“三明治”培养大鼠原代肝细胞模型评价P-gp介导的洛哌丁胺胆汁排泄

应用模型药物罗丹明123(Rh123)和"三明治"培养大鼠原代肝细胞(SCRH),建立并验证基于P-gp的胆汁排泄体外评价模型。SCRH培养5天后形成胆管,加入Rh123(10μmol.L-1),在含Ca2+和无Ca2+Hanks缓冲液中孵育,用LC-MS/MS分别测定Rh123的细胞蓄积量,计算胆汁排泄指数(BEI)和体外的内在胆汁清除率(CLbile,int)。在孵育体系中预先加入已知的P-gp抑制剂环孢素A(CyA)、tariquidar(TQD)和奎尼丁(QND)预孵育30 min,评价抑制P-gp转运体对底物胆汁排泄的影响。Rh123的BEI值为(17.8±1.3)%,平均CLbile,int值为(10.7±0.9)mL.min—1.kg—1,3个抑制剂对Rh123的胆汁清除均呈现剂量依赖性的抑制作用,表明模型构建成功。在此模型上,研究了P-gp介导的洛哌丁胺(LPAD)胆汁排泄以及P-gp抑制剂的影响。LPAD的BEI值为(12.9±1.2)%,平均CLbile,int为(6.1±0.3)mL.min—1.kg—1。CyA、TQD和QND对LPAD胆汁排泄也呈现浓度依赖的抑制作用,证实了P-gp转运体在LPAD胆管外排中的作用,与P-gp抑制剂合用可显著降低LPAD经胆汁的排泄。本文应用SCRH建立了B-Clear模型,为评价新药候选物基于转运体的胆汁排泄和相互作用提供了一个有用的体外工具。     

姜黄素对Caco-2细胞上P-糖蛋白活力及MDR1 mRNA表达的影响

目的研究姜黄素对Caco-2细胞上P-糖蛋白(P-gp)功能和表达的影响,并从分子水平研究其对MDR1mRNA表达的影响。方法采用流式细胞仪测定P-gp底物——罗丹明-123在细胞中的浓度,并分析Caco-2细胞上P-糖蛋白的表达量;采用RT-PCR法分析Caco-2细胞上MDR1基因mRNA的表达量。结果低、中、高浓度(0.1、0.5、1.0μmol.L-1)的姜黄素增加了罗丹明-123的外排,其外排量分别增加了6.2%、22.2%和33.8%(P<0.05);0.1～1.0μmol.L-1姜黄素与细胞孵育72h后,细胞膜上的荧光强度随浓度增加而增强(P<0.05),P-gp表达量是空白对照组的4倍,MDR1基因mRNA表达水平上调了1.58倍。结论姜黄素并不是P-gp的抑制剂,它能在较低浓度以及较短时间内(1h)增强Caco-2细胞上P-gp的功能活性,从而减少罗丹明-123在细胞内的蓄积。长时间(72h)应用姜黄素可以诱导P-gp和MDR1mRNA的表达。姜黄素将有可能引起相应的药物-药物/食物的相互作用。     

紫杉醇对肝癌细胞HepG2和大鼠原代培养肝细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的研究北大核心CSCD

目的探究紫杉醇对肝癌细胞HepG2和大鼠原代培养肝细胞增殖抑制和凋亡的影响。方法将肝癌细胞HepG2和原代肝细胞分别分为阴性对照组、不同浓度(5、10、20、40、80μg·L^(-1))紫杉醇组。MTT法检测不同浓度紫杉醇组作用肝癌细胞HepG2和原代肝细胞24、48、72 h的增殖抑制率;通过Hoechst 33258染色,在荧光倒置显微镜下观察细胞凋亡的形态学改变;Annexin V-FITC/PI双染,用流式细胞术检测不同浓度的紫杉醇对肝癌细胞HepG2和原代肝细胞细胞周期变化和凋亡率的影响。结果 MTT结果表明,紫杉醇对肝癌细胞HepG2和原代肝细胞剂量依赖性地抑制增殖(P<0.05)。Hoechst 33258染色结果显示,紫杉醇诱导肝癌细胞HepG2和原代肝细胞24 h后呈现凋亡形态学改变。流式结果提示,紫杉醇作用肝癌细胞HepG2和原代肝细胞24 h均能改变细胞周期,与阴性对照组相比,均能提高G_2/M期细胞比例(P<0.05),且阻滞作用随着药物浓度的增加而增强。其中紫杉醇能明显提高肝癌细胞HepG2 G_2/M期比例(P<0.05),G_0/G_1期细胞比例降低(P<0.05);S期细胞变化不大(P>0.05)。同时紫杉醇均能诱导两种细胞发生凋亡。但凋亡的程度不同,紫杉醇诱导肝癌细胞HepG2凋亡率明显高于原代肝细胞,且随着紫杉醇浓度的增高,细胞的凋亡率逐渐增加。结论紫杉醇能够抑制肝癌细胞HepG2和原代肝细胞的活力,是通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期在G_2/M期完成的。     

小檗碱、巴马汀和药根碱在“三明治”培养大鼠原代肝细胞中的胆汁外排特征

目的研究小檗碱、巴马汀和药根碱在大鼠原代细胞的胆汁外排特征。方法建立"三明治"培养大鼠原代肝细胞(sandwich cultured rat hepatocytes,SCRH)模型,分别加入小檗碱、巴马汀、药根碱,在含Ca²⁺和无Ca²⁺缓冲液中孵育,采用UPLC-MS/MS分别测定3种生物碱的细胞蓄积量,计算胆汁排泄指数和胆汁清除率,评价小檗碱、巴马汀、药根碱在大鼠原代细胞的胆汁外排特征;并考察P-gp、Mrp2抑制剂对3种活性成分在SCRH细胞模型中的外排转运影响。结果随着孵育时间的延长,3种生物碱的细胞蓄积量增加,且含Ca²⁺条件下的细胞蓄积量与无Ca²⁺条件下相比具有明显差异;P-gp抑制剂环孢素A、维拉帕米均能减少小檗碱、巴马汀、药根碱的胆汁排泄,且呈浓度依赖性,Mrp2抑制剂MK571、丙磺舒对3种生物碱的胆汁排泄无明显影响。结论小檗碱、巴马汀、药根碱均经过胆汁外排,P-gp介导了3种生物碱的胆汁外排,Mrp2未参与其胆汁排泄。     

水飞蓟宾通过调控AMPK活性抑制自由脂肪酸诱导的肝细胞炎症因子分泌

目的研究水飞蓟宾对自由脂肪酸(FFA)诱导肝细胞炎症因子分泌的抑制作用,并探讨其是否通过调节腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路实现。方法将HepG2细胞分为对照组、模型组和水飞蓟宾组。水飞蓟宾组(80和160μmol·L-1)预孵育HepG2细胞4h后,用500μmol·L-1的FFA处理HepG2细胞24h。Real-time PCR和Elisa法测定炎症因子IL-1β和TNF-α的mRNA及蛋白表达,油红O染色检测脂质生成情况,Western Blot测定AMPK和p-AMPK的蛋白相对表达量。用AMPK抑制剂或水飞蓟宾孵育细胞后用FFA处理,Elisa法测定炎症因子的生成情况。结果水飞蓟宾组可降低FFA诱导炎症因子生成增加,降低肝细胞中脂质含量的积累。Western Blot测定结果发现,水飞蓟宾可增加AMPK的磷酸化,AMPK抑制剂可逆转水飞蓟宾对炎症因子生成的抑制作用。结论水飞蓟宾组可通过AMPK信号通路抑制FFA诱导肝细胞炎症因子的表达。     

维拉帕米与加温对MCF-7/Adm细胞株多药耐药的实验研究

目的观察维拉帕米(Vrp)与加温对人乳腺癌细胞敏感株和耐药株耐药的逆转作用和协同作用。方法以人乳腺癌细胞株MCF-7为对照,以人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adm为研究对象,观察阿霉素(Adm)浓度为3μg.ml-1、37℃~43℃条件下,分别加入不同浓度的Vrp(0~5μmol.L-1)时,MCF-7与MCF-7/Adm亚细胞内阿霉素的荧光强度、温度、浓度分别与荧光强度间的变化趋势。结果MCF-7/Adm细胞对于阿霉素的敏感性明显低于MCF-7细胞,MCF-7组的亚细胞内阿霉素荧光强度较高,细胞凋亡率亦高;MCF-7/Adm随温度和Vrp浓度的增加,Adm荧光强度向胞核增加,细胞凋亡率也增加。结论加温联合耐药逆转剂Vrp能协同增强Vrp对MCF-7/Adm的耐药逆转作用。     

维拉帕米与加温对MCF-7/Adm细胞株多药耐药的实验研究

目的观察维拉帕米(Vrp)与加温对人乳腺癌细胞敏感株和耐药株耐药的逆转作用和协同作用。方法以人乳腺癌细胞株MCF-7为对照,以人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adm为研究对象,观察阿霉素(Adm)浓度为3μg.ml-1、37℃~43℃条件下,分别加入不同浓度的Vrp(0~5μmol.L-1)时,MCF-7与MCF-7/Adm亚细胞内阿霉素的荧光强度、温度、浓度分别与荧光强度间的变化趋势。结果MCF-7/Adm细胞对于阿霉素的敏感性明显低于MCF-7细胞,MCF-7组的亚细胞内阿霉素荧光强度较高,细胞凋亡率亦高;MCF-7/Adm随温度和Vrp浓度的增加,Adm荧光强度向胞核增加,细胞凋亡率也增加。结论加温联合耐药逆转剂Vrp能协同增强Vrp对MCF-7/Adm的耐药逆转作用。     

新钙调素抑制剂E6对纯化的原代培养大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白活性的影响

目的：研究新的钙调素抑制剂E6对纯化的原代培养大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白活性的影响．方法：使用流式细胞仪纯化大鼠脑微血管内皮细胞，通过检测P-糖蛋白底物罗丹明123在大鼠脑微血管内皮细胞中的荧光评估E6对P糖蛋白功能的影响．结果：使用流式细胞仪能将大鼠脑微血管内皮细胞从其它杂细胞中分离纯化，3，10μmol／LE6和50umol／L维拉帕米能显著提高大鼠脑微血管内皮细胞内罗丹明123的含量（P〈0.01),10μmol/L E6能使罗丹明123的胞内浓度增加接近三倍,而无P-糖蛋白表达的人脐静脉内皮细胞中的罗丹明123浓度则不受影响.结论:E6能显著抑制大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白活性.     

细胞内游离钙在辛伐他汀诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡中的作用

目的　研究 3 羟 3 甲戊二酰辅酶A (HMG CoA)还原酶抑制剂辛伐他汀诱导血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的机制。方法　以荧光染料Fura 2 /AM负载后荧光分光光度计法检测细胞内游离钙浓度 ,以DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪PI/膜联蛋白 (an nexin)V染色及半胱天冬酶 3激活来检测细胞凋亡。结果　辛伐他汀 30 μmol·L- 1孵育VSMC后 ,细胞内游离钙浓度显著升高 ,6h时达对照的 3倍以上 (P <0 .0 1) ,维拉帕米 80 μmol·L- 1与辛伐他汀 30 μmol·L- 1共同孵育VSMC 6h后细胞内游离钙浓度为 (14 4± 34)nmol·L- 1(P <0 .0 1)。辛伐他汀可诱导细胞凋亡率增高、“DNA梯状”样改变及半胱天冬酶 3的激活 ,这些变化均可被维拉帕米所逆转。结论辛伐他汀通过使细胞外钙大量内流而诱导VSMC凋亡。     

蛋白酶体抑制剂对肝癌细胞多药耐药基因表达的影响

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对表阿霉素(EPI)诱导肝癌细胞系HepG2细胞多药耐药(MDR)基因表达的影响。方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药(MDR)基因mRNA的表达。结果经1μg/mlEPI处理12h后,HepG2细胞MDR基因mRNA转录水平增高。联合应用1μg/mlEPI和1μmol/LMG132,HepG2细胞MDR基因mRNA表达较单用EPI时降低。结论MG132能够下调表阿霉素处理后HepG2细胞MDR基因mRNA转录水平。