, the percentages of cleaved oocytes which developed to the blastocyst stage were 29% and 31%, respectively (p > 0.05). Embryos produced from the experimental group of oocytes tested positive for BHV-1.     

牛卵母细胞体外受精和体外成熟技术

文章从卵母细胞的来源、精子体外获能、卵母细胞体外成熟、体外受精和体外受精早期胚胎培养五个方面综述了牛卵母细胞体外受精和体外成熟技术的研究进展.同时指出了影响精子体外获能的因素、影响卵母细胞成熟培养的因素、体外受精存在的问题及解决办法等.并且对影响该技术的主要因素进行了系统分析.     

奶牛活体采卵-体外受精效率的影响因素研究

为建立稳定高效的活体采卵-体外受精技术体系,提高体外胚胎生产效率,本研究先利用屠宰场采集的新鲜卵巢卵母细胞进行体外受精,通过胚胎发育潜力来筛选最佳的体外胚胎培养液;再进一步研究不同种公牛精液和供卵母牛对活体采卵-体外受精效率的影响。结果显示,CR1aa培养液和mCR1aa培养液卵裂率差异不显著（P>0.05）,但mCR1aa组的囊胚发育率显著提高（28.1% vs 20.6%,P<0.05）;选取的3头荷斯坦种公牛精液的活体采卵-体外受精胚胎的卵裂率差异不显著（P>0.05）,但1号种公牛精液体外受精后囊胚率（38.7%）显著高于2号和3号（23.8%&22.9%）（P<0.05）;随机选择的3头活体采卵供体母牛（H1、H2、H3）获得的头均可用卵母细胞数无显著差异,但H1和H2供体母牛体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显著高于H3供体牛（P<0.05）,且H1供体牛体外受精囊胚率显著高于H2供体牛（P<0.05）。结果表明,mCR1aa培养液能显著提高体外受精囊胚发育率,适用于体外胚胎生产;种公牛精液和供体母牛个体差异会直接影响活体采卵-体外受精胚胎的生产效率,为奶牛活体采卵-体外受精生产技术体系的优化提供参考。     

水牛附睾尾精子的体外受精

采用肝素诱导获能 ,比较了 TAL P液和 BO液处理水牛附睾尾精子进行体外受精和细管冷冻精液体外受精的效果。结果表明 ,用 BO液和 TAL P液分别处理水牛附睾尾精子 ,受精后的卵裂率分别为 4 6 .6 7%和 5 3.73% ,发育率分别为 2 1.6 7%和 2 6 .87% ,其受精效果差异不显著。综合 2种方法 ,水牛附睾尾精子的受精率为 5 7.14 % ,受精后的卵裂率为 5 0 .39% ;发育率相对于培养卵为 2 4 .4 1% ,相对于卵裂卵为 4 8.4 4 % ;与细管冷冻精液 (5 6 .0 0 % ,5 4 .31% ,2 6 .72 % ,4 9.2 1% )相比 ,差异不显著。形态学观察还表明 ,用保温干储的方法可获得活率好、存活时间长的附睾尾精子。试验结果说明水牛附睾尾精子用于体外受精可以得到与细管冷冻精液相当的效果。     

奶牛体外受精胚胎的性别控制研究

为加速母牛胚胎的生产,实现性控制胚胎产业化和体外扩繁优质品种的奶业工程发展,本研究在体外受精技术（in vitro fertilization,IVF）不断成熟和完善的基础上,通过对牛非性控IVF胚胎与常规人工受精体内胚胎移植的妊娠成功率及其两者出生后牛的性别比例进行比较分析,结果发现,两组妊娠成功率基本相同,且IVF胚胎出生的公牛比例高于体内胚;采用性控和非性控精液进行IVF试验,并对非性控IVF胚胎及性控IVF胚胎用牛Y染色体性别决定特异基因（SRY）核心序列进行分子生物学性别鉴定,结果显示,性控IVF胚胎的公牛比例显著低于普通IVF胚胎;此外,作者还比较了性控IVF与普通非性控IVF的囊胚发育率,结果显示两者并无显著差异。以上研究结果证明,体外扩繁优质良种母牛的奶业工程必须依靠性别控制体外授精技术来提高其效率和有效性。