Survivin反义寡核苷酸抑制EC9706细胞增殖并诱导细胞凋亡

目的 观察Sunrivin反义寡核苷酸(ASODN)对人食管癌细胞系EC9706细胞增殖和凋亡的影响.方法 人工合成Survivin基因反义和正义ODN,并进行硫代磷酸化修饰,通过脂质体途径分别转染 EC9706 细胞;应用 RT-PCR 和 Western Blot 检测 SurvivinmRNA和蛋白表达;应用MTT法检测 Survivin ASODN 对 EC9706 细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡比率.结果 体外培养的 EC9706 细胞可表达较强的 Survivin mRNA 和蛋白;Survivin ASODN 可呈浓度依赖性地抑制 Survivin mRNA 和蛋白表达,50μmoL/L ASODN 几乎可以完全抑制.MTT 研究结果表明,Survivin ASODN 可呈浓度依赖性地抑制 EC9706 细胞增殖,50μmol/L ASODN 对细胞生长的抑制率可达78.5%,诱导细胞凋亡,使细胞阻滞于G2/M 期.Survivin SODN 对 Survivin mRNA 和蛋白以及 EC9706 细胞的增殖和细胞周期无明显的抑制作用.结论 脂质体介导转染 Survivin 反义寡核苷酸可抑制细胞增殖、诱导细胞G2/M 期阻滞而促进细胞凋亡.     

Survivin反义寡核苷酸诱导K562/A02细胞凋亡的实验研究

背景与目的:Survivin是最近发现的凋亡抑制基因,与白血病的发生和耐药有关,反义寡核苷酸可抑制survivin表达,诱导凋亡,增加药物的敏感性。本研究探讨survivin反义寡核苷酸对白血病耐药细胞K562/A02生长、凋亡和半胱氨蛋白水解酶3的活性的作用。方法:以脂质体转染survivin反义寡核苷酸,以MTT、RT-PCR、流式细胞术、荧光分光光度计分别检测survivin反义寡核苷酸对K562/A02细胞的生长抑制、survivin mRNA表达、凋亡和半胱氨蛋白水解酶3的活性。结果:survivin反义寡核苷酸对K562/A02细胞的生长抑制呈浓度-时间依赖性,与对照组相比,survivin mRNA表达降低36.2%(P<0.05),半胱氨蛋白水解酶3的活性增加67.6%(P<0.05);K562/A02细胞的凋亡率明显增加(14.48±2.65%vs 2.39±0.47%,P<0.005)。结论:survivin反义寡核苷酸通过抑制survivin表达,上调半胱氨蛋白水解酶3活性而诱导凋亡。     

Survivin反义寡核苷酸对卵巢癌细胞株凋亡和侵袭、迁移的影响

目的:观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3凋亡和侵袭、迁移的影响,探讨其作用的分子机制和临床价值。方法:用脂质体LipofectamineTM2000介导ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力的改变,流式细胞学技术检测细胞凋亡指数及survivin、Smac、VEGF蛋白表达改变,逆转录酶链反应(RT-PCR)检测survivin、Smac/DIABLO、VEGF基因表达改变。结果:脂质体LipofectamineTM2000介导ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,FCM及共聚焦显微镜(SLM510)检测结果显示转染率>95%。用600 nmol/L ASODN转染48 h后,细胞迁移和侵袭能力下降(t=3.47,P<0.05;t=5.72,P<0.01)。细胞凋亡指数(AI)明显增加(t=6.37,P<0.05)。Survivin mRNA和蛋白表达明显下调(t=3.50,P<0.05;t=7.81,P<0.01),Smac mRNA和蛋白表达上调(t=-2.80,P<0.05;t=11.39,P<0.01),VEGF mRNA和蛋白表达明显下调(t=2.54,P<0.05;t=33.84,P<0.01)。结论:ASODN可诱导卵巢癌细胞凋亡,降低卵巢癌细胞侵袭和迁移能力。这些作用是通过下调survivin、VEGF基因,上调Smac基因表达来共同完成的,他们之间的相互作用可能是卵巢癌发生、发展和转移的重要分子机制,survivin可能在其中起关键性作用。针对survivin的基因治疗将成为卵巢癌治疗的重要手段,有重要的临床价值。     

Survivin反义寡核苷酸对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察Survivin反义寡核苷酸对SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响。方法:设计合成特异性Survivin反义寡核苷酸,转染肝癌SMMC-7721细胞,MTT法测定Survivin ASODN对细胞增殖抑制情况的影响,FCM法检测对细胞周期、凋亡及Survivin蛋白表达的影响。结果:Survivin ASODN可抑制SMMC-7721细胞的生长增殖,并呈浓度和时间依赖性。ASODN转染组可诱导SMMC-7721细胞凋亡(P<0.01),细胞周期阻滞于G2/M期(P<0.05)。ASODN转染组Survivin蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论:Survivin ASODN能下调SMMC-7721细胞Survivin表达,并可抑制其增殖并诱导凋亡。     

Survivin反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:采用survivin反义寡核苷酸(ASODN)封闭骨肉瘤细胞survivin的作用,观察其对骨肉瘤细胞系MG63增殖和凋亡的影响。方法:以脂质体为载体,介导survivin反义寡核苷酸转染人骨肉瘤细胞系MG63,用MTT法测定细胞增殖;流式细胞仪检测转染survivin反义寡核苷酸后细胞凋亡率;Westernblot及半定量RTPCR检测转染survivin反义寡核苷酸后的骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达。结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染骨肉瘤细胞系MG63后,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率明显增加,骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达均明显降低。结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以抑制细胞增殖,有效降低细胞内survivin基因的表达,促进细胞凋亡。     

VEGF反义寡核苷酸治疗小鼠Lewis肺癌的研究

肺癌与其它实体瘤一样,其生长、转移和预后均依赖血管生成,以新生血管为靶点,抑制肿瘤血管生成,阻断肿瘤的营养来源和迁移通道,已成为癌症治疗的新策略.有研究发现,血管内皮生长因子(Vascular en-dothelial growth factor,VEGF)为一高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素,可直接诱导肿瘤血管生成[1].我们利用近年兴起的反义技术,设计VEGF反义寡核苷酸片断,使其特异性封闭肿瘤细胞中的VEGF mRNA,通过研究它对肿瘤细胞合成VEGF及对肿瘤生长的影响,探讨其对肺癌治疗新途径的可能性.     

CRKL基因反义寡核苷酸诱导K562细胞的凋亡

背景与目的：近几年研究发现,CRKL（CT10regulator of kinase like)基因编码的蛋白在慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML)发病中起重要作用。本实验研究CRKL基因反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。方法：以脂质体为载体,用CRKL基因反义寡核苷酸转染K562细胞,通过活细胞计数,透射电镜,流式细胞术,DNALadder测定观察K562细胞形态学,细胞周期,基因表达等的变化。结果：在CRKL基因反义寡核苷酸作用下,K562细胞的生长明显出现抑制;流式细胞仪检测见二倍体峰前出现凋亡峰;在电镜下可见处于凋亡各期的K562细胞;提取其基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳,可见明显的细胞凋亡梯状条带,而对照组K562细胞未观察到上述变化。结论：CRKL基因是Ph染色体阳性CML发病的重要因素。     

端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验

目的研究端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞株的凋亡诱导作用及其机制。方法以人肝癌细胞株SMMC-7721、正常肝细胞株L-02为研究对象,采用TRAP-ELISA法对肿瘤细胞端粒酶活性进行定性定量分析;细胞形态学、TUNEL染色、DNA 琼脂糖凝胶电泳观察端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用,用流式细胞仪对细胞周期进行时相分析,Western杂交对细胞周期蛋白进行研究。结果一定浓度的端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性,肝癌细胞端粒酶活性被抑制后传代23～26次出现细胞凋亡。细胞凋亡与细胞周期蛋白有关。结论端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性并诱导其凋亡。     

脂质体介导bcl-xL反义寡核苷酸对鼻咽癌CNE-2Z细胞株凋亡的影响

背景与目的:实验证明 bcl-xL在鼻咽癌 CNE-2Z细胞中存在高表达 , 它可能在鼻咽癌的发生发展中发挥着重要的作用 . 本研究以脂质体 (lipofectin)为载体 , 将人工合成的 bcl-xL反义寡核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)片段导入 CNE-2Z细胞 , 拟探讨 ASODN对 CNE-2Z细胞的影响 . 方法:以 bcl-xL的编码区为靶点 , 人工合成 20个碱基全硫代修饰的反义寡核苷酸 , 脂质体转染反义寡核苷酸进入 CNE-2Z细胞后 , 用 MTT法检测细胞成活率 ; 用琼脂糖凝胶电泳、荧光染色、流式细胞术等方法检测细胞凋亡 . 结果:MTT结果发现 , ASODN在 Lip介导下即可显著抑制 CNE-2Z细胞株细胞增殖 (P< 0.01), ASODN对细胞增殖的抑制作用随其浓度增加而增强 ; ASODN作用细胞 36 h后 , 经 Hoechst 33258/PI双染在荧光显微镜下可见细胞缩小、染色质固缩、核断裂 ; 流式细胞仪分析发现在 G1峰前出现一个亚二倍体峰即凋亡峰 ; 琼脂糖凝胶电泳分析可见 ASODN/Lip处理组出现明显的 " 梯状 " 外观等凋亡特征性改变 . 结论:ASODN脂质体转染 CNE-2Z细胞后可促进 CNE-2Z的细胞凋亡 ; 在肿瘤研究中 , bcl-xL可作为一个有用的靶基因 , 为开发鼻咽癌基因治疗药物提供实验依据 .     

生存素反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC-7901生长的影响

目的　观察生存素蛋白在胃癌细胞株SGC 790 1中的表达及转染不同浓度的生存素反义寡核苷酸(ASODN )对胃癌细胞SGC- 790 1生长的影响。方法　采用细胞免疫组织化学染色观察生存素蛋白在胃癌细胞株SGC- 790 1中的表达。将胃癌细胞株SGC 790 1分为8个组:空白对照组,脂质体转染组,2 0 0nmol/L、40 0nmol/L、60 0nmol/L无义链转染组,2 0 0nmol/L、40 0nmol/L、60 0nmol/L反义链转染组,转染48h后,采用四氮唑盐(MTT )比色法,测定各组的细胞生长抑制率,并采用流式细胞仪检测60 0nmol/L无义链转染组、60 0nmol/L反义链转染组细胞的凋亡率以及生存素蛋白表达。结果　显示生存素蛋白在胃癌细胞株SGC- 790 1的胞核和胞质中均有表达,但以胞核为主;各组生存素ASODN对胃癌细胞株SGC- 790 1有明显的抑制作用(P <0 .0 1) ,抑制作用呈浓度依赖性,60 0nmol/L反义链转染组抑制率为最高,达40 .0 % ,流式细胞仪检测表明生存素ASODN有明显的诱导细胞凋亡的作用,定量检测结果显示生存素ASODN可以下调生存素蛋白至8.8% (P <0 .0 1)。结论　不同浓度的生存素ASODN均能通过下调生存素蛋白表达来抑制胃癌细胞株SGC- 790 1的生长。     

凋亡素体外诱导表达Survivin膀胱癌细胞凋亡效果观察

目的:观察凋亡素对表达Survivin膀胱癌细胞株的作用效果,并结合相应机制探讨其临床意义.方法:利用免疫组织化学法检测膀胱癌细胞株BIU-87中Survivin的表达水平,并计算平均每高倍镜视野中阳性细胞比率.将肿瘤细胞分为单纯细胞组、转染空质粒pCDNA3组及转染pCDNA3/Apoptin组,利用脂质体转染法将真核表达栽体pCDNA3/Apoptin及pCDNA3空质粒转染入膀胱癌细胞中,并于转染后24h通过RT-PCR法检测细胞中Apoptin的表达情况.分别于转染后24、48、72h利用MTT法检测各组细胞存活率,并利用流式细胞仪TUNEL法检测各组细胞的凋亡率.结果:利用免疫组织化学法检测发现膀胱癌细胞株BIU-87中Survivin呈高表达状态,平均每个高倍镜视野中阳性细胞比例约70%,并有较多细胞呈现高表达状态.转染后24h通过RT-PCR法可见Apoptin在膀胱癌细胞中表达.分别于转染后24、48、72h利用MTT法检测各组细胞存活率,发现转染pCDNA3/Apoptin组肿瘤细胞存活率均明显低于对照组,差别有统计学意义(P<0.05);利用流式细胞仪TUNEL法检测各组细胞的凋亡率,发现转染pCDNA3/Apoptin组肿瘤细胞凋亡率均明显高于对照组,差别有统计学意义(P<0.05).结论:凋亡素可在体外诱导高表达Survivin的膀胱癌细胞株BIU-87高效凋亡,结合相关机制表明凋亡素可在一定程度上克服Survivin的抗凋亡作用,因此有可能成为Survivin拮抗的抗肿瘤药物的协同用药选择.     

紫杉醇诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡的实验研究

目的 :研究紫杉醇 (Taxol)对肝癌细胞SMMC 772 1的生长抑制和诱导凋亡的作用。方法 :应用MTT法观察紫杉醇对SMMC 772 1的生长抑制作用 ,通过瑞氏染色、荧光显微镜、透射电镜 ,流式细胞仪和TUNEL染色研究紫杉醇对SMMC 772 1诱导凋亡的作用。结果 :紫杉醇对肝癌细胞SMMC 772 1有明显的生长抑制作用 ,其IC50 为 2 1.6nmol/L。紫杉醇作用细胞后 ,可看到较为典型的细胞凋亡的形态学变化 ,细胞核固缩、染色质凝集成新月型紧贴于核膜周边 ,核碎裂、染色质片断化、凋亡小体形成等。流式细胞仪上可见S期和G2 /M期和DNA含量增加 ,并出现典型的亚二倍体“凋亡小峰”。TUNEL染色显示。紫杉醇作用于SMMC 772 1后 ,随药物浓度增加和作用时间延长 ,凋亡指数增加。结论 :紫杉醇对SMMC 772 1有明显的生长抑制作用 ;紫杉醇对SMMC 772 1有诱导凋亡的作用。     

塞来昔布联合奥沙利铂对人肺癌裸鼠移植瘤的治疗作用及其作用机制的研究

目的: 研究COX-2抑制剂与化疗药物奥沙利铂对人肺癌裸鼠移植瘤生长、Survivin表达和微血管生成的影响。 方法: 人肺癌A549细胞接种于裸鼠背部皮下,随机分为四组(对照组;奥沙利铂组;塞来昔布组;奥沙利铂和塞来昔布联合用药组)并给予相应的药物。测量肿瘤体积,42天后处死裸鼠,切取移植瘤组织检测COX-2,VEGF,Sur-vivin表达和微血管密度(MVD)。 结果: 塞来昔布组和奥沙利铂组抑瘤率分别为34.60%和46.70%,奥沙利铂和塞来昔布联合应用组抑瘤率为66.09%。免疫组织化学染色和RT-PCR结果分析显示:奥沙利铂组COX-2,VEGF表达显著高于对照组(P<0.05)。微血管密度与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。奥沙利铂组Survivin表达低于对照组,塞来昔布组和联合用药组COX-2,VEGF表达和MVD低于对照组(P<0.05)。 结论: 塞来昔布可抑制人肺癌裸鼠移植瘤的生长、Survivin表达和血管生成。塞来昔布与奥沙利铂联合应用提高了奥沙利铂的抗肿瘤效果。     

中药金安与顺铂诱导小鼠Lewis肺癌凋亡的研究

[目的]探讨中药金安是否能促进顺铂诱导C57BL/6J小鼠Lewis肺癌凋亡。[方法]荷Lewis肺癌的C57BL/6J小鼠分为生理盐水组(NS)、金安组(JA)、顺铂组(DDP)和金安合用顺铂组(DJ),通过检测各组小鼠的体重变化和抑瘤率,应用流式细胞仪和TUNEL法以及提取组织DNA并电泳等方法观察金安合用顺铂对Lewis肺癌的治疗作用。[结果]JA组体重明显增加,DDP组体重先升后降,而DJ组体重则先升后降再回升呈“～”型。各治疗组的抑瘤率分别为40.90%、52.04%和47.83%。流式细胞仪检测各组的凋亡率依次为14.95%、11.68%和14.25%。TUNEL法测定各组的凋亡指数依次是(0.79±1.60)%、(4.00±7.15)%、(5.93±5.96)%、(7.07±10.15)%;DNA提取并电泳在DJ组有DNALadder出现。[结论]金安能增强DDP诱导Lewis肺癌的凋亡作用,并能减轻其毒副作用。     

Survivin基因的shRNA 干扰对结肠癌SW480 细胞增殖和凋亡的影响*

目的：以携带shRNA 片段的腺病毒为载体,对结肠癌细胞SW480 中Survivin基因的表达进行干扰,研究其对肿瘤细胞中Survivin基因沉默效果及对细胞周期、凋亡和增殖的影响。方法：将构建好的携带Survivin-shRNA 片段腺病毒,体外转染结肠癌细胞株SW480。以EGFP为报告基因,采用流式细胞计数测定不同感染复数（MOI）下的转染效率,选取适当病毒浓度进行下一步实验。通过RT-PCR 和Western blot检测基因沉默后结肠癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的表达水平;在Annexin V-FITC 和PI染色后通过流式细胞术检测并分析Survivin基因沉默后细胞周期和凋亡的变化;同时采用噻唑蓝（MTT）法、克隆增殖实验对细胞不同时期增殖活性进行观察,明确对细胞增殖的抑制时效性。结果：腺病毒转染后MOI 值在0～50时,剂量与转染效率成正比,确定最佳MOI 值为50并进行后续实验;shRNA 干扰后细胞内Survivin mRNA和蛋白表达水平降低,较对照细胞组差异有统计学意义（P<0.01）。 流式细胞仪检测结果显示基因沉默后细胞凋亡率升高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。 同时基因沉默后,细胞周期也有明显变化,表现为G1/S 期细胞增多和G2/M期细胞减少,与对照细胞组相比差异有统计学意义（P<0.05）。 MTT 和单克隆平板实验均显示Survivin基因的沉默,对细胞的增殖和生长均具有明显抑制作用（P<0.05）。 结论：采用腺病毒对结肠癌进行靶向Survivin基因的shRNA 干扰,能有效降低目的基因的表达。其介导的Survivin基因的沉默,可以有效的诱导结肠癌细胞凋亡,同时Survivin基因可以通过抑制细胞G1/S 期转化来阻止细胞分裂,抑制细胞生长。     

三氧化二砷诱导乳腺癌细胞凋亡以及对Survivin、Caspase-3蛋白表达的影响

背景与目的:探讨不同浓度As2O3在诱导人乳腺癌细胞MDA_MB₂31凋亡过程中的作用,并研究其对Survivin和Caspase₃蛋白表达的影响。材料与方法:将3种不同浓度的As2O3（10.0、20.0、40.0μmol/L）与MDA_MB₂31细胞共培养不同时间后,采用流式细胞术检测MDA_MB₂31细胞凋亡;用免疫细胞化学技术及Westernblot检测Survivin和Caspase₃蛋白的表达。各实验均设相应的对照组。结果:经10.0、20.0、40.0μmol/LAs2O3作用后,MDA_MB₂31细胞凋亡率分别为（28.89±2.47）%、（46.73±3.82）%和（56.44±4.16）%,细胞凋亡率在各浓度组间的差异均具有统计学意义（P均<0.01）;免疫细胞化学染色显示Survivin蛋白表达减少,而Caspase₃蛋白被激活;Westernblot条带显示Survivin蛋白表达量降低,而Caspase₃蛋白则出现被激活的小片段。As2O3上述的3种作用均存在剂量依赖关系。结论:As2O3可能通过抑制Survivin蛋白活性,激活Caspase₃蛋白的表达而诱导MDA_MB₂31细胞凋亡。     

STAT3反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨STAT3反义寡核苷酸的抗肿瘤机制,为乳腺癌的基因治疗提供新的实验依据。方法应用阳离子脂质体介导STAT3反义寡核苷酸转染乳腺癌MCF-7细胞,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化;采用MTT比色法检测细胞增殖状态;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期;Western blot检测STAT3总蛋白和p-STAT3蛋白的表达。结果STAT3反义核苷酸转染乳腺癌细胞后,能抑制MCF-7细胞的增殖,促进MCF-7细胞的凋亡,STAT3蛋白的表达和磷酸化水平下降,出现G1期阻滞。结论STAT3反义核苷酸能抑制MCF-7细胞的增殖,促进MCF-7细胞的凋亡,这将为乳腺癌的治疗提供新的方向。     

针对Survivin基因的短发卡RNA诱导U251细胞凋亡

目的:观察针对Survivin基因的短发卡RNA(shRNA)对人脑胶质母细胞瘤U251细胞在体外凋亡的影响。方法:对U251细胞,稳定转染Survivin基因shRNA真核表达载体pWH1-SR的U251-SR细胞,以及稳定转染空载体pWH1的U251-P细胞,分别采用相差显微镜、HE染色、Hoechst染色、TUNEL染色以及透射电镜观察各组细胞的形态学特征;采用流式细胞术(FCM)定量测定各组细胞的凋亡细胞数量。结果:相差显微镜、HE染色、Hoechst染色、TUNEL染色以及透射电镜观察显示,U251-SR凋亡细胞明显增多,并呈现典型的细胞凋亡形态学改变;FCM定量分析凋亡细胞数量显示,与U251(2.1%)和U251-P(2.7%)相比,U251-SR凋亡细胞增加约6倍,达14.4%。结论:针对Survivin基因的shRNA能够在体外诱导U251细胞发生大量凋亡。