氧化型低密度脂蛋白抑制人内皮细胞组织因子通路抑制子mRNA的表达

为探讨氧化型低密度脂蛋白在血栓形成过程中的作用及机制,用超速离心法从正常人血浆中分离出低密度脂蛋白后,用Ｃｕ＾２＋使之氧化变成氧化型低密度脂蛋白。在人脐静脉内皮细胞的培养基中加入一定深度的低深度脂蛋白或氧化型低密度脂蛋白,培养一定时间后,是硫氰酸胍法抽提细胞总ＲＮＡ,用反转录聚合酶链反应方法检测人脐静脉内皮细胞中组织因子通路抑制子ｍＲＮＡ的表达,以观察氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞表达因子通     

血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因沉默抑制人脐静脉内皮细胞表达分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1

目的探讨血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因沉默后能否抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1的表达。方法分别用不同浓度的氧化型低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共孵育,及预先对人脐静脉内皮细胞转染pGenesil-1 LOX-1 shRNA后再用氧化型低密度脂蛋白刺激,半定量RT-PCR、Western blot及酶联免疫吸附法检测血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1、分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1的mRNA和蛋白表达。结果氧化型低密度脂蛋白能呈浓度依赖性诱导血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1、分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。用RNA干扰抑制血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1的表达后,显著抑制了氧化型低密度脂蛋白诱导的分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。结论氧化型低密度脂蛋白能呈浓度依赖性诱导人脐静脉内皮细胞中分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1表达;这种诱导作用可以被血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因沉默抑制。     

氨氯地平对人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化蛋白1表达的影响

目的为研究氨氯地平独立于降压外的血管保护作用,观察其对人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化蛋白1表达的影响,进一步明确其抗动脉粥样硬化作用的可能机制。方法用不同浓度氨氯地平预处理人脐静脉内皮细胞1h,与氧化型低密度脂蛋白共同孵育24h后,采用逆转录聚合酶链反应检测氨氯地平对体外培养的人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化蛋白1mRNA表达的影响,酶联免疫试剂盒检测培养基中单核细胞趋化蛋白1活性。结果氧化型低密度脂蛋白上调人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化蛋白1的表达,各浓度氨氯地平处理组人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化蛋白1mRNA与蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论氨氯地平呈浓度依赖性抑制氧化型低密度脂蛋白刺激导致的人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化蛋白1表达上调。     

拉米普利酸对氧化型低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞的影响

为探讨血管紧张素转化酶抑制剂拉米普利酸对氧化型低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞是否具有保护作用，采用反转录多聚酶链反应技术来观察拉米普利酸对氧化型低密度脂蛋白诱导培养的人脐静脉内皮细胞ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ的影响，并用Ｇｒｉｅｓｓ法和放射免疫法分别测定拉米普利殴作用前后培养的脐静脉内在细胞一氧化氨和ｃＧＭＰ的含量。结果发现，氧化型低密度脂蛋白促进人脐静脉内皮细胞ｃ－ｍｙｃ表达（Ｐ＜０．０５），明显降低一氧化氨和ｃＧＭＰ含量（Ｐ＜０．０５）。拉米普利酸对氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞：ｃ－ｍｙｃ表达具有抑制作用，并能增加一氧化氨和ｃＧＭＰ水平。拉米普利酸的效应可被一氧化氮合成酶抑制剂硝基－左旋精氨酸部分取消。此结果提示拉米普利酸可促进一氧化氮释放而抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞ｃ－ｍｙｃ过度表达。     

硫化氢对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的探讨硫化氢对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及有关机制。方法人脐静脉内皮细胞分别经不同浓度(25、50、100、200μmol/L)和不同时间(6、12、24 h)硫氢化钠预孵育24 h后加入100 mg/L氧化型低密度脂蛋白处理24 h,Hoechst 33258荧光染色和流式细胞术检测细胞凋亡,罗丹明123染色检测细胞线粒体膜电位变化,双氢罗丹明123染色检测细胞内活性氧的含量变化。结果硫氢化钠预处理能以时间和浓度依赖性的方式抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡(均P<0.01),硫氢化钠或N-乙酰半胱氨酸预先处理能显著阻断氧化型低密度脂蛋白引起的人脐静脉内皮细胞线粒体膜电位降低、活性氧生成增多(均P<0.05)。结论硫化氢能显著抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,其机制与减少细胞线粒体膜电位及降低活性氧生成有关。     

U937源性泡沫细胞形成中组织因子途径抑制物2的表达定位及变化规律

目的研究U937源性泡沫细胞形成过程中组织因子途径抑制物2的表达定位及变化规律。方法采用沉淀法提取人血浆低密度脂蛋白,硫酸铜氧化制备氧化型低密度脂蛋白,与U937单核细胞共同孵育,建立泡沫细胞模型,同时体外培养人脐静脉内皮细胞,加入U937泡沫细胞中共同培养,观察内皮细胞对泡沫细胞形成的影响。采用双重细胞免疫荧光定位组织因子途径抑制物2蛋白,时间免疫分辨荧光定量组织因子途径抑制物2蛋白,逆转录聚合酶链反应和荧光定量聚合酶链反应检测泡沫细胞内组织因子途径抑制物2基因的动态变化。结果组织因子途径抑制物2主要定位于U937单核细胞胞质中,与组织因子有相似的分布。氧化型低密度脂蛋白作用于U937细胞6h后组织因子途径抑制物2蛋白和基因表达水平持续增高,6h达至峰值而后表达持续降低。氧化型低密度脂蛋白作用于人脐静脉内皮细胞后组织因子途径抑制物2蛋白表达增加,24h时达至峰值。加入内皮细胞可改善氧化型低密度脂蛋白抑制U937细胞表达组织因子途径抑制物2的作用。结论U937泡沫细胞形成过程中,体外培养的人源性单核细株胞U937上存在组织因子途径抑制物2的表达抑制,而与人脐静脉内皮细胞共同培养可改善这种异常。     

氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞Fractalkine表达的影响及机制分析

目的 观察氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞Fractalkine表达的影响并探讨其可能作用机制.方法 采用胰蛋白酶消化法原代培养人脐静脉内皮细胞,取2～5代用于实验,随机分为:①对照组用RPMI1640培养基;②氧化型低密度脂蛋白不同浓度(5、25、50和75 mg/L)组;③氧化型低密度脂蛋白作用不同时间(6、12、24、48和72 h)组;④氧化型低密度脂蛋白+p38MAPK特异性阻断剂SB203580组;⑤p38MAPK特异性阻断剂SB203580组.用RT-PCR及EusA法检测Fractalkine mRNA及蛋白表达水平,用Western blot法检测p38MAPK磷酸化表达水平.结果 ①氧化型低密度脂蛋白在一定浓度范围及作用时间呈时间-剂量依赖方式诱导Fractalkine mRNA及蛋白表达增加,最佳作用时间为48 h,最佳作用浓度为50 mg/L;②与对照组比较,氧化型低密度脂蛋白诱导组人脐静脉内皮细胞p38MAPK磷酸化表达水平显著增加(P<0.05);使用SB203580干预后p38MAPK磷酸化水平明显下降,与氧化型低密度脂蛋白诱导组相比差异有统计学意义(P<0.05).③预先用p38MAPK特异性阻断剂SB203580(20 μmol/L)与内皮细胞共同孵育60 min后,再加入氧化型低密度脂蛋白作用48 h后,Fractalkine表达水平明显降低,与氧化型低密度脂蛋白组比较有统计学差异(P<0.05).结论 氧化型低密度脂蛋白可诱导内皮细胞Fractalkine表达增加,其作用机制可能是通过p38MAPK信号转导通路.     

辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体的表达

目的观察辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体表达的作用。方法培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,随机分组:对照组、低密度脂蛋白(25 mg/L)组、氧化型低密度脂蛋白(255、0和100 mg/L)组和氧化型低密度脂蛋白(50 mg/L) 辛伐他汀(1和10μmol/L)组,通过逆转录聚合酶链反应和Western blot蛋白印迹分析检测血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体mRNA和蛋白的表达,并在相差显微镜下观察细胞形态变化。结果氧化型低密度脂蛋白上调血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体表达(P<0.01),并呈浓度依赖性(P<0.05)。辛伐他汀明显抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体表达(P<0.05),且高浓度组较低浓度组的抑制作用更强(P<0.05)。结论氧化型低密度脂蛋白可能通过血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体导致内皮功能障碍,辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白诱导血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体的表达是其非调脂抗动脉粥样硬化机制之一。     

同型半胱氨酸对血管内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1 mRNA表达及氧化型低密度脂蛋白摄取的影响

为了研究同型半胱氨酸对血管内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA表达及对氧化型低密度脂蛋白摄取的影响，分别在培养的人脐静脉内皮细胞中加入不同浓度的同型半胱氨酸孵育48h后，利用逆转录-聚合酶链反应检测血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA表达的改变；采用放射配基法检测细胞对氧化型低密度脂蛋白的摄取。结果发现，随着同型半胱氨酸浓度的增加。提示同型半胱氨酸能促进脐静脉血管内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA的表达和对氧化型低密度脂蛋白的摄取，此效应可能与同型半胱氨酸致动脉粥样硬化作用有关。     

氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞TET2表达及自噬的影响

目的 观察氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞自噬的影响及其调节机制.方法 氧化型低密度脂蛋白孵育人脐静脉内皮细胞24 h,RT-PCR检测TET2 mRNA表达,Western blot检测TET2以及自噬标记物Beclin 1、LC3的表达.TET2 siRNA转染人脐静脉内皮细胞,Western blot检测Beclin 1、LC3的表达.结果 人脐静脉内皮细胞经不同浓度氧化型低密度脂蛋白孵育24h后,浓度依赖性地下调TET2 mRNA以及蛋白的表达(P＜0.05),并且下调Beclin 1表达以及LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值.TET2 siRNA转染人脐静脉内皮细胞后,Beclin 1表达以及LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值明显降低.结论 氧化型低密度脂蛋白促进人脐静脉内皮细胞自噬,可能与下调TET2表达相关.     

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡时泛素缀合酶和p53的表达

为研究氧化型低密度脂蛋白致U937细胞凋亡时泛素-蛋白酶体通路中泛素缀合酶、p53与泡沫细胞凋亡之间的关系，用氧化型低密度脂蛋白处理人单核细胞U937细胞，诱导其凋亡，采用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测细胞凋亡，逆转录聚合酶链反应检测泛素缀合酶和p53的基因表达；流式细胞术分析泛素缀合酶、载脂蛋白B和P153的蛋白表达。结果发现，氧化型低密度脂蛋白可以诱导U937细胞凋亡，在U937细胞凋亡过程中泛素缀合酶表达降低，p53表达增高，而且细胞内载脂蛋白B也增加。结果提示，泛素缀合酶的表达降低可能使P53和栽脂蛋白B经泛素-蛋白酶体通路的降解减慢．从而引起P53和载脂蛋白B在细胞内积聚．导致U937细胞凋亡。     

氧化低密度脂蛋白对内皮细胞L-精氨酸-NO系统的影响及其机制

目的　探讨氧化低密度脂蛋白 (ox LDL)对内皮L 精氨酸 NO系统的影响及其机制。方法　生化分析方法测定孵育液中亚硝酸盐含量及一氧化氮合酶活性 ,用Western印迹方法测定内皮一氧化氮合酶 (eNOS)的蛋白表达。结果　不同浓度的ox LDL呈剂量依赖性地降低eNOS的蛋白表达 ,抑制NOS活性及内皮产生的NO量 (11.4 4± 1.4 3vs 8.18± 1.0 ,6 .4 5± 0 .99,5 .83± 0 .95 ,P <0 .0 5 ) ,(1.94± 0 .12vs 1.73± 0 .14 ,1.5 7± 0 .11,1.4 6± 0 .12 ,P <0 .0 5 ) ,预先加入血凝素样氧化低密度脂蛋白受体 (LOX1)抑制剂阻断了ox LDL的上述作用。结论　ox LDL损伤内皮细胞 ,导致内皮L 精氨酸 NO系统的改变 ,LOX1介导了ox LDL的这一作用     

Caveolin-1表达对血管平滑肌细胞胆固醇逆转运的调节作用

通过观察天然和氧化型低密度脂蛋白对细胞内胆固醇转运蛋白caveolin 1表达的影响 ,探索动脉粥样硬化发生过程中血管平滑肌细胞胆固醇逆转运的分子机制。运用Western印迹、逆转录—聚合酶链反应等方法观察天然和氧化修饰的低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞caveolin 1表达的影响及其差异 ;运用反义寡核苷酸技术和高效液相色谱、放射性胆固醇标记法等方法初步判断下调caveolin 1表达对血管平滑肌细胞胆固醇流出的影响 ;运用外源基因导入技术观察caveolin 1过度表达对氧化型低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞内胆固醇聚集的调节作用。结果发现 :①以正常的未修饰低密度脂蛋白 (5 0mg L)与血管平滑肌细胞孵育 96h ,caveolin 1表达增加 6 0 .2 %± 3.9% ,胆固醇流出率为 81.7%± 4 .3% ;而在相同量的氧化型低密度脂蛋白刺激下 ,caveolin 1表达减少了 5 4 .7%± 5 .8% ,胆固醇流出率下降至 2 6 .8%± 5 .1%。②caveolin 1反义寡核苷酸预处理血管平滑肌细胞 ,再予 5 0mg L的正常低密度脂蛋白处理 ,细胞胆固醇流出率下降至 4 5 .3%± 7.3%。③抗氧化剂普罗布考显著对抗氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞caveolin 1表达的抑制作用。④外源导入caveolin 1表达质粒显著促进氧化型低密度脂蛋白损伤后的细胞胆固醇转运 ,     

氧化型低密度脂蛋白诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡

为研究氧化型低密度脂蛋白引起血管平滑肌细胞凋亡及其凋亡的机制,采用细胞形态学ＤＮＡ末标记法,流式细胞仪,Ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｔｔｉｎｇ观察氧化型低密度脂蛋白诱导培养的大鼠血管平滑肌细胞凋亡。结果发现,在氧化型低密度脂蛋白作用下,血管平滑肌细胞阻滞在分裂期的中期,并发生凋亡,ＤＮＡ末端标记法和流式细胞仪检测发现氧化型低密度脂蛋白引起细胞凋亡明显高于天然低密度脂蛋白（前者是后者的１０倍）。电镜下凋亡细胞     

氧化型低密度脂蛋白对内皮细胞不对称二甲精氨酸的影响及卡托普利的干预作用

目的　探讨氧化型低密度脂蛋白 ( o X-LDL)对培养人脐静脉内皮细胞 ( HUVECs)上清液中不对称二甲精氨酸 ( ADMA)浓度的影响及卡托普利的保护作用。方法　采用改良的 Jaffe法培养原代 HUVECs,取生长良好的 3～6代 HUVECs用于实验 ,分为 1空白对照组 :加 DMEM培养液 ;2 ox-L DL组 :分别加入 ox-LDL ( 10 0 mg/L,15 0 mg/L) ;3 o X-LDL+卡托普利组 :同时加入 15 0 mg/L o X-LDL 及卡托普利 ( 5 0 mg/L、10 0 mg/L)共孵 2 4h后 ,分别测定上清液中 ADMA、左旋精氨酸 ( L-arg)、一氧化氮 ( NO)和内皮素 ( ET)的浓度 ,并测定血管紧张素转换酶( ACE)的活性。结果　 ox-L DL组 ADMA、ET的量及 ACE活性增加 ,而 NO的量减少 ,且呈浓度依赖性。卡托普利干预后 ,上清液中 ADMA、ET的浓度减少 ,ACE活性降低 ,NO的量增加 ,而 L -arg水平无明显变化。结论　 ox-L DL通过增加 ADMA导致内皮功能紊乱。卡托普利则能通过减少 ADMA减轻 ox-L DL诱导的内皮细胞代谢功能障碍     

补肾煎对去势高脂血症兔ox-LDL及ox-LDL mRNA表达作用的实验研究

目的　观察补肾煎对去势高脂血症兔血 ox- LDL水平以及内皮细胞 ox- L DL m RNA表达的影响。方法　纯种新西兰雌兔去势术 +0 .5%胆固醇饲料 +静注牛血清白蛋白造模 ,模型动物连续使用雌激素和补肾煎治疗 1 2 w后检测相关指标。结果　与模型组相比 ,补肾煎较好地降低 ox- L DL含量 (P<0 .0 5) ,减少内皮细胞 ox- LDL m RNA的表达 (P<0 .0 5)。结论　补肾煎可改善去势高脂血症模型兔异常的血 ox- LDL水平 ,减少内皮细胞 ox- L DL m RNA的表达 ,从而减少 LDL氧化修饰 ,保护内皮细胞功能、防治绝经后动脉粥样硬化。     

L-精氨酸抑制内皮细胞粘附分子-1表达与氧化型低密度脂蛋白促单核细胞粘附作用下降有关

用氧化型低密度脂蛋白处理培养的猪主动脉内皮细胞，以Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈａｐａｑｕｅ分离液密度梯度离心分离人外周血单核细胞，观察Ｌ－精氨酸对内皮细胞－单核细胞粘附率的影响；采用反转录－多聚酶链反应技术检测氧化型低密度脂蛋白和Ｌ－精氨酸对内皮细胞血管细胞粘附分子－１表达的影响。结果显示：Ｌ－精氨酸具有剂量和时间依赖性地抑制氧化型低密度脂蛋白的促内皮细胞－单核细胞粘附作用。氧化型低密度脂蛋白处理内皮细胞能明显增加内皮血管细胞粘附分子。－１的表达，而Ｌ－精氨酸阻抑氧化型低密度脂蛋白的此种作用。结果提示Ｌ－精氨酸可能通过抑制血管细胞粘附分子－１表达阻抑氧化型低密度脂蛋白的促内皮细胞—单核细胞粘附作用。