靶向PCNA基因的小干扰RNA对鼻咽癌CNE2细胞周期的影响

目的： 研究小干扰RNA抑制PCNA基因表达后对鼻咽癌CNE2细胞株增殖及细胞周期的影响。方法: 利用体外合成法合成针对PCNA基因的小干扰RNA(siRNA)序列,应用脂质体转染鼻咽癌CNE-2细胞,实时定量PCR(real-time PCR) 和免疫组织化学法观察siRNA干扰后细胞中PCNA mRNA水平和PCNA蛋白表达,倒置相差显微镜观察转染前后CNE2细胞的生长变化,流式细胞仪检测siRNA干扰后的细胞周期。结果: 在siRNA转染CNE2细胞后,细胞增殖受到抑制,蛋白表达不同程度降低,对PCNA mRNA水平的抑制达98.5%,细胞周期在G0/G1停滞。结论: siRNA可在鼻咽癌中有效发挥RNA干扰效应,抑制PCNA mRNA及蛋白表达,降低PCNA活性,抑制鼻咽癌细胞增殖,为鼻咽癌基因治疗提供了新的方法。     

ALC1/CHD1L与OV6在肝癌细胞中的共存及其对干性相关转录因子表达的影响

目的探讨ALC1/CHD1L与OV6阳性肝癌细胞的关系及其对干性相关转录因子表达的影响。方法细胞免疫荧光标记方法观察肝癌Huh7及Hep G2细胞中ALC1/CHD1L和OV6的表达及定位;q RT-PCR检测ALC1/CHD1L sh RNA干扰后对肝癌Huh7及Hep G2细胞干性相关分子Oct4、Sox2、Nanog、Bmi1、β-catenin表达的影响。结果细胞免疫荧光标记结果显示肝癌Huh7细胞和Hep G2细胞中均有ALC1/CHD1L与OV6的表达,两者共表达率为34.3%及48.34%;ALC1/CHD1L sh RNA干扰及q RT-PCR实验结果显示敲减Huh7及Hep G2细胞ALC1/CHD1L表达可引起Oct4、Sox2、Nanog、Bmi1、β-catenin等干性相关分子表达下降,与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05)。结论肝癌Huh7及Hep G2 OV6阳性细胞中有ALC1/CHD1L表达;敲减ALC1/CHD1L表达可引起Huh7及Hep G2细胞干性相关分子Oct4、Sox2、Nanog、Bmi1、β-catenin表达明显下调。     

靶向敲低核蛋白1抑制HepG2肝癌细胞的增殖及迁移

目的观察应激相关核蛋白1(Nupr1)在不同肝癌细胞系中的表达,通过靶向敲低Hep G2肝癌细胞Nupr1,观察其对肝癌细胞增殖及迁移的影响。方法通过实时定量PCR检测BEL-7402、QSG-7703、SMMC-7721、Hep G2肝癌细胞中Nupr1的表达。采用RNA干扰技术敲低Hep G2细胞中Nupr1的表达,通过MTT法及集落形成实验比较细胞的增殖能力的变化,用流式细胞术进行细胞周期分析,利用TranswellTM实验观察Nupr1对细胞迁移能力的影响。结果 Hep G2人肝癌细胞中Nupr1的表达显著高于其他肝癌细胞系。靶向Nupr1的2个短发夹RNA(shRNA)均能有效敲低Hep G2肝癌细胞中Nupr1的表达,抑制效率分别为72.25%和84.25%。Nupr1表达降低能够抑制细胞增殖,导致细胞周期发生G1期阻滞。Nupr1敲低显著降低细胞的迁移能力及集落形成能力。Western blot结果显示Nupr-1表达降低能够上调细胞周期负性调控因子p21和p27的表达水平。结论靶向敲低Nupr1抑制Hep G2肝癌细胞的增殖及迁移。     

RNA干扰技术阻断α-synuclein基因过表达诱导的α-synuclein蛋白病理性积聚的研究

目的 构建并筛选针对帕金森病致病基因α-synuclein特异、高效的RNA干扰载体,观察应用RNA干扰技术阻断α-synuclein过表达导致α-synuclein蛋白病理性积聚的作用.方法 采用携带H1启动子的PBSHH1质粒,设计并构建针对α-synuclein基因4个可有效表达发夹状RNA的特异性α-synuclein基因干扰载体pSYNi-1、pSYNi-2、pSYNi-3、pSYNi-4,通过限制性内切酶酶切、DNA测序证实后,转染HEK293细胞,应用Western印迹、逆转录-PER观察干扰载体的有效性,筛选特异、高效的RNA干扰载体.采用脂质2000将筛选的最佳α-synuelein-pBSHH1 RNA 干扰载体及野生型α-synuclein-pEGFP真核细胞表达载体共转染HEK293细胞,并设立对照组,48h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达,HE染色观察细胞质内嗜酸性小体的形成.结果 Western印迹、逆转录-PER结果显示,pSYNi-1载体具有高效的RNA干扰抑制作用,效率达69.6%;将α-synuclein-pBSHH1 RNA干扰载体pSYNi-1及野生型α-synuclein-pEGFP真核细胞表达载体转染HEK293细胞,48h后荧光显微镜下观察细胞在波长488 nm蓝色激发光下发出明亮的绿色荧光,其中对照组某些细胞质内出现绿色荧光物质积聚,而转染pSYNi-1干扰组细胞质内绿色荧光物质分布均匀;免疫荧光细胞化学检测结果显示,转染48h后对照组可见α-synuclein免疫阳性产物在胞浆内聚集,转入RNA干扰载体psYNi-1后胞浆内α-synuclein免疫阳性产物分布均匀;HE结果显示,转染48h后,对照组某些细胞质内出现圆形的嗜酸性小体(类Lewy小体)形成;转入RNA干扰载体pSYNi-1后胞浆内未见类Lewy小体形成.结论 RNA干扰技术通过抑制α-synuclein基因的表达,成功阻断了野生型α-synuclein过表达所诱导的α-synuelein蛋白病理性积聚,为最终应用RNA干扰技术临床治疗帕金森病提供了某些依据.     

HMGB1RNAi抑制TGF-β1诱导的A549细胞系EMT

目的探讨HMGB1在肺泡上皮细胞间质转分化中的作用。方法设计并合成针对HMGB1的小干扰RNA(siRNA),体外培养Ⅱ型肺泡上皮细胞系细胞-A549细胞,将细胞分为4组:1)对照组,2)TGF-β1刺激组,3)RNAi组(TGF-β1+HMGB1 siRNA),4)RNAi阴性对照组(TGF-β1+siRNA阴性对照);倒置相差显微镜观察细胞形态学;RT-PCR法检测HMGB1和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达;Western blot法检测α-SMA和HMGB1蛋白表达。结果 TGF-β1刺激组细胞HMGB1和α-SMA的mRNA和蛋白表达均较对照组显著增加(P0.01);RNAi组HMGB1、α-SMA mRNA和蛋白表达均较正常对照组显著下降(P0.01)。结论 HMGB1可能参与了TGFβ1诱导的肺泡上皮细胞转分化。     

乙型肝炎病毒反式激活因子XTP4促进肝癌细胞系迁移和侵袭

目的探讨在肝癌细胞系Hep G2中过表达或干扰XTP4表达对细胞迁移和侵袭能力的影响。方法实验分对照组、过表达组和干扰组,将构建成功的XTP4质粒和化学合成的XTP4小干扰RNA(siRNA)瞬时转染入Hep G2,培养48 h后,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和蛋白印迹(Western blot)检测细胞内XTP4 mRNA和蛋白表达; Snail和NF-κB以及上皮间质转化(EMT)相关分子的表达。并通过细胞划痕愈合实验、Transwell迁移侵袭实验观察细胞迁移侵袭能力。结果成功重培养并提取出XTP4质粒;过表达组XTP4的转录水平和翻译水平均明显高于对照组(P0. 05);迁移和侵袭能力明显增加(P0. 05);下游分子NF-κB、Snail和MMP-9表达均增加(P0. 05);干扰组XTP4的转录水平和翻译水平较对照组均明显降低(P0. 05);迁移和侵袭能力也明显降低(P0. 05);NF-κB、Snail和MMP-9表达减少(P0. 05)。结论乙型肝炎病毒反式激活因子XTP4可促进Hep G2迁移和侵袭,与NF-κB、Snail和MMP-9调节相关,EMT相关分子E-cadherin、N-cadherin可能参与其中。     

抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建与表达

目的:抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建与表达.方法:设计两对引物引入连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamH Ⅰ,采用重叠延伸PCR扩增与构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,亚克隆至pEGFP-N1,转染COS-7细胞,倒置相差荧光显微镜下观察荧光蛋白表达,流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清与乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞A375结合活性.结果:测序表明获得了正确的L-VH-Linker-VL单链抗体基因序列;亚克隆至pEGFP-N1后,表达载体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察转染细胞,及通过流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清,证实抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白在转染细胞中分泌性表达,并能够与天然高表达TfR的细胞特异性结合.结论:抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白真核表达载体构建成功,其表达产物具有与TfR阳性细胞结合的活性.     

Uba-2在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞增殖和侵袭转移能力的影响

目的探讨Uba-2在肝癌组织中的差异表达以及过表达和低表达时其对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 qRTPCR法检测肝癌组织中Uba-2 mRNA的表达;将Uba-2的过表达载体和siRNA表达载体转染至肝癌细胞Hep G2后,MTS实验检测Uba-2对肝癌细胞增殖能力的影响;细胞迁移/侵袭实验检测其对肝癌细胞侵袭转移能力的影响;Western blot法检测肝癌细胞Hep G2中TGF-β1~3及VEGF、Snail蛋白的表达。结果 Uba-2在肝癌组织中呈高表达,与癌旁肝组织中的表达差异有显著性(P0.01),qRT-PCR法检测Uba-2在Hep G2细胞中过表达或低表达;细胞增殖实验数据显示Uba-2表达水平与肝癌细胞Hep G2的增殖能力相关,siRNA干扰沉默Hep G2细胞中Uba-2的表达会抑制其增殖生长,细胞迁移/侵袭实验数据显示Uba-2过表达能促进肝癌细胞Hep G2的侵袭、转移能力,且与阴性对照组细胞相比差异有统计学意义;Western blot结果显示Uba-2的异常表达影响TGF-β2及VEGF、Snail蛋白表达水平。结论 Uba-2基因在肝癌组织中的高表达可能具有促进肝癌细胞增殖及侵袭转移的作用。     

小鼠PDL1-Red2融合蛋白真核表达载体的构建、表达及其效应

目的:小鼠跨膜型PD-L1与红色荧光蛋白(RFP)融合基因真核表达载体的构建、表达与鉴定, 及其效应初步研究.方法:应用基因工程技术构建重组载体, 脂质体转染NIT细胞株, 以流式细胞术(FCM)和倒置相差荧光显微镜检测融合蛋白的表达;采用混合淋巴细胞培养, 以FCM测定脾细胞的增殖反应.结果:融合基因在转染的真核细胞中获得表达, 并呈膜分布, 转染PD-L1/pDsRed2-N1的细胞对淋巴细胞增殖反应有一定的抑制作用, 表明PD-L1/pDsRed2-N1融合蛋白中分子标签未影响PD-L1的结构及其生物学活性.结论:PD-L1与DsRed2融合基因载体构建成功, 表达的融合蛋白具有生物学活性.     

红色荧光蛋白核迁移蛋白shRNA干扰载体的构建

目的:利用红色荧光蛋白(RFP),建立一种直观、快速筛选有效RNA干扰片段的方法.方法:通过分子克隆技术将核迁移蛋白(NUDC)与RFP构建成融合基因,克隆至真核表达载体pDs中,以实现其融合表达;同时,将人U6启动子及9个NUDC的发夹结构分别克隆至上述同一真核载体中,构建成一系列针对NUDC不同干扰位点的RNA干扰载体,通过采用酶切及DNA序列鉴定,然后转染293T细胞,通过荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数.结果:酶切及测序结果证实质粒为所需的序列;荧光显微镜观察结果显示,shNUDC-A的干扰效果最好.结论:成功构建了含RFP的NUDC真核shRNA干扰载体.     

人类P100蛋白表达抑制稳定株的建立及其对HeLa细胞周期的影响

目的构建针对人类P100(hP100)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒,转染后筛选P100表达抑制的稳定细胞株并鉴定其表达情况;同时检测其对细胞周期的影响。方法设计针对hP100基因的siRNA序列,构建pGenesil-shRNA-hP100质粒(smallhairpinRNA,shRNA,小发夹RNA),经测序鉴定后转染入宫颈癌细胞HeLa;经G418筛选出稳定株;Western印迹检测稳定株之抑制率。流式细胞术检测hP100蛋白表达抑制对细胞周期的影响。结果成功构建了针对hP100的siRNA质粒,并用之筛选出hP100蛋白表达抑制的稳定株,瞬时转染及稳定株hP100表达明显降低。流式细胞术显示抑制hP100蛋白表达使G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例降低。结论RNAi(RNA interference,RNA干扰)可持续稳定地抑制人类P100蛋白的表达,人类P100蛋白表达抑制对细胞周期有调节作用。     

SiRNA沉默JAB1表达抑制肝癌细胞增殖

 目的 观察沉默Jab1基因表达对人肝癌细胞HepG-2增殖的影响。方法 利用RNA干扰技术构建PAVU6-JAB1 siRNA干扰质粒,将其转染HepG-2细胞,采用Real-time PCR、Western blot等方法对Jab1表达进行检测,WST-8、流式细胞分析对细胞增殖的影响。结果 成功构建PAVU6- JAB1 siRNA干扰质粒,转染HepG-2细胞后Jab1蛋白表达量较对照组明显降低,P27kip1蛋白表达量明显升高 (P<0.01)。转染96 h后能显著抑制细胞增殖活性,由空载体转染组的99.6%?1.4%降至70.8%?1.6%。结论 构建靶向Jab1基因的干扰质粒能下调Jab1基因的表达,上调P27kip1蛋白水平,并抑制HepG-2细胞在体外的增殖活性。     

稳定过表达的HLrg蛋白对HepG2细胞周期和细胞形态的影响

目的在肝癌细胞系HepG2中稳定过表达HLrg，观察过表达的HLrg蛋白对HepG2的细胞周期和细胞形态等生物学影响。方法构建真核重组表达质粒pcDNA3．1（＋）-hlrg，转染到HepG2细胞并进行稳定筛选；对稳定过表达pcDNA3．1（＋）空载体的对照组、pcDNA3．1（＋）-hlrg的实验组进行观察。Westernblot进行HLrg蛋白的鉴定。流式细胞仪测定细胞周期、MTT法测定生长曲线、透射电子显微镜观测细胞形态的改变。结果获得了稳定过表达pcDNA3．1（＋）-hlrg的HepG2细胞株。与对照组相比，过表达HLrg蛋白的细胞株出现G1阻滞，微绒毛减少，分裂相减少，生长趋缓。结论稳定过表达的Hk蛋白对细胞周期有调节作用，对肝癌细胞HepG2具有生长阻滞的作用。     

Hsp701A的RNA干涉诱导K562细胞凋亡

目的：研究RNA干涉（RNAi）Hsp701A基因的表达及其诱导慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞株K562的凋亡。方法：构建Hsp701A基因小干涉RNA（siRNA）的真核表达载体，转染K562细胞并证实RNAi的有效性。用MTF比色法、AnnexinV-FITC／PI染色和流式细胞术，分别检测K562细胞的增殖、凋亡和细胞周期。结果：构建了Hsp701A siRNA的真核表达载体。将其稳定转染K562细胞后，RNAi组细胞中Hsp701 ARNA和蛋白的表达水平明显下降。Hsp701A siRNA能抑制K562细胞增殖并诱导其细胞凋亡，将其阻滞于G1期。结论：RNAi Hsp701A基因诱导的表达有望成为一种新的慢粒的治疗策略。     

siRNA对卵巢癌细胞周期及EGFR表达的影响

目的体外构建编码人类表皮生长因子受体（EGFR）的小干扰RNA（siRNA）的质粒表达载体,观察其对卵巢癌Skov-3细胞EGFR的特异性抑制作用及对细胞凋亡和周期的影响。方法构建pSilencer-EGFR siRNA真核基因表达载体,采用脂质体介导的方法将其转染到卵巢癌细胞株Skov-3,实验分为以下3组：空白对照组（未经转染的人卵巢癌Skov一3细胞）、非特异性转染组（转染非特异性质粒载体）及特异性转染组。用RT-PCR的方法检测mRNA水平的变化,用免疫荧光法检测EGFR蛋白水平的变化,流式细胞仪检测其对卵巢癌细胞周期及凋亡的影响。结果成功构建pSilencer—EGFR siRNA真核基因表达载体。psiRNA—EGFR质粒明显下调Skov-3细胞中EGFR的表达,阻断细胞周期在G1期,促进细胞凋亡。结论重组质粒psiRNA—EGFR能有效地抑制Skov-3细胞内EGFR的表达、抑制细胞增殖,其抑制机制可能与引起细胞周期再分布、降低S期细胞比例和促进细胞凋亡有关。     

RNA干扰MAGEA3对人肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人肝癌细胞中黑色素瘤相关抗原A3(MAGEA3) 的表达和对肝癌细胞凋亡的影响。 方法:构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，采用脂质体介导的方法将其转染到人肝癌细胞(mel-ed1)中，用Western印迹法、RT-PCR检测MAGEA3基因在肝癌细胞中的表达；通过原位末端标记TUNEL法、DNA片段化及Annexin V /PI双标记法检测，观察其对肝癌细胞凋亡的影响。 结果:成功构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的MEL-ED1细胞中MAGEA3基因表达显著抑制(90%)。与对照组比较, pSilencer-MAGEA3转染组肝癌细胞培养 48 h 后,DNA片段化检测出“DNA ladder”、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征, Annexin V /PI双标检测转染组细胞凋亡率为21.41%±1.98%,明显高于pSilencer-neo 空载体转染组和未转染组(P<0.01)。 结论:MAGEA3小发夹RNA质粒载体可显著抑制MEL-ED1细胞中的MAGEA3基因的表达,促进肝癌细胞的凋亡, MAGEA3基因具有抑制凋亡的作用。该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

RNA干扰MAD2基因对细胞增殖的影响

目的:探讨MAD2对HepG2细胞周期的影响。方法:构建针对MAD2基因的shRNA表达载体,MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒pmad2-EGFP共转染HepG2细胞株,用Western印迹法检测shRNA的抑制效应;用MTT法测定细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果:shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制MAD2绿色荧光融合蛋白的表达。HepG2细胞转染有效干扰质粒48h后,细胞增殖抑制率达65%。有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多。结论:在细胞水平,可通过RNA干扰特异性抑制MAD2基因来抑制细胞的增殖,为研究MAD2基因在细胞增殖中的作用机制奠定基础。     

AIF靶向短发夹RNA干扰重组载体对神经母细胞瘤细胞SHSY5Y的沉默作用

目的探讨AIF基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对神经母细胞瘤细胞(SHSY5YAIF)基因的干扰作用。方法根据siRNA设计原则,构建靶向AIF基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/AIF),使用脂质体法转染人神经母细胞瘤细胞,通过RT-PCR和Wester blot印迹检测神经母细胞瘤细胞AIF基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/AIF重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SHSY5Y细胞后,该细胞的AIFmRNA和蛋白表达明显下降(P0.05)。结论成功构建靶向AIF基因的shRNA表达载体转染神经母细胞瘤细胞,有效抑制AIFmRNA和蛋白表达,为AIF基因靶向治疗提供前期的实验依据。     

大鼠心肌素慢病毒RNA干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞分化的影响

目的: 构建大鼠心肌素(myocardin)慢病毒RNA干扰(RNAi)重组质粒,分析该RNAi质粒的干扰效果及其对血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的影响。方法: 设计并合成3对针对大鼠myocardin的shRNA片段,退火后将双链oligo-DNA克隆入慢病毒质粒载体pGCSIL- GFP获得重组干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd。以pEGFP-N1 / X124G表达载体构建含Flag标签的myocardin表达质粒pEGFP-N1- Myocd。将重组干扰质粒和过表达质粒共转染293T细胞,Western blotting分析Flag标签蛋白的表达,筛选出干扰效率最好的干扰质粒并大量扩增。干扰质粒转染大鼠主动脉VSMCs,RT-PCR和Western blotting检测myocardin及分化标志物SM22α的表达。结果: 成功构建大鼠myocardin的慢病毒干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd和过表达质粒pEGFP-N1-Myocd。上述2种质粒共转染293T细胞后,1号干扰质粒转染组Flag标签蛋白表达下降最显著。将1号质粒进行大包装,获得滴度为1×10¹² TU/L的慢病毒颗粒,该病毒转染VSMCs后,myocardin表达明显下调并伴随分化标志物SM22α表达的显著下降。结论: 成功构建大鼠myocardin慢病毒重组干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd;抑制基因myocardin表达后伴随VSMCs分化的表达下降,提示myocardin在VSMCs分化过程中的重要性。pGCSIL- GFP-shMyocd重组质粒的成功构建为后续研究特定病理条件下(如动脉粥样硬化)VSMCs表型转变的分子机制奠定了基础。     

人SET基因RNA干扰重组质粒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的建立真核质粒载体介导的人SET基因RNA干扰表达体系,并检测其在肝细胞中对SET蛋白表达的影响,为研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性的作用打下基础。方法设计并合成2对人SET基因特异性短发夹RNA（short hair-pin RNA,shRNA）寡核苷酸链,退火形成双链DNA后插入到真核表达质粒psiRNA-hH1 neo中产生shRNA重组质粒载体,经酶切和测序鉴定成功后,转染至L-02肝细胞中,48h后收集细胞提取总蛋白,Western blotting检测干扰后SET蛋白的表达。结果 shRNA重组质粒的酶切和测序鉴定均正确,Western blotting结果显示重组质粒psiRNA1组的干扰效果较好,对SET蛋白表达的抑制率达60%左右,与正常对照组相比,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论成功构建针对人SET基因的RNA干扰真核质粒载体,其能有效地抑制肝细胞内SET蛋白的表达,为深入研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用奠定了基础。