β_2肾上腺素受体基因在Sf9细胞中的表达及纯化

通过密码子优化、昆虫杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)构建、表达条件筛选及镍柱亲和层析,研究β_2肾上腺素受体(β_2 adrenergic receptor,β_2AR)基因(β_2AR)在昆虫细胞Sf9中的高效表达及纯化策略。方法:人工合成改造后的β_2AR基因,将其克隆至转移载体p Fast Bac1中,构建重组杆状病毒表达质粒p Fast Bac1-β_2AR’,转染昆虫细胞Sf9,优化表达条件,采用镍离子亲和层析法纯化重组蛋白并进行活性鉴定。结果:适宜的表达条件为感染细胞使用的感染复数5、感染后表达时间48 h,Western blot分析显示在47 k D左右处出现清晰的特异性条带,与预期结果一致。纯化的受体蛋白纯度大于90%,活性鉴定结果显示该受体蛋白可特异性吸附盐酸克伦特罗、沙丁胺醇及莱克多巴胺3种β激动剂的酶标记物,OD值分别为0.983、0.947和0.912。结论:本研究实现了β_2AR受体在Sf9细胞中的表达,且纯化后的受体蛋白保持了较好的β激动剂亲和活性,为利用β_2AR受体开展β激动剂多残留快速检测技术提供了依据。     

人工表达β_2肾上腺素受体的β激动剂多残留检测

为提高人工表达的β_2肾上腺素受体(β_2adrenergic receptor,β_2AR)蛋白的活性并对其进行活性鉴定,利用分子对接技术将β_2AR与15种β受体激动剂进行柔性分子对接,依据筛选出的与β受体激动剂结合力较好的β_2AR分子结构,人工合成和改造β_2AR基因,构建重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),表达出具有活性的受体蛋白。SDS-PAGE鉴定结果显示,受体蛋白大小在47 ku左右。活性鉴定结果显示,与克伦特罗、莱克多巴胺及非诺特罗均能够特异性结合,OD值分别为0.45、0.32、0.36,受体蛋白与激动剂的结合力与其活性鉴定结果基本一致。标准检测曲线结果显示,受体蛋白对β受体激动剂类药物具有一定检测能力。利用分子对接技术,成功获得一定活性的β_2AR受体蛋白,为β_2AR在β受体激动剂多残留检测中的应用奠定了基础。     

β2肾上腺素受体基因的改造及在无细胞合成体系中的表达

依据大肠杆菌密码子偏好性,设计合成β2肾上腺素受体（β2 adrenergic receptor,β2AR）基因序列,应用大肠杆菌无细胞系统对其进行高效表达,经负载镍离子的顺磁颗粒MagneHis? Ni-Particles纯化后,对受体蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和活性鉴定。结果表明：改造后的β2AR基因密码子适应指数（codon adaptation index,CAI）为0.96,GC含量从58%降低到46.17%,更有利于该基因在大肠杆菌系统中的表达。表达体系中优化后的Mg2＋浓度为22?mmol/L,此时表达量为1 250 μg/mL。SDS-PAGE分析显示,纯化蛋白在47?kDa左右出现清晰的特异性条带,与预期结果一致,纯度大于90%。直接酶受体分析检测结果显示,当纯化受体蛋白1∶500稀释包被时,该重组受体与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇及莱克多巴胺的酶标记物结合的OD值分别为0.976、0.836和0.728,亲和活性依次降低。β2AR蛋白在无细胞体系中的成功表达,为研发基于受体的β激动剂多残留快速检测技术提供了理论支持。     

Mincle受体蛋白克隆、原核表达与纯化

本研究通过应用基因工程技术,构建融合基因pET14b-Mincle的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白Mincle,并对其表达产物进行纯化、鉴定、透析复性。采用RT-PCR技术扩增小鼠Mincle的基因片段,将其克隆于载体pMD18-T中,并克隆到带有His-tag的原核表达载体pET14b中;重组质粒经酶切鉴定、序列比对验证正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达目的蛋白。经1mmol/LIPTG在37℃下诱导5h获得了分子量约为22kDa的重组融合蛋白的优化表达,SDS-PAGE、Western Blot和ELISA证实了重组蛋白的特异性。Mincle以包涵体形式在宿主中表达,利用Ni2+亲和柱进行纯化和生物膜透析复性,纯化和透析后的蛋白经WesternBlot、ELISA法定性鉴别以及用白色念珠菌(SC5314)整个灭活细胞对复性后蛋白的活性测定,透析后的Mincle重组融合蛋白能与白色念珠菌的特异性结合体现其生物活性,表明获得了具有活性的蛋白,为后续研究打下基础。     

猪β_2肾上腺素受体基因克隆及重组酵母表达质粒的构建

克隆猪β2AR基因并进行序列分析,构建其重组酵母表达质粒。采集新鲜猪肝组织,提取总RNA,经RT-PCR扩增、克隆及鉴定,获得猪β2AR的c DNA序列,并对该序列及编码的氨基酸序列进行分析。同时将目的基因插入p PICZαA酵母表达载体,构建重组表达质粒。克隆获得猪β2AR基因c DNA序列1257 bp,Genbank登录号为KF023571.1,编码418个氨基酸,蛋白分子质量46.73 ku。生物信息学分析表明,该基因与其他物种的β2AR基因相似性较高,均在83%以上,具有较高的同源性。经PCR和双酶切鉴定以及测序分析,证明成功构建了重组酵母表达质粒p PICZαA-β2AR。本研究为猪β2AR基因在毕赤酵母系统的表达及建立基于受体的β激动剂多残留检测方法奠定了基础。     

液相色谱-串联质谱法检测猪尿中26种β_2-受体激动剂类药物残留

目的建立了一种在猪尿中检测26种β_2-受体激动剂兽药残留的液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法。方法样品经β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶酶解后,用正丁醇及甲基叔丁基醚混合液萃取,过混合阳离子(MCX)固相萃取柱净化。采用0.1%甲酸溶液(A)和0.1%甲酸.乙腈(B)作为流动相进行梯度洗脱,质谱(ESI+)采用多离子检测模式(MRM)对β_2-受体激动剂的定量离子和定性离子进行监测。结果本方法在15 min内完成26种目标化合物的分析,实现高通量检测,可有效地提高β_2-受体激动剂检测效率。26种β_2-受体激动剂在5、10和20μg/kg添加水平的回收率为65.0%~105.3%,相对标准偏差小于11.5%(n=6),方法检出限为0.04~1.02μg/kg。结论该方法快速、准确、灵敏,适合测定猪尿中的β_2-受体激动剂类药物残留。     

毕赤酵母工程菌表达猪β-干扰素

根据毕赤酵母密码子偏爱,人工合成了猪β-干扰素(PoIFN-β)基因,构建了重组载体pPICZA-PoIFN-β。重组载体经Sac I线性化后,电击转入毕赤酵母GS115,对在含博莱霉素(Zeocin)平板上生长的转化子进行鉴定,得到分泌表达猪β-干扰素的毕赤酵母基因工程菌株GS115/pPICZA-PoIFN-β。以1%甲醇诱导GS115/pPICZA-PoIFN-β表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,工程菌株实现了猪β-干扰素的高效分泌表达,表达产物为相对分子质量22ku和26ku的混合物,表达蛋白量约为80mg/L。     

液相色谱-串联质谱法检测猪尿中26种β2-受体 激动剂类药物残留

目的 建立了一种猪尿中26种β2-受体激动剂兽药残留的液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法。方法 样品经β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶酶解后,用正丁醇及甲基叔丁基醚混合液萃取,过MCX固相萃取柱净化。采用0.1%甲酸(A) 和0.1%甲酸-乙腈(B)作为流动相进行梯度洗脱,质谱(ESI )采用多离子检测模式(MRM)对β2-受体激动剂的定量离子和定性离子进行监测。结果本方法在15 min内完成26种目标化合物的分离分析。26种β2-受体激动剂在5、10和20μg/L添加水平的回收率为65.0%~105.3%,相对标准偏差小于11.5%（n=6）,方法检出限为0.04 μg/ kg ~1.02 μg/kg。结论 该方法快速、准确、灵敏,适合测定猪尿中的β2-受体激动剂类药物残留。     

莱茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表达、纯化和多克隆抗体的制备及鉴定

BBSome蛋白复合物是纤毛蛋白组分之一,BBSome组装或纤毛运输缺陷可导致巴-比二氏综合征。其中,BBSome组分BBS2缺失已被临床证明是导致BBS的病因之一。莱茵衣藻是研究BBSome组装和纤毛运输的一种很好的模式生物。为深入研究BBS2的致病机制,需要特异性识别其BBS2蛋白的抗体。本文将莱茵衣藻BBS2 基因5''端399 bp的cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a-bbs2,转入大肠杆菌 BL21（DE3）细胞进行诱导表达。在8 mol/L尿素存在的情况下对该融合蛋白进行镍柱亲和纯化,并将纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔。SDS-PAGE电泳结果表明：分子量为15 kDa的重组6×His-BBS2融合蛋白为水不溶性蛋白。5次免疫后的抗莱茵衣藻BBS2抗血清效价高达1∶256 000。经Protein A琼脂糖CL-4B亲和纯化后的抗血清不仅在Western blotting 分析中能特异性识别莱茵衣藻BBS2,而且在免疫荧光染色分析中能精确定位BBS2于基体和纤毛内。这一多克隆抗体的成功制备为深入开展 BBS2在BBSome组装和纤毛运输中的分子作用机制提供了基础。     

人体中可溶性VEGFR-2酪氨酸激酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定

针对人体血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEG-FR-2)受体型酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK)进行体外表达,并对表达和纯化条件进行优化。构建表达VEGFR-2酪氨酸激酶重组大肠杆菌,通过研究不同诱导温度、IPTG浓度、诱导时间和超声条件等对蛋白表达的影响,采用Ni-NTA亲和层析法、Western Blot法ELISA方法对重组蛋白进行纯化、鉴定和活性测定。成功地将1 000 bp左右的VEGFR-2酪氨酸激酶DNA片段插入载体pQE30中,在优化条件下重组蛋白较好地可溶性表达。SDS-PAGE表明重组蛋白相对分子质量约为36 000,与预期一致,Western Blot分析表明它能与抗Flk-1和抗His抗体特异反应,ELISA检测结果表明重组蛋白具有利用ATP催化底物磷酸化的激酶活性。通过重组DNA技术使人体VEGFR-2酪氨酸激酶在大肠杆菌得到可溶性表达,纯化重组蛋白具有较高的活性。     

人载脂蛋白AV的克隆、表达及初步纯化

通过构建合适的质粒对载脂蛋白AV( ApoAV)进行可溶表达,并通过纯化得到较高纯度的ApoAV蛋白.含有人源ApoAV编码基因的质粒出发,利用载体ppSUMO构建融合表达质粒,转化入表达宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中,对其表达条件进行优化.然后利用ppSUMO上的His亲和标签对其进行亲和层析纯化.得到了较高纯...     

抗克百威单链抗体的可溶性表达、纯化与鉴定

在前期获得了抗克百威单链抗体基因的基础上,为进一步研究克百威单链抗体的性质,本文构建了两种抗克百威单链抗体可溶表达载体,p ET22b（+）-C-6His-CBF-sc Fv和p ET22b（+）-N-6His-CBF-sc Fv。比较His标签处于不同位置时,目的蛋白与Ni结合作用,发现His标签处于N端的目的蛋白与Ni结合作用比His标签处于C端时要强。对影响N-6His-CBF-sc Fv可溶性表达的条件进行优化,进而对其进行纯化。结果表明,当选用LB培养基,表达温度18℃,表达时间为16 h,IPTG浓度为1 mmol/L时可溶表达效果最好,可溶表达的目的蛋白量占总目的蛋白量从优化前的10%增加到50%。优化表达后的N-6His-CBF-sc Fv破壁上清经Ni Sepharose HP金属螯合亲和层析及阳离子交换层析两步纯化,纯化后纯度达90%。经ic ELISA鉴定,抗克百威单链抗体保持抗原结合活性,IC₅₀值为63.80 ng/m L。获得的抗克百威单链抗体可用于后续特性研究。      

重组人SOD2/3杂合酶原核表达及纯化方法的研究

目的摸索工程菌的表达条件并分离纯化,获得高活性的重组人SOD2/3杂合酶(rhSOD2/3)。方法利用含有质粒pET-28a-SOD2/3的工程菌诱导表达rhSOD2/3,考察诱导温度、诱导剂浓度、Mn2+浓度与加入时机对重组酶表达量与活性的影响;利用金属螯合亲和层析纯化rhSOD2/3。结果重组酶的表达量占菌体总蛋白40%~50%,最佳表达温度15℃、诱导剂浓度0.5 mmol/L,Mn2+浓度2.5 mmol/L,表达时间16 h,亲和层析能较好的纯化rhSOD2/3,比活从粗酶液220 U/mgpr提高到930 U/mgpr以上。结论成功获得了rh SOD2/3最适的表达条件及纯化方法。     

重组人SOD2/3杂合酶原核表达及纯化方法的研究

目的 摸索工程菌的表达条件并分离纯化,获得高活性的重组人SOD2/3杂合酶(rhSOD2/3).方法 利用含有质粒pET-28a-SOD2/3的工程菌诱导表达rhSOD2/3,考察诱导温度、诱导剂浓度、Mn2+浓度与加入时机对重组酶表达量与活性的影响;利用金属螯合亲和层析纯化rhSOD2/3.结果 重组酶的表达量占菌体...     

建鲤组织蛋白酶L的克隆表达、纯化及活性特征鉴定

首先采用TA克隆技术克隆建鲤组织蛋白酶L（Cathepsin L,CAT L）成熟肽基因片段并进行双酶切鉴定,进而构建表达载体CAT L-p ET-30a并转入宿主菌E.coli BL21,经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在37℃诱导2 h表达重组CAT L蛋白。而后经尿素梯度洗涤和镍离子亲和层析纯化目的蛋白,并利用SDS-PAGE检测诱导效果和纯化过程。最后以荧光合成肽底物（Z-Phe-Arg-MCA）测活法鉴定建鲤重组CAT L的热稳定性、p H稳定性,以及鱼糜生产和冻藏中常用添加剂对其活性稳定性的影响。双酶切鉴定结果表明成功克隆了目的基因片段,与鲤鱼CAT L基因序列相似性为99.11%。SDS-PAGE分析表明经诱导、尿素梯度洗涤及亲和层析后,成功获得高度纯化目的蛋白,分子量约28 ku。活性鉴定结果表明重组CAT L在20⁵0℃及p H3.0⁶.5范围内稳定;氯化钠、焦磷酸钠对重组CAT L活性的抑制作用呈现剂量依赖关系,而各浓度蔗糖、山梨醇则对其活性无明显作用。本研究成功克隆、表达和纯化了建鲤CAT L,并阐明了热、p H及鱼糜生产和冻藏中常用添加剂对该酶稳定性的不同影响。      

产β-葡萄糖苷酶真菌的筛选鉴定、纯化及酶学性质分析

经刚果红平板染色法从土样中筛选到3株产纤维素酶的真菌,通过对其β-葡萄糖苷酶活力的测定,选择一株相对活力较高的菌株进行菌种鉴定。在形态鉴定的基础上,通过内转录间隔区(ITS)序列构建系统发育树初步鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae),命名为giF-10。对米曲霉giF-10进行摇瓶发酵,经硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶层析、DEAE Cellulose 52离子交换层析进行纯化。得到纯化后的β-葡萄糖苷酶,比活力为40.84U/mg,分子质量约90kD;该β-葡萄糖苷酶最适温度为55℃;在30～50℃之间热稳定性好;最适pH值为4.5;pH4.0～6.0稳定性好;金属离子对酶活力具有一定的影响,Mn2+对酶具有较强的激活作用;Fe3+和Cu2+对β-葡萄糖苷酶活力有较强的抑制作用;该酶对水杨素和纤维二糖具有较强的底物特异性;β-葡萄糖苷酶对水杨素的动力学参数：Km为0.676mmol/L;对纤维二糖的动力学参数为：Km为2.906mmol/L。     

海洋低温β-半乳糖苷酶菌株筛选、鉴定及酶的分离纯化

筛选自黄海海泥产β-半乳糖苷酶的菌株CD6,依据形态学特征、生理生化特征及分子生物学特征鉴定为土生拉乌尔菌(Raoultella terrigena)。通过透析、超滤和柱层析方法分离纯化菌株β-半乳糖苷酶,测定该酶的最适反应温度为20℃,30℃剩余相对酶活85%;超过35℃酶活力即迅速下降,确定其为低温酶。     

荧光素酶编码基因luc在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化

以荧光虫荧光素酶报告载体pXP2 DNA为模板,扩增得到编码萤火虫荧光素酶(LUC)的基因(luc),构建了诱导型表达载体pQE30-luc.将载体导入 E.coli M15获得高效诱导表达萤火虫荧光素酶基因的重组菌M15/pQE30-luc.SDS-PAGE电泳分析显示:重组蛋白的相对分子质量为 60 000 ,表达量占全菌胞内可溶性蛋白质的50.9 %. 利用表达载体pQE30上的His*Tag标记选用Ni柱纯化表达具有活性的萤火虫荧光素酶(LUC),纯化后比酶活达到1.43×10 9 RFU/ mg,纯化倍数达10.6倍,回收率为25.3%.     

高铁含量猪血红蛋白的提取纯化及特性研究

取新鲜猪血红细胞裂解原液依次用10%、20%、30%、40%、50%、60%饱和度的硫酸铵沉淀,并分步收集沉淀,获得粗猪血红蛋白。结果表明,血红蛋白主要集中于50%和60%饱和度的硫酸铵沉淀中,杂蛋白主要集中在10%⁴0%饱和度的硫酸铵沉淀。50%和60%饱和度的硫酸铵沉淀后获得的粗猪血红蛋白用DEAE-Sephrose FF阴离子交换色谱进一步分离,均获得了单一蛋白峰,对出峰处各管样品进行SDS-PAGE电泳,均为分子量为16.4 ku的单一条带,为猪血红蛋白的单亚基分子量,经PDQuest软件分析纯度为95.2%,比市售的猪血红蛋白纯度（约为85%）高。采用Bradford法测定各步分离组分的蛋白浓度,结果表明,血红蛋白得率占总蛋白的49.69%;纯化猪血红蛋白的溶解度为32.96%;纯化后猪血红蛋白的含铁量为0.335%,与血红蛋白中理论铁含量0.35%接近。