小鼠A细胞介素21原核表达载体的构建及活性鉴定

目的：白细胞介素21是近年发现的由T细胞分泌的细胞因子，具有广泛的免疫调节作用和抗肿瘤活性。为进一步观察其体内外免疫作用，拟构建小鼠白细胞介素21（mlL-21）原核表达载体，并对其表达的活性进行鉴定。 方法：实验于2006—03／2007—05在南京医科大学附属南京儿童医院儿科研究所和东南大学基础医学院病原生物学与免疫学系完成。实验材料：实验中所用BALB／c小鼠由扬州大学比较医学中心提供，六七周龄，雌雄兼备，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。pcDNA3．1／mlL-21质粒由东南大学基础医学院免疫学实验室提供。实验方法：以pcDNA3．1／mlL-21质粒为模板，PCR获得长度为369bp的mlL-21基因片段。将其定向克隆至pET-28a（＋）质粒中，采用PCR酶切和测序等方法对重组质粒进行鉴定。并对重组蛋白进行IPTG诱导表达、Western blot及体外生物学活性检测。 结果：构建了重组原核表达载体pET-28a（＋）／mlL-21，经鉴定后证实重组质粒构建正确。SDS-PAGE显示含重组质粒的诱导菌在M16000位置出现一蛋白条带。Western blot结果显示该蛋白具有良好的免疫原性。体外生物学功能检测显示该重组蛋白能够增强小鼠脾细胞中的NK细胞杀伤活性。 结论：成功构建了重组原核表达载体pET-28a（＋）／mlL-21，表达的mlL-21具有良好的免疫原性。     

血浆白细胞介素17和白细胞介素21在免疫相关性血液病患者中的表达及其临床意义

目的分析辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)分泌的白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)、白细胞介素21(interleukin 21,IL-21)在3种免疫相关性血液病(immuno related hematopathy,IRH)治疗前后表达水平的变化情况,探讨其临床意义。方法选取2017年5月至2018年10月河北北方学院附属第一医院血液内科收治的门诊及住院的IRH患者60例作为观察对象。将60例观察对象分为再生障碍性贫血组(24例)、免疫性血小板减少症组(20例)和自身免疫性溶血性贫血组(16例)。另选取同时期在本院体检的健康志愿者60名作为对照组。IRH 3组患者分别采用糖皮质激素或免疫制剂等方案对症治疗;对照组服用维生素C。4组受检者均在初诊时、IRH患者治疗2周及3个月接受血液相关指标的检查,并比较治疗前后4组外周静脉血血浆IL-17、IL-21和不同阶段的疗效。结果初诊时,再生障碍性贫血组、免疫性血小板减少症组、自身免疫性溶血性贫血组血浆IL-17分别为(196.52±17.46、185.69±18.19、126.13±11.22)ng/L,分别较对照组(72.36±10.21)ng/L高,差异比较均有统计学意义(P均<0.05);再生障碍性贫血组、免疫性血小板减少症组、自身免疫性溶血性贫血组血浆IL-21浓度分别为[(136.82±20.16、145.92±22.18、119.66±12.69)]ng/L,分别较对照组(84.01±9.87)ng/L高,差异比较有统计学意义(P<0.05);治疗2周,3组的IL-17、IL-21浓度与初诊时相比均明显降低(P均<0.05);治疗3个月,3组IL-17、IL-21浓度与初诊时相比也显著降低(IL-17:再生障碍性贫血组(84.69±12.15)ng/L,免疫性血小板减少症组(90.56±11.64)ng/L,自身免疫性溶血性贫血组(62.83±5.68)ng/L;IL-21:再生障碍性贫血组(96.28±8.84)ng/L,免疫性血小板减少症组(103.21±10.62)ng/L,自身免疫性溶血性贫血组(78.64±9.68)g/L,差异有统计学意义(P均<0.05),对照组(83.84±9.95)ng/L则无显著变化(P>0.05)。治疗3个月,3组患者治疗总有效率[再生障碍性贫血组83.33%(20/24)、免疫性血小板减少症组90.00%(18/20)、自身免疫性溶血性贫血组75.00%(12/16)]均较治疗2周[再生障碍性贫血组41.67%(10/24)、免疫性血小板减少症组40.00%(8/20)、自身免疫性溶血性贫血组25.00%(4/16)]提高,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论血浆中IL-17、IL-21表达水平的改变有助于提示免疫相关性血液病的发生和进展,寻找治疗靶点、促进预后改善,在不同类型的IRH的临床诊断、病情预测和治疗中具有重要临床意义。     

小鼠白细胞介素-1cDNA的克隆及逆转录病毒载体的构建

目的：克隆小鼠白细胞介素-1cDNA(IL—1cDNA)，构建小鼠IL-1cDNA逆转录病毒载体。方法：利用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)，从小鼠胸腺细胞中扩增出小鼠IL-1cDNA，克隆到测序载体pBluseript中．测序后．再亚克隆到逆转录病毒载体pLNCX中。结果：RT-PCR扩增出约518bp片段，经酶切鉴定显示小鼠IL-1cDNA逆转录病毒载体(IL-1pLNCX)构建成功。结论：小鼠IL-1cDNA与已发表的其他种小鼠的序列相同，IL-1cDNA可能无种间差异。为进一步研究IL-1在中枢神经系统病理状态下的作用机制提供了有利的研究工具。     

p21Ha-ras原核表达载体的构建、表达及纯化的研究

目的：构建PET-28a（＋）Ha-ras原核表达质粒，并表达、纯化得到p21ras蛋白，为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及p21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定基础。方法：培养人肝癌细胞株7703，提取总RNA，通过RT-PCR特异扩增出Ha-ras cDNA，然后应用TA克隆策略将纯化后的Ha-ras插入至中间载体pMD18-T vector中得到重组质粒PMD-18T vector-ras．重组质粒PMD-18T vector-Ha-ras经过BamH I和Hind Ⅲ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的Ha-ras cDNA．将PET-28a（＋）同样经过BarnH I和Hind Ⅲ双酶切后纯化回收得到与ras cDNA相同的黏性末端的线形质粒片段，将具有黏性末端的ras cDNA与酶切后的PET-28a（＋）定向连接，构建出重组质粒PET-28a（＋）-Ha-ras，经酶切鉴定，并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的PET-28a（＋）．Ha-ras转入感受态BL-21（DE3）中诱导表达，利用组氨酸“标签”（His-Tag）对p21ras进行金属螯合亲和层析纯化。结果：测序分析证实，克隆入PET-28a（＋）的Ha-ras序列与Genbank登录号为“NM_005343”的Ha-ras cDNA序列一致，将重组质粒PET-28a（＋）．Ha-ras转化BL21（DE3），用IPTG诱导目的蛋白表达。SDS、PAG和蛋白纯化结果表明，PET-28a（＋）-Ha-Ras在E-coli中获得可溶性高表达，经Ni-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的p21ras蛋白。结论：成功构建了原核表达载体PET-28a（＋1）-Ha-ras，并经表达、纯化得到活性形式的p21ras蛋白，从而为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及P21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定了基础。     

小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化

背景：次级淋巴组织趋化因子（secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC/CCL21）是近年来发现的,具有免疫调节作用及抗肿瘤活性。目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达重组蛋白。方法：取C57BL/6小鼠淋巴结细胞,体外用Poly（I：C）刺激后提取RNA并反转录,以此cDNA为模板,通过PCR技术扩增出CCL21成熟蛋白编码序列。克隆入原核表达载体pBEn-SBP-SET1a,构建融合表达载体pBEn-CCL21。将表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后TRICINE-SDS-PAGE电泳分析和鉴定重组蛋白的表达。CCL21融合蛋白经链霉亲和柱层析纯化。结果与结论：实验成功构建了CCL21基因的原核表达载体pBEn-CCL21,并获得相应的融合蛋白。结果显示CCL21可在大肠杆菌中高效表达,经链霉亲和柱层析纯化即可获得CCL21重组目的蛋白。     

小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化◆

背景:次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC/CCL21)是近年来发现的,具有免疫调节作用及抗肿瘤活性.目的:构建小鼠次级淋巴组织趋化因子原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达重组蛋白.方法:取C57BL/6小鼠淋巴结细胞,体外用Poly(I:C)刺激后提取RNA并反转录,以此cDNA为模板,通过PCR技术扩增出CCL21成熟蛋白编码序列.克隆入原核表达载体pBEn-SBP-SET1a,构建融合表达载体pBEn-CCL21.将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后TRICINE-SDS-PAGE电泳分析和鉴定重组蛋白的表达.CCL21融合蛋白经链霉亲和柱层析纯化.结果与结论:实验成功构建了CCL21基因的原核表达载体pBEn-CCL21,并获得相应的融合蛋白.结果显示CCL21可在大肠杆菌中高效表达,经链霉亲和柱层析纯化即可获得CCL21重组目的蛋白.     

小鼠白细胞介素10重组腺病毒载体构建及对树突状细胞的基因修饰

背景:对于抗原递呈细胞树突状细胞及其分泌的细胞因子白细胞介素10在气道高反应性和炎症中的作用国内外文献报道较少.目的:构建小鼠白细胞介素10腺病毒重组体Ad-mIL-10,获得小鼠白细胞介素10基因修饰的树突状细胞,以期为下一步基因治疗的动物实验打下基础.方法:通过人工合成获得小鼠白细胞介素10基因,根据白细胞介素10基因序列及腺病毒载体的多克隆位点,合成包括酶切位点的基因序列,连接到pMD18-T载体并测序鉴定.用基因工程的方法将小鼠白细胞介素10基因克隆到BDAdeno-X~(TM)腺病毒载体,于人胚肾293细胞中包装、扩增病毒并测定白细胞介素10蛋白表达,转染到体外培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞.结果与结论:成功构建了小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并高包装、扩增成功,测定高表达白细胞介素10蛋白,体外成功培养小鼠骨髓来源的小鼠树突状细胞并顺利转染Ad-mIL-10.提示用基因工程方法构建小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并转染小鼠骨髓来源的树突状细胞是可行的,可为进行相关基因治疗的可能性提供更充足的理论依据.     

人白细胞介素—7基因克隆及表达

在人骨髓基质原代培养细胞ｍＲＮＡ中，利用ＲＴ－ＰＣＲ和克隆技术，获得了白细胞介素－７基因的编码区片段，经测序证实此克隆片段包含了完整的ＩＬ－７编码区基因共５３８个碱基。使原核表达技术，已使该基因在大肠肝菌中得到了初步表达。     

SPACR原核表达载体的构建和表达

目的构建Sialoprotein associated with cones and rods（SPACR）原核表达载体并高效表达。方法根据基因文库中SPACR基因的cDNA序列设计引物,采用PCR方法扩增SPACR cDNA片段,并克隆进原核表达载体pGEX-6P-1中,转化于大肠杆菌BL21,测序鉴定后,用IPTG诱导表达出目的蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖柱柱层析纯化,收获表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果 PCR后扩增得到的目的片段,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pGEX-6P-1-SPACR构建正确,表达蛋白分子量约为分别为21.2、22.6、36.2及20.8kDa。结论在大肠杆菌中获得了SPACR片段的高效表达,为研究其蛋白功能奠定了基础。     

重组人单链白细胞介素12融合基因的构建、真核表达及生物学活性测定

目的 探讨用生物学技术获取具有生物学活性的重组人白细胞介素１２（ｒｈＩＬ－１２）的方法。方法 从经佛波醇酯（ＰＤＢｕ）刺激的ＥＢ病毒转化的人Ｂ淋巴母细胞株ＮＣ－３７中提取ｍＲＮＡ,经逆转录－聚合酶链反应分别获得ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位编码序列的ｃＤＮＡ,运用重组聚合酶链反应技术。将两段基因通过多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＤＮＡ序列连接后进行基因重组,构建了重组人单链ＩＬ－１２融合基因（ｒｈ－ｓｃＩＬ－１２）。进一步将ｒｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１（＋）真核表达载体中,构建ｒｈｓｃＩＬ－１２真核表达载体「ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｒｈｓｃＩＬ－１２」,转染ＣＯＳ－７细胞,结果 经Ｇ４１８筛选获ＣＯＳ－ｒｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白稳定表达株,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白相对分子质量为７     

重组人载脂蛋白A5原核表达载体的构建及分析鉴定

目的构建重组人载脂蛋白A5(apoA5)原核表达载体,为进一步制备抗apoA5的单/多克隆抗体奠定基础。方法从人肝癌组织中抽提总RNA,以此为模板,逆转录降度PCR扩增载脂蛋白A5编码区基因全长,构建含有目的片段的克隆载体pPCR-ScriptampSK(+)-apoA5及原核表达载体pET16B-apoA5,通过酶切、测序及诱导表达等验证重组质粒的准确性。结果PCR扩增出1.1kb特异性片段,克隆至pPCR-ScriptampSK(+)后测序,结果表明序列同源性与genebank报道一致,重组质粒pET16B-apoA5经双酶切后电泳显示约为5.7kb和1.1kb的片段,酶切图谱与预期一致,诱导表达蛋白的大小与预期一致。结论成功构建了重组人载脂蛋白A5的原核表达载体。     

Siglec-9V型结构域原核表达载体的构建、鉴定和初步表达

目的 构建重组Siglec-9 V型结构域(Siglec-9-V)原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,初步摸索其可溶性表达的条件,为进一步研究其生物学意义奠定基础.方法 合成Siglec-9-V的cDNA序列;通过PCR和TA克隆,构建重组表达载体pET-His6-SUMO-Siglec-9-V,利用酶切和DNA测序鉴定插入序列;将重组细菌用IPTG诱导表达,利用His6标签蛋白特异性染料鉴定蛋白质;通过尝试不同的诱导表达温度,摸索Siglec-9-V可溶性表达的条件.结果 证实重组表达载体pET-His6-SUMO-Siglec-9-V构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约为29×103,证实为目的 蛋白,在24 ℃时经IPTG诱导,能够实现可溶性表达.结论 成功构建了重组表达载体pET-His6-SUMO-Siglec-9-V,实现Siglec-9-V的可溶性表达.     

新型骨形态发生蛋白2反转录病毒载体的构建及活性检测

背景:骨形态发生蛋白是一种具有潜在活性的蛋白质,当骨组织损伤时其迅速增加并活性的增强,与载体复合能修复动物骨缺损,但将其用做基因治疗的研究未见报道.目的:构建表达重组人骨形态发生蛋白2基因的重组反转录病毒载体,探讨其在成骨细胞中的生物学作用.方法:根据Genbank中人骨形态发生蛋白2基因序列设计并合成骨形态发生蛋白2特异性引物,高保真PCR扩增骨形态发生蛋白2基因,同源重组法将骨形态发生蛋白2 PCR片段连接与克隆载体pDNR-CMV,构成pDNR-CMV-BMP2,经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和反转录病毒空质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成反转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染入包装细胞PT67进行病毒包装,并用NIH3T3细胞进行病毒滴度测定;将反转录病毒感染人成骨细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长变化,转染48 h后Western blotting检测骨形态发生蛋白2蛋白表达.结果与结论:pDNR-CMV-BMP2质粒Sall和EcoRI双酶切、PCR及测序结果均正确,重组质粒pLP-LNCX-BMP2经氯霉素及蔗糖筛选得到的阳性克隆骨形态发生蛋白2 PCR结果阳性,酶切产物与预期相一致;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,G418筛选可得到稳定细胞克隆,其上清液中病毒滴度可达到5×10~8pfu;四甲基偶氮唑盐检测中反转录病毒组与正常对照组相比,72 h细胞抑制率无明显差别(P＞0.05),转染48 h后Western blotting可见骨形态发生蛋白2蛋白高表达.结果说明,实验成功克隆了骨形态发生蛋白2基因并构建其反转录病毒表达载体.     

金属硫蛋白非融合性原核表达载体的构建

目的：构建表达金属硫蛋白（metallothionein，MT）的非融合性原核表达载体。方法：以大肠杆菌BL21中的PET-GST—MT质粒为模板，PCR扩增目的片段，双酶切，胶回收纯化，连接至pGEM—T载体扩增，双酶切，亚克隆至pBV220载体．转入大肠杆菌DH-5α中。结果：PCR产物大小符合要求．重组质粒PBV220-MT双酶切鉴定与其一致，测序结果正确。结论：成功构建MT原核表达载体，为下一步从DH-5α-pBV220-MT工程菌中表达并纯化非融合性MT打下基础     

慢病毒介导TIEG1基因乳腺癌靶向载体的构建及活性测定

目的:构建慢病毒介导的TIEG1基因乳腺癌特异性靶向载体,并鉴定其活性。方法:将乳腺癌特异性survivin启动子片段和TIEG1基因先后克隆进带有绿色荧光蛋白的慢病毒载体中,构建survivin启动子驱动的TIEG1基因慢病毒表达载体,酶切及测序鉴定。包装纯化慢病毒颗粒,感染人脐静脉内皮细胞HUVEC和乳腺癌细胞SK-BR-3,观察绿色荧光蛋白的特异性表达。结果:成功构建带有肿瘤特异性survivin启动子驱动的TIEG1基因慢病毒表达载体。感染细胞后,乳腺癌SK-BR-3细胞可观察到绿色荧光表达,而人正常脐静脉内皮细胞基本无表达。半定量RT-PCR证实TIEG1基因在乳腺癌SK-BR-3细胞中过表达。结论:构建的survivin启动子驱动的慢病毒表达载体具有一定的肿瘤特异性,将为实现以慢病毒为载体的TIEG1基因肿瘤靶向治疗提供良好的实验基础。