构建人肝细胞癌相关抗原HCA661和mtHSP70刺激表位的融合基因疫苗

目的：构建人肝细胞癌相关抗原661（HCA661）与牛型结核分枝杆菌热休克蛋白70 （mtHSP70）刺激表位的融合基因疫苗。方法：通过PCR技术扩增HCA661基因,定向克隆至真核表达质粒pCI-neo后测序。通过PCR技术从牛型结核分支杆菌基因组中扩增包含mtHSP70刺激表位的DNA片段,亚克隆至pGEM-T easy后测序。将该刺激表位片段插入pCI-HCA661中HCA6 61下游,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒pCI-HCA661-mtHSP70E。结果：HCA661 PCR扩增产物为1 040 bp,mtHSP70表位PCR产物为312 bp,测序结果均分别与GenBank登记的序列完全相同。PCR和酶切鉴定结果表明,构建的重组真核表达质粒 pCI-HCA661-mtHSP70刺激表位中含有正确编码的融合基因片段。结论：成功构建含有人肝细胞癌相关抗原HCA661-mtHSP70刺激表位的融合基因疫苗。     

日本血吸虫混合DNA疫苗的构建

构建「日本血吸虫混合ＤＮＡ疫苗，为今后多抗原特异ＤＮＡ轩的研究打下基础。在克隆ｐＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ－Ｓｊ２３，ｐＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ Ｓｊ２６，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－３２的基础上，亚克隆构建了真核表达载体ｐＢＫ－２Ｊ２３，ｐＢＫ－Ｓｊ２６，ｐＢＫ－Ｓｊ３２。经过酶切鉴定，ＰＣＲ扩增鉴定及测序后，将此三种不同抗原质粒经不同组合后经肌肉注射免疫小鼠。３周后提取小凤四头肌ＤＮＡ，特异性引物扩增获得目     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)强制泛素(Ub)化的DNA疫苗表达质粒.方法 以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBV pADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1(-),并行酶切鉴定和基因测序.结果 构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的 基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致.结论 成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗.     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）强制泛素（Ub）化的DNA疫苗表达质粒。方法以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBVpADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1（-）,并行酶切鉴定和基因测序。结果构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致。结论成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗。     

肿瘤睾丸抗原在肝细胞癌中的研究进展

肿瘤睾丸抗原(CTA)是一组肿瘤相关抗原,在不同癌症中均有表达,而在睾丸除外的正常组织中不表达.由于CTA呈现限制性表达模式,并具有引起患者产生免疫应答的能力,使CTA成为肿瘤免疫治疗中有应用前景的一类抗原.有研究表明在肝细胞癌(HCC)患者组织和外周血样品中存在CTA的表达,而癌旁组织和正常肝组织中均未表达,为CTA...     

乙肝核心抗原DNA疫苗的构建及其免疫原性分析

构建ＨＢＶ核心抗原ＤＮＡ疫苗,并探讨基实验动物内的表达及其免疫原性。方法：采用ＰＣＲ法从ＨＢＶ全基因ＤＮＡ中获得核心抗原ＤＮＡ片段,并将其重组到ｐｃＤＮＡ３载体。以此为候选疫苗分别免疫小鼠和树Ｊｕ,并检测其抗ＨＢｃＩｇＧ。结果：构建了乙肝核心抗原候选核酸疫苗ｐｃＤＮＡ３－ＨＢｃ。免疫接种该疫苗后第２周抗ＨＢｃＩｇＧ水平开始升高,小鼠至第９周,树Ｊｕ至第７周升至峰值。结论：构建ｐｃＤＮＡ３－ＨＢＣｄ     

全长细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及DNA疫苗的构建

目的：克隆分析新疆地区细粒棘球蚴95（Eg95)抗原全长基因的结构特点，并构建Eg95 DNA疫苗。方法：根据细粒棘球蚴95抗原基因序列设计PCR引物，应用PCR方法从新疆株细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95全长抗原目的基因。利用定克隆技术将全长Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上，构建DNA疫苗pcDNA3-Eg95，测序确定基因碱基序列。利用DNAman软件及GeneBank/Blast功能，对其进行基因全序列分析及同源性比较。结果：从新疆株细粒棘球蚴cDNA文库中克隆均为正确连接全长Eg95抗原基因的重组质粒，可作为DNA疫苗作进一步的研究。新疆株全长Eg95抗原基因与GeneBank中已登录的新西兰株Eg95抗原基因序列一致。结论：成功克隆并构建了新疆株全长细粒棘球蚴95抗原基因DNA疫苗。     

乙型肝炎病毒核心抗原DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性观察

目的 :观察乙型肝炎病毒核心抗原 ( HBc Ag) DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性。方法 :肌内注射法接种 HBc AgDNA疫苗 ;EL ISA法检测小鼠和猕猴血清抗 - HBc Ig G终点滴度和 Ig G亚类水平 ;51铬释放法测定小鼠脾细胞 HBc Ag特异性细胞毒性T细胞 ( CTL )活性 ;EL ISA法检测猕猴外周血单个核细胞 ( PBMC)培养上清中 IFN -γ及 IL - 4水平 ;3H - Td R掺入法检测猕猴PBMC HBc Ag特异性增殖反应。结果 :小鼠和猕猴经接种该 DNA疫苗后均产生高滴度抗 - HBc抗体 (分别达 1∶ 3 2 80 5 0和1∶ 10 93 5 0 ) ;小鼠抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2 a为主 ,猕猴抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2占优势 ( Ig G1/Ig G2 <1) ;小鼠的 HBc Ag特异性CTL杀伤活性达 5 0 %以上 ;猕猴 PBMC培养上清中 ,IFN-γ水平与 IL - 4相比占明显优势 ( 15 .63 pg/ml vs <3 .13 pg/ml) ,猕猴PBMC抗原特异性增殖反应阳性 (刺激指数 =2 .12～ 3 .83 )。结论 :HBc Ag DNA疫苗对小鼠和猕猴均具有良好的体液免疫和细胞免疫原性。     

自身血清抗体筛选人肝细胞癌抗原的分子辨认

新近发展起的重组克隆表达抗原的血清学鉴定（ＳＥＲＥＸ）技术已成功证明了几种新的人肿瘤抗原［１］。此方法在肿瘤抗原与病人自身血清反应的基础上可直接确定抗原分子，这比传统的基因法和生物化学法前进了一步。我们使用此法在肝细胞癌也筛选出一系列特异抗原或相关抗...     

肝细胞癌HLA-DR抗原的表达及干扰素对其增强作用

目的　探讨人白细胞 DR抗原 (HL A- DR)在人原发性肝细胞癌 (简称肝癌 )的表达情况 ,以及干扰素 (IFN)对其调节作用 .方法　分别采用免疫组化 ABC法和流式细胞仪检测 HL A- DR在 46例人肝癌组织和 4种培养的人肝癌细胞系 (SMMC- 772 1,HCC- 92 0 4,BEL- 740 2和 HHCC)的表达情况 ,并用 EL ISA法分别检测 IFN-γ或 IFN-α刺激前后 HL A-DR在上述 4种肝癌细胞系以及正常人肝细胞系 QZG的表达情况 .结果　 39.1% (18例 / 46例 )的肝癌组织肿瘤细胞可表达 HL A- DR,而在癌旁非肿瘤细胞均为阴性 ;4种肝癌细胞系都基本不表达 HL A- DR;IFN- γ或 IFN- α刺激之后 ,上述 5种细胞系的 HL A- DR表达都有所增强 ,并且 QZG不如肝癌细胞明显 ,IFN-γ的作用强于 IFN-α.结论　肝癌组织在一定程度上可表达 HL A- DR,但是培养的肝癌细胞系基本上不表达 ;IFN可以上调肝癌细胞对 HL A- DR的表达 .     

人B7-1转基因肝癌瘤苗的制备

目的:制备人B7-1(hB7-1)转基因肝癌瘤苗.方法:用逆转录病毒转移系统将hB7-1基因导入人肝癌细胞株HepG2,并用RT-PCR、PCR-Southern杂交法检测转染空载体 pLXSN的HepG2/neo细胞和转染重组质粒pLXSN/hB7-1的HepG2/hB7-l细胞中hB7-1 mRNA表达;间接免疫荧光法检测HepG2细胞、HepG2/neo细胞、HepG2/hB7-1细胞形态,计算当日细胞绝对数,绘制生长曲线.结果:所建立的肝癌瘤苗(HepG2/hB7-1)细胞可高效表达hB7-1分子.基因转染对HepG2细胞的生长形态及生长曲线无明显影响.结论:逆转录病毒基因转移系统是使肝癌细胞高效表达hB7-1分子的有效途径.     

CEA迷你基因串联体肿瘤疫苗的构建

目的：构建人癌胚抗原（CEA）的迷你基因串联体肿瘤疫苗。方法：通过PCR从人基因组中得到一段来源于CEA的DNA序列,其中包含两个编码辅助性T细胞（HTL）表位的迷你基因,插入pGEM-T easy载体后测序,再将目的基因以同尾酶连接的方式顺次定向亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.0中,得到三串联体,以 PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒 pc DNA3.0-triCEA_625-667。结果:PCR和酶切结果表明,获得的目的基因与所选的基因片段 CEA_625-667中包含的碱基数量吻合,且带有正确的酶切位点。测序结果与GenBank登记完 全相同。构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的经同尾酶连接的目的基因片段三倍体。结论：成功地构建了含有CEA_625-667基因三串联体的DNA疫苗。     

HIV多抗原表位疫苗的构建

以CD8^＋的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和CD4’的辅助性T淋巴细胞（HTL）为介导的细胞免疫应答是有效地控制和清除包括HIV在内的多种病毒病原体的必备条件。因而，人们对于能够诱导CTL和HTL免疫应答的HIV-1疫苗的研究兴趣浓厚，使HIV疫苗很快由学术研究向商品开发和工业生产等领域过渡和延伸。     

肝细胞癌患者癌和癌旁组织中Fas抗原和bcl-2表达的研究

目的：探讨人体肝细胞癌患者癌及癌旁组织中Ｆａｓ抗原的原位表达、分布，并与抗凋亡基因产物ｂｃｌ－２蛋白比较，探讨Ｆａｓ抗原在肝细胞癌形成过程中的生物学意义。方法：用免疫组织化学方法检测２０例患者的肝细胞癌及癌旁组织中Ｆａｓ抗原和ｂｃｌ－２蛋白的原位表达。结果：１８例癌组织中有Ｆａｓ表达，大多数表现为胞质阳性，所有癌旁组织均见Ｆａｓ表达，阳性可见于胞质及胞膜，炎细胞浸润明显之汇管区及纤维间隔附近的肝细胞阳性表达有所增强。ｂｃｌ－２在１９例ＨＣＣ和所有癌旁组织均有表达；胞质着色，癌组织较癌旁表达为弱。结论：人体肝癌组织有Ｆａｓ表达，以胞质阳性为主，癌旁组织胞质及胞膜均有表达，与淋巴细胞浸润关系密切，ｂｃｌ－２的表达并不减弱细胞Ｆａｓ的表达，二者在ＨＣＣ的发生过程中可能有着独立的作用机制并起了一定的作用。     

原发性肝癌内HBV DNA及HBAg的分布与意义

采用原位分子杂交和免疫组化及双标记技术,对44例原发性肝细胞肝癌及痛旁肝组织进行了乙型肝炎病毒DNA及其表达产物x抗原、核心抗原检测。癌组织中HBV DNA、HBxAg、HBcAg检出率分别为70.5％、65.9％及20.5％;癌旁肝组织依次为76.5％、76.5％及29.4％。HBV DNA及HBxAg主要位于肝细胞浆中,在HBcAg阳性组中的检出率高于HBcAg阴性组(P<0.05)。9例枯否氏细胞浆有HBxAg检出。HBVDNA在癌及癌旁组织中的检出有“伴随现象”。HBcAg多位于核内,部分为核浆型,且总是伴随HBV DNA和(或)HBxAe检出,无一例单独检出HBcAg者。此外,HBxAg可由肝内游离型HBV DNA所表达;肝内核型或浆型HBcAg均可反映HBV的复制。因此,肝内HBxAg的检测可作为HBV感染的灵敏指标之一,进一步证实HBV感染与HCC的发生有密切关系。     

结核杆菌ＥＳＡＴ-６抗原多表位ＤＮＡ疫苗的构建与表达

目的:构建含3个结核杆菌ESAT-6抗原T细胞表位及Fh3配体基因的重组质粒,并使其在大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)中表达.方法:用计算机软件预测结核杆菌ESAT-6抗原的T细胞表位谱,选取3个T细胞表位,并以Ala-Ala-Tvr(AAY)序列作为接头,合成全基因序列,定向克隆入真核双表达载体pIRES及质粒plRES-FL.在酶切分析与序列测定后.用PEI转染至GMCs细胞,并行Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,Western blot证实该重组质粒能在体外GMCs细胞中表达融合蛋白.结论:成功构建了结核杆菌ESAT-6抗原多表位基因重组质粒.