奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法的建立

[目的]建立奶粉中阪崎肠杆菌的PCR检测方法。[方法]根据阪崎肠杆菌zpx基因设计引物建立PCR检测方法,进行方法的特异性验证和灵敏度检测,并对模拟样品和实际奶粉样品进行检测。[结果]所建立的阪崎肠杆菌PCR检测方法的纯菌检测灵敏度达102cfu/ml,6株阪崎肠杆菌菌株PCR扩增均可扩增出180bp的目的条带,而31株非阪崎肠杆菌则无目的条带出现;模拟阪崎肠杆菌污染样品经前增菌后均可检出;对实际样品的检测显示该方法与传统的分离培养方法具有较好的一致性。[结论]该方法灵敏度高,特异性强,快速、简便,易于推广,可很好地应用于奶粉中阪崎肠杆菌的检测和鉴定。     

阪崎肠杆菌环介导等温扩增检测方法建立

目的 针对当前国内外传统检测方法缺点,建立阪崎肠杆菌快速检测法.方法 根据阪崎肠杆菌外膜蛋白(OmpA)基因,设计4条特异性引物(内、外引物各2条),建立并优化环介导等温扩增(100p-mediattA isothermalamplification,LAMP)检测体系及反应条件,并进行LAMP反应的灵敏度、特异性实验及实际样品检测.结果 LAMP检测阪崎肠杆菌,优化后的条件选择为:Mg2+浓度6 mmoVL,dNTP浓度0.6 mmoVL,甜菜碱浓度0.8 moVL,外引物与内引物的浓度比1:4,扩增温度580C 60min;细菌纯培养检测灵敏度为101cfu/mL;对11种细菌共26株菌进行LAMP扩增,仅8株阪崎肠杆菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性;对实际样品进行增菌检测,采用试剂盒提取DNA,从样品处理到报告结果,耗时26 h;并采用传统检测方法验证,正确性为100%.结论 该方法检测阪岐肠杆菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低、耗时短,有望成为快速检测阪岐肠杆菌的有效方法.     

免疫磁珠与荧光定量PCR联合检测乳制品中阪崎肠杆菌的实验研究

[目的]建立一种免疫磁珠吸附-荧光定量PCR(IMB-FPCR)快速检测阪崎肠杆菌的方法,探讨在乳制品污染监测及食物中毒快速诊断中的应用。[方法]根据阪崎肠杆菌rpsU-dnaG基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于金黄色色葡萄球菌检测的定量标准品,建立阪崎肠杆菌IMB-FPCR检测方法。[结果]成功构建了阪崎肠杆菌重组质粒标准品和阪崎肠杆菌IMB-FPCR方法。阪崎肠杆菌的免疫磁珠吸附试验显示磁珠对奶粉中的阪崎肠杆菌吸附率达77.7%。通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性,最低检测限为10cfu/ml的菌细胞,并具有良好的稳定性和重复性。整个检测仅需时1d。[结论]IMB-FPCR简便快速、灵敏度高及特异性强,为准确检测乳制品中阪崎肠杆菌提供了一个新的途径,可广泛应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等。     

PCR快速检测奶粉中阪崎肠杆菌研究

目的：针对当前国内外传统检测方法都存在时间长、检测结果假阳性突出等问题，建立阪崎肠杆菌快速检测法。方法：根据阪崎肠杆菌中寡-1，6-葡萄糖苷酶基因设计引物建立PCR方法，并进行PCR反应的灵敏度、特异性实验以及模拟实际样品的最低检出限测定。结果：纯菌检测灵敏度达10^2 cfu／ml，阪崎肠杆菌菌株PCR扩增均为阳性，阴性对照菌株未扩增出特异性条带；单独接种阪崎肠杆菌（3．5—4．5 cfu／100g）和混合接种大肠杆菌或沙门菌的人工模拟污染奶粉样品中分别在增菌26h和28h时，阪崎肠杆菌均可以检出。结论：该方法灵敏度高、快速、特异性强，可以很好地应用于奶粉以及其他食品中阪崎肠杆菌的检测与鉴定。     

分子信标-实时PCR法快速检测阪崎肠杆菌的研究

目的:建立分子信标-实时PCR检测婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速方法。方法:根据GenBank公布的阪崎肠杆菌ATCC29544株ompA基因的保守序列,设计引物和分子信标探针,建立阪崎肠杆菌的分子信标-实时PCR技术快速检测,应用于食品检测。结果:检测方法特异性强,无非特异性扩增;分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为95fg/PCR反应体系,无交叉反应;以此反应体系检测23份样品,其中3份为阳性,余未检出,与传统检测方法结果一致。结论:分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速检测。     

环介导等温扩增法检测进口宠物乳粉中阪崎肠杆菌

目的:建立并验证一种能够简单,准确和快速检测进口宠物乳粉中阪崎肠杆菌的方法。方法:应用环介导等温扩增技术(LAMP)建立宠物乳粉中阪崎肠杆菌检测方法,并通过常规方法对其结果进行验证。结果:LAMP方法从5种进口宠物乳粉中检出两份阪崎肠杆菌阳性,与VITEK 2生化鉴定结果一致。结论:该方法特异性好、灵敏度高,检测时间短,适用于奶粉及其他食品中阪崎肠杆菌检测。     

阪崎肠杆菌和沙门菌多重PCR检测方法的建立

目的建立阪崎肠杆菌和沙门菌的多重PCR检测方法。方法针对阪崎肠杆菌外膜蛋白A(ompA)基因和沙门菌属侵袭性抗原保守基因(invA)基因设计引物,建立其多重PCR检测方法,并对反应条件进行优化。结果两对引物分别能扩增出469bp和284bp的目的条带,结果具有高度特异性,反应条件优化后,两菌可同时检出的浓度限度为106cfu/ml。结论该方法敏感、特异,为快速检测阪崎肠杆菌、沙门菌提供了新的有效手段。     

婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌分子检测方法探讨

目的：对婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分子检测方法进行探讨。方法：分别用常规PCR方法和实时荧光PCR方法对32份奶粉样品进行阪崎肠杆菌鉴定。结果：32份样品中检出2株阳性株,阳性率为6.25%,两种检测方法结果相符。结论：市售婴幼儿配方奶粉中存在阪崎肠杆菌污染,应尽快制订婴幼儿食品中阪崎肠杆菌的检测标准,分子检测方法可快速准确检测阪崎肠杆菌。     

环介导等温扩增(LAMP)技术检测奇异变形杆菌方法的建立

[目的]建立一种检测奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)快速且特异的环介导等温扩增(LAMP)检测方法. [方法]针对奇异变形杆菌脲酶调节子编码基因(ureR)特异性序列的6个位点设计4条LAMP引物,65℃孵育约60min,完成对奇异变形杆菌的扩增,扩增产物经电泳和酶切鉴定.利用LAMP和普通PCR方法同时检测1株奇异变形杆菌和13株非奇异变形杆菌来验证LAMP方法的特异性;将奇异变形杆菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法同时进行检测来比较两者敏感性. [结果]1株奇异变形杆菌扩增出LAMP特征性梯状条带,13株非奇异变形杆菌没有出现LAMP扩增,酶切也证实了LAMP产物的特异性;LAMP检测奇异变形杆菌的特异性与普通PCR相同,但其敏感性比普通PCR高10倍:LAMP检测奇异变形杆菌的检测下限为5 cfu/ml,PCR检测下限为50 cfu/ml.LAMP检测速度相比PCR更快速,在60 min内即可完成扩增反应.[结论]建立了一种特异、敏感、快速且不需要特殊设备的奇异变形杆菌LAMP检测方法,有望用于奇异变形杆菌的快速检测.     

霍乱弧菌环介导等温扩增LAMP技术检测

目的 应用环介导等温扩增技术(LAMP)进行霍乱弧菌的快速检测.方法 针对霍乱弧菌的管家基因(mdh)设计4条特异性引物(2条内引物和2条外引物),建立快速检测食品中霍乱弧菌的环介导等温扩增方法;应用该方法对17种细菌共42株菌进行LAMP扩增,并进行确证,全面评估该方法的灵敏度、特异性、准确性等.结果 该方法检测21株霍乱弧菌均得到阳性扩增结果,其余21株非霍乱弧菌均未扩增出条带,扩增反应最佳反应时间为60min,反应温度为65℃.霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为40 fg和50 cfu/mL.对模拟食品样品进行直接检测,检测限为70 cfu/g.结论 该方法具有特异性强、灵敏度高,操作简便快速、不需要复杂仪器设备,适用于食品的快速检测.     

阪崎克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术研究

[目的]建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光定量聚合酶链反应（RT．PCR）快速检测方法。[方法]在阪崎克罗诺杆菌保守序列设计一对特异性引物和TaqMan—MGB探针,通过对PCR反应条件和扩增体系的优化,建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测方法;用已知浓度的阪崎克罗诺杆菌验证其敏感性;用阪崎克罗诺杆菌、大肠埃希菌、鸭沙门菌株、柠檬酸杆菌等菌株验证其特异性;用婴幼儿配方粉等食品开展TaqMan—MGB探针实时荧光PCR技术与常规检测方法符合性比较。[结果]本研究建立的阪崎克罗诺杆菌实时荧光PCR检测技术,反应循环（cyclethreshold,CT）值-9模板浓度的对数值具有良好的对应关系[Y=-3．06×log（X）＋36．63,R^2=0．999],最低检测浓度为100CFU／mL,经36℃增菌8h最低检测限可达1CFU／mL,敏感性较普通TaqMan探针高10倍;11株阪崎克罗诺杆菌CT值均小于30,而大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、柠檬酸杆菌等30株菌株CT值大于30或扩增曲线成一平滑直线;隔天连续5次反应CT值变异系数小于5％;140件不同批次不同婴幼儿配方粉、192件婴幼儿谷物辅助食品检测结果与常规分离培养比较,差异无统计学意义（X^2=0．624,P〉0．05）。[结论]阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测技术具有特异性强、敏感性高、易操作等优点,适用于婴儿配方粉等食品开展阪崎克罗诺杆菌快速检测与监测工作。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测沙门菌属方法的建立

建立一种检测沙门菌属快速敏感的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法。针对沙门菌属侵袭蛋白（invA）基因序列的六个区域设计四条LAMP引物，65℃保温约60min，完成对沙门菌属的扩增，扩增产物经电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测4株沙门菌和9株非沙门菌（对照组）来验证LAMP方法的特异性；将肠炎沙门菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测来比较两者敏感性。4株沙门菌扩增出LAMP特征性梯状条带，9株非沙门菌没有出现LAMP扩增，LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实；LAMP检测沙门菌属的特异性与普通PCR相同，但其敏感性比普通PCR高10倍，LAMP检测沙门菌属的检测下限为10cfu／ml，PCR检测下限为100cfu／ml。LAMP检测速度相比PCR更快速，在60min内即可完成扩增反应。建立了一个快速、特异、敏感的沙门菌属LAMP检测方法。     

Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters

Human consumption of raw or undercooked seafood, particularly oysters, may lead to severe infections due to the presence of Vibrio vulnificus. In this study, a sensitive and specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was developed to detect this pathogen in raw oysters. Two outer and two inner primers were designed to specifically recognize the V. vulnificus cytolysin/hemolysin gene (vvhA), and the reaction could be completed in 1 hour at 63 degrees C. Direct visual observation of the LAMP amplicons was achieved with the aid of SYBR Green I fluorescent dye. The assay specificity was determined using 50 bacterial strains, including multiple Vibrio spp. and bacteria of other genera. No false-positive or false-negative results were observed. The detection limit of the LAMP assay was approximately 20 colony-forming units (CFU) in pure cultures, 10-fold more sensitive than a conventional polymerase chain reaction (PCR). When directly applied in oyster homogenate, the LAMP assay had a detection limit of approximately 10(7) CFU/g. After 5-hour enrichment, LAMP was capable of detecting 7 CFU of V. vulnificus per gram of oyster tissue without lengthy DNA extraction steps. This level of detection was 1000-fold more sensitive than PCRs included for comparison. Because of its isothermal format and unique amplicon detection technique, this rapid and sensitive LAMP assay holds potential for future field applications.     

嗜肺军团菌环介导等温扩增快速检测方法的建立与应用

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测嗜肺军团菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(LAMP),针对嗜肺军团菌mip基因设计5条引物(2条内引物、2条外引物及1条环引物),并对LAMP反应条件和反应体系进行优化.为验证该方法的特异性、敏感性,针对种系背景明确的12株嗜肺军团菌实验对照菌株、45株嗜肺军团菌地方分离株、6株非嗜肺军团菌、11株其他细菌以及59份外环境水样本进行检测,并将其结果与传统培养分离方法及定量PCR方法比较.结果 所检测的菌株样本中不同血清型嗜肺军团菌经LAMP检测均呈绿色为阳性,非嗜肺军团菌及其他菌株检测均呈橙色为阴性.实验结果表明,LAMP方法的检出率高于传统培养分离方法及定量PCR.应用该方法从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右,该体系检测灵敏度为5 cfu/ml,而且其检测结果在日(灯)光下通过肉眼即可判断.结论 实验建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测嗜肺军团菌,适合基层检验部门及小型实验室与现场监测等使用.     

鼠疫耶尔森氏菌环介导等温扩增检测方法的建立

目的:将环介导等温扩增技术(LAMP)应用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。方法:针对鼠疫耶尔森氏菌F1基因设计特异性引物,进行LAMP扩增。应用LAMP技术对鼠疫菌和非鼠疫菌进行检测以确定其特异性;对倍比稀释鼠疫菌液进行检测以确定其灵敏度,并与常规PCR方法进行比较。结果:对10种非鼠疫菌进行LAMP扩增,均为阴性结果,证明该方法具有很高的特异性。LAMP方法最低检出量为20个鼠疫菌,比常规PCR方法的灵敏度高10倍。通过加入染料进行LAMP扩增可直接观察结果。结论:本方法检测鼠疫耶尔森氏菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、结果易于判定,有望发展成为快速检测鼠疫耶尔森氏菌的有效手段。     

两种方法比对食品中阪崎肠杆菌检验

目的:比对食品中阪崎肠杆菌检验的国标法和实时荧光PCR法,确保检测结果准确。方法:分别按照GB4789.40-2010《食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》和PCR法操作要求进行检验,所得结果进行比对分析。结果:查10类食品共850份样品,检出阪崎肠杆菌54株,国标法检出率为6.4%;PCR法阳性率为7.4%。结论:联合使用两种方法鉴定阪崎肠杆菌可提高检测结果的可靠性,报告以国标法为准。     

批发市场销售国产配方奶粉及婴幼儿食品中阪崎肠杆菌污染情况调查

目的了解批发市场销售的国产配方奶粉及婴幼儿食品中阪崎肠杜菌污染情况。方法参照GB/T4789.40-2008规定的阪崎肠杆菌的检验方法对69份样品进行检测。对检出的阪崎肠杆菌进行药敏检测。结果 69份国产配方奶粉及婴幼儿食品中共检出16株阪崎肠杆菌。16株菌均对临床常用的针对G-菌的抗生素普遍敏感。结论批发市场销售的国产配方奶粉及婴幼儿食品中阪崎肠杆菌污染严重,应引起有关部门的重视。     

环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌方法的建立与应用

目的建立适合基层实验室快速检测副溶血性弧菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法根据副溶血性弧菌gyrB基因设计4条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果建立的LAMP体系具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,副溶血性弧菌为阳性,其他菌株均为阴性。该方法对培养的副溶血性弧菌的检测下限为25cfu/mL,可在60min内完成扩增反应。用该体系对120份海产品进行检测,阳性率62.5%,与传统方法一致。结论 LAMP法与传统方法相比,可节省大量时间,且对实验仪器要求低,具有良好的实用性。     

食源性致病菌质控盲样鉴定结果分析

目的为了保证全国食源性致病菌监测检验结果的可靠性,提高检验能力,参加微生物检验实验室间比对实验。方法依据中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验(GB/T4789.4.7.9.10.30.36.40-2008)和河南省食源性致病菌监测网作业指导书(2010年)。结果 HNⅢ3号考核样品检出都柏林沙门菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌。结论 PCR检测技术可以作为辅助工具,VITEK全自动生化系统能准确判定阪崎肠杆菌。