苹果MdGA20ox1 基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

 以苹果砧木SH40[（Malus × domestica）× M. honanensis]为试材,采用RT-PCR 结合RACE 技术从SH40 茎尖中克隆得到一个赤霉素合成关键酶基因（GA20–氧化酶基因）,命名为MdGA20ox1, 其cDNA 全长1 579 bp,编码392 个氨基酸。该基因在GenBank 登录号为KC493633。氨基酸序列同源性 分析表明：MdGA20ox1 与玉米、拟南芥、梨等植物GA20ox 具有55.9% ~ 96.7%的相似性。洋葱表皮细 胞瞬时表达显示,MdGA20ox1 蛋白定位于细胞核与细胞质膜。植株生长量测定和相对定量表达结果表明, MdGA20ox1 基因在砧木SH28、SH40 和M26 自根苗的表达呈先下降再上升然后下降的趋势,这与其生长 动态基本一致。嘎啦/SH28 的植株生长量和MdGA20ox1 表达量最高,嘎啦/M26 次之,嘎啦/SH40 最低, 初步表明该基因的表达有与苹果植株矮化程度呈负相关的趋势。MdGA20ox1 在嘎啦/SH40 和嘎啦/SH28 不同组织中的表达模式一致,且半矮化类型砧木SH28 嫁接‘嘎啦’,其茎尖、幼叶、成熟叶和枝皮中的 表达量均高于矮化类型SH40 嫁接‘嘎啦’。     

短枝型苹果赤霉素受体基因MdGID1a 及其启动子克隆和表达分析

 以短枝型富士苹果‘龙富短枝’（Malus × domestica Borkh.‘Longfu Duanzhi’）枝条为试材, 采用RT-PCR 结合RACE 技术,克隆获得苹果赤霉素受体基因MdGID1a,GenBank 基因数据库的登录号 为JF516247。该基因编码区共1 035 bp,推测其编码345 个氨基酸。氨基酸序列分析显示,其具有HSL 基因家族的保守氨基酸结构域HGG 和GXSXG,与其它植物赤霉素受体基因具有较高的同源性。其启动 子序列包含植物激素和光等响应元件。实时定量qRT-PCR 分析表明,MdGID1a 在短枝型‘龙富短枝’和 普通型‘长富2 号’枝条不同生长阶段、在叶片、枝条、果实、花和叶芽中的表达水平存在明显差异。 苹果赤霉素受体基因MdGID1a 在短枝型苹果枝条伸长过程中具有一定的调控作用。     

菊花叶绿素a/b结合蛋白基因CmLhcb1及其启动子的克隆和表达分析

 以切花菊品种‘公子’cDNA为模板克隆出叶绿素a/b结合蛋白同源基因cab,其开放阅读框为798 bp,编码266个氨基酸。经多物种间比对分析,确认其属于cab基因家族的Lhcb1类,命名为CmLhcb1。同源克隆菊花品种‘清露’Lhcb1基因,氨基酸序列与‘公子’完全相同。CmLhcb1在叶片中的表达量比在茎、花和根中高,弱光和GA₃处理使CmLhcb1表达上调,多效唑处理后CmLhcb1表达量受到抑制。CmLhcb1的表达受昼夜节律调节,白天表达量显著高于夜间。通过high-efficiency TAIL-PCR（hiTAIL-PCR）方法克隆到‘公子’切花菊CmLhcb1起始密码子上游序列715 bp和‘清露’起始密码子上游序列716 bp,序列经PLACE数据库的比对分析,发现有很多与非生物和生物胁迫相关的元件,主要与光照、GA、ABA、水分、水杨酸和病毒相关,CmLhcb1启动子是光诱导型启动子,具有GT1-box和Z-box。     

梨贝壳杉烯酸氧化酶基因PcKAO1 的克隆与表达分析

 以梨矮化砧木‘中矮1 号’新梢叶片为试材,根据苹果基因组中相关序列信息设计特异引 物,通过RT-PCR 的方法克隆了梨赤霉素合成过程中关键酶--贝壳杉烯酸氧化酶（KAO）基因的编码 框全长序列。该序列全长1 568 bp,开放阅读框（ORF）编码503 个氨基酸,相对分子量为57.59 kD,等 电点为9.47,氨基酸序列与其它物种已知的KAO 序列具有53.14% ~ 98.61%的相似性,且具有细胞色素 P450 家族蛋白典型的功能结构域和跨膜结构域,将该基因命名为PcKAO1,GenBank 登录号为 KC153027.1。用同样的方法克隆了对照梨品种‘早酥’（乔化）和‘锦香’（半矮化）的PcKAO1 基因, 通过比对分析发现3 个品种的PcKAO1 基因间仅有个别碱基差异,其编码的蛋白序列完全一致。RT-PCR 半定量分析表明：PcKAO1 基因在‘中矮1 号’各个检测的器官组织中均有表达,其中以种子和子房中的 表达量最高;在3 个品种的新梢叶片中,除新梢生长初期（5 月10 日）之外,其他时期矮化砧木‘中矮 1 号’均低于乔化和半矮化的对照品种‘早酥’和‘锦香’,而在这些时期‘中矮1 号’新梢生长逐渐减 缓乃至停长。     

苹果乙烯信号转导相关基因MdEIL1的克隆及功能鉴定

以苹果‘嘎拉’（Malus × domestic‘Royal Gala’）为试材,分离了乙烯信号转导相关的MdEIL1基因（基因序列号：MDP0000423881）。序列分析表明,该基因包含长为1 980 bp完整的开放阅读框,编码658个氨基酸的蛋白。进化树分析表明MdEIL1属于EIN3/EIL转录因子家族蛋白。定量分析显示,MdEIL1基因在苹果的根、茎、叶、花和果实中有不同程度的表达,而且它的表达也受到乙烯、生长素和细胞分裂素的诱导。通过原核表达试验体外诱导MdEIL1蛋白成功,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。MdEIL1基因在拟南芥中异位表达,增强其乙烯响应,在暗处表现为下胚轴变短,并且AtERF1的表达量上升,显示转基因植株对乙烯的敏感性提高。     

苹果酰基辅酶A结合蛋白2 编码基因MdACBP2的克隆和表达分析

 酰基辅酶A结合蛋白（ACBP）是一个保守的蛋白家族,在酰基酯辅酶A的转运过程中发挥重要作用。在水稻和拟南芥中鉴定的ACBP除了参与长链酰基辅酶A的转运以外,还参与了植物对生物和非生物胁迫的反应。为了探讨在苹果树中是否也存在参与植物对逆境反应的ACBP,并可用于改良苹果品种,以提高抗逆能力,从苹果品种‘鸡冠’中克隆、鉴定了一个ACBP基因,命名为MdACBP2。MdACBP2包含一个378 bp的开放阅读框,编码包含125个氨基酸残基的蛋白质;推定的氨基酸序列中包含有一个ACB结构域,无信号肽序列。序列和结构特征表明该基因是ACBP家族ClassⅠ亚族的成员。利用荧光定量PCR技术检测MdACBP2的表达,发现在苹果的根、叶、花、幼果、枝皮、芽等组织中均有表达,在叶中的表达量最高,在幼果中的表达量最低,这一表达模式暗示MdACBP2可能参与多种生理途径。不同胁迫处理的时序表达分析表明,MdACBP2的表达能被轮纹病病原菌Botryosphaeria dothidea侵染和10% PEG渗透胁迫所抑制,低温胁迫则能诱导MdACBP2的表达,1 mmol·L^-1 Pb(NO₃)₂处理对MdACBP2的表达没有显著影响。推测MdACBP2可能参与了苹果对低温胁迫的防御反应。     

葡萄赤霉素受体基因VvGID1A 的分离、亚细胞定位及表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的花序、茎尖、叶片以及果实为 试材,应用RT-PCR 结合RACE 技术克隆得到GID1A 同源基因全长cDNA 序列,命名为VvGID1A（基因 登录号：JQ669511）,全长1 681 bp,含有1 个1 035 bp 的开放阅读框,编码344 个氨基酸,该氨基酸序 列还包含两个激素敏感酯酶家族保守的结构域HGG 和GXSXG。系统进化分析表明,VvGID1A 与蒺藜苜 蓿、棉花和拟南芥之间的一致性分别为70.25%、70.08%和68.21%。荧光定量RT-PCR 结果表明,VvGID1A 在葡萄花序、老叶和卷须中表达水平高于茎尖和幼叶,而在GA 处理果实中的表达水平低于未处理的对照 样品。瞬时表达载体的构建及洋葱表皮细胞转化后,洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,该基因的表达 产物定位在细胞核上。     

茄子花青素合成相关基因SmMYB 的克隆与表达分析

 以茄子（Solanum melongena L.）‘YZ14’（紫茄）和‘YZ3’（白茄）为试验材料,采用 同源克隆与RACE（rapid amplification of cDNA ends）相结合的方法克隆了茄子MYB 基因cDNA 及gDNA 全长序列,命名为SmMYB。序列分析结果表明：该基因cDNA 全长1 035 bp,开放阅读框837 bp,编码 278 个氨基酸,与辣椒（Capsicum annuum L.）MYB 转录因子氨基酸序列相似性达71%;成熟蛋白的等电 点为8.47,具有2 个典型的DNA-binding 结构域且亚细胞定位于细胞核;gDNA 全长3 834 bp,包含3 个 外显子及2 个内含子。荧光半定量检测结果表明：SmMYB 在茄子根、茎、叶、花瓣、果皮中均有表达, 但表达水平具有组织特异性;遮光处理后紫色茄子果皮中该基因表达量变化与花青素合成量变化趋势相 似。推测SmMYB 为一个MYB 转录因子基因,正向调控茄子花青素的合成。     

洋葱开花相关基因AcLFY 的克隆与表达分析

 以洋葱（Allium cepa L.）品系‘1007’为试材,采用同源基因克隆及RACE-PCR 的方法, 获得植物开花调控关键基因LEAFY 的同源基因的cDNA 序列,命名为AcLFY,GenBank 登录号为 JX275962。序列分析表明,该基因包含1 个1 119 bp 的开放阅读框,编码372 个氨基酸,该氨基酸序列 含有5′-N 端脯氨酸富集区,亮氨酸拉链结构和中央酸性区,具有LEAFY（FLO）家族的典型结构特征。 同源分析表明,该氨基酸序列与水仙的同源性接近70%,与其他高等植物LEAFY 类蛋白的同源性均在 50%以上。进化树分析表明AcLFY 与单子叶植物的亲缘关系高于双子叶植物。荧光定量结果显示,AcLFY 在洋葱抽薹开花的整个过程中都有表达,在抽薹初期的花序分生组织中表达量最高,在花器官中只有微 量表达,花器官形成后,主要在叶片中表达。     

牡丹开花调控转录因子基因PsCOL4的克隆、表达与系统进化分析

采用RT-PCR 方法从‘紫罗兰’牡丹（Paeonia suffruticosa‘Ziluolan’）花芽中克隆得到1个重要开花调控转录因子基因CONSTANS-like,其cDNA 全长1 125 bp,编码373 个氨基酸。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含两个B-box 型锌指结构和1 个CCT 结构域,与拟南芥的AtCOL4 最为相似,将其命名为PsCOL4,GenBank 登录号为KF113358。系统进化树分析表明,PsCOL4 与葡萄编码的VvCOL4的亲缘关系最近,属于第1 群组CO 类似基因。实时定量PCR 表明,PsCOL4 在不同组织器官中均有表达,其中茎和叶中的表达量最高,根中最低。在花芽不同发育时期,PsCOL4 的表达呈现递减趋势。不同光周期条件下,PsCOL4 的表达稍有不同,短日照条件下在叶中的表达有所增加,茎中稍有减少。     

柑橘半胱氨酸蛋白酶基因CsCysP的分离、亚细胞定位及表达分析

以‘奥林达’夏橙[Citrus sinensis（L.）‘Olinda’]为材料,采用RT-PCR结合RACE技术从果萼离层中分离到1个半胱氨酸蛋白酶类基因,命名为CsCysP（GenBank登录号：KJ093387）。该基因的cDNA全长为1 485 bp,开放阅读框（ORF）为1 083 bp,推测可编码360个氨基酸残基的多肽。其基因组序列与cDNA比对后显示有3个内含子。分析发现,CsCysP属于papain-like（木瓜蛋白酶,C1A）家族的半胱氨酸蛋白酶,与拟南芥、大豆、烟草、杨树等的同源蛋白有73% ~ 83%的相似性。亚细胞定位结果显示CsCysP蛋白定位在细胞壁上。qRT-PCR结果表明CsCysP在老叶、成熟果实果萼离层和花中的表达量明显高于幼苗的根、茎、叶。CsCysP的表达被脱落酸、高盐和PEG6000诱导,低温、乙烯、芸薹素内酯、水杨酸和甲基茉莉酸可抑制其表达。利用基因工程手段获得了柑橘过表达CsCysP的5个转基因株系。     

唐菖蒲质膜水孔蛋白基因GhPIP1;1 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE技术从唐菖蒲（Gladiolus hybridus‘Eerde’）花瓣中克隆得到1个质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins,PIPs）类的水孔蛋白基因,命名为GhPIP1;1。该基因cDNA 全长1 130 bp,包含867 bp完整开放阅读框（ORF）,编码288个氨基酸。克隆和分析相应的gDNA序列（2 098 bp）表明,其包含由4个外显子和3个内含子组成的编码区序列。氨基酸序列分析表明GhPIP1;1具有水孔蛋白家族高度保守的2个NPA（Asn-Pro-Ala）基序。同源性分析显示GhPIP1;1氨基酸序列与同科的荷兰鸢尾（Iris hollandica）PIP1氨基酸序列的同源性达94%。半定量RT-PCR分析表明,GhPIP1;1在唐菖蒲花瓣、雄蕊、雌蕊、茎、苞片和叶片等均有表达,但表达量以花瓣中最高,叶片中最低;GhPIP1;1在花蕾至花朵盛开期间的表达水平较高且变化不明显,但在花朵盛开后的萎蔫过程中表达水平明显降低。     

香石竹切花水孔蛋白基因DcPIP2的克隆及特征分析

 采用RT-PCR和RACE技术从香石竹（Dianthus caryophyllus L.）叶片中获得质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）类水孔蛋白（aquaporins,AQP）基因的cDNA全长序列,命名为DcPIP2,GenBank登录号为GU989036。该cDNA全序列长983 bp,包含有858 bp的完整阅读框（ORF）,编码285个氨基酸,分子量约为30.6 kD。克隆相应的DcPIP2基因组全长序列得知,该基因长2 635 bp（GenBank登录号为JF706350?）,包含由3个外显子和2个内含子组成的编码区序列。同源性分析显示,DcPIP2氨基酸序列与陆地棉（Gossypium hirsutum）PIP2;3（ACB42440）、麻疯树（Jatropha curcas）AQP（ABM54183）和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）PIP2（ACV66986）氨基酸的同源性分别为89%、88%和87%。利用实时荧光定量PCR技术研究表明,DcPIP2基因在香石竹切花的叶片、茎颈部、花瓣、雌蕊、雄蕊和萼片中均有表达,表达量为雌蕊 > 花瓣 > 雄蕊 > 萼片 > 茎颈部 > 叶片。     

甜瓜抗旱性相关基因MeP5CS的克隆、序列分析及表达

用GenBank登录的抗旱相关基因序列进行比对,在保守区域设计一对引物,利用RT-PCR获得了一个甜瓜抗旱相关基因,命名为MeP5CS。生物信息学分析表明,该基因全长1000bp,开放阅读框(ORF)753bp,编码250个氨基酸;MeP5CS蛋白大小约82.18kD,理论pI值为4.90;MeP5CS编码蛋白与桐花树、猕猴桃和葡萄同源性较高,分别为94%、81%和73%。该蛋白含约40.2%的α-螺旋,25.2%的β-转角,34.6%的不规则卷曲,在第19～20氨基酸之间存在信号肽的剪切位点;MeP5CS编码蛋白是疏水性蛋白,有2个跨膜螺旋结构和13个磷酸化位点。半定量RT-PCR表明,MeP5CS在甜瓜根系中表达最高,茎中次之,叶片中表达较低。MeP5CS基因在甜瓜组织中的表达受丛枝菌根真菌(AMF)和水分胁迫双重诱导,与甜瓜的组织特异性和水分胁迫处理时间有关。水分胁迫条件下,接种AMF可以显著增加甜瓜幼苗脯氨酸的积累量,菌根甜瓜幼苗的脯氨酸积累与MeP5CS基因的表达呈正相关。     

百合肌动蛋白基因lilyActin 的克隆与表达分析

 为了在百合功能基因表达研究中选择一个理想内参基因,依据岷江百合cDNA 文库所获得的百合肌动蛋白（Actin）基因的EST 序列,采用RACE 技术进行该基因cDNA 全长克隆,并利用实时荧光定量PCR 分析其在不同组织中的表达模式,获得百合肌动蛋白基因cDNA 全长序列（GenBank 登录号：JX826390）,命名为lilyActin。该基因cDNA 全长1 367 bp,其中,5′非编码区91 bp,3′非编码区233 bp,开放读码框1 134 bp,编码377 个氨基酸。序列比对发现,该基因与其它15 种植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性达98%。进化分析显示,百合肌动蛋白与郁金香肌动蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR 结果显示,该基因在百合的花蕾、叶片和鳞片组织中恒定表达,表明相对于其他物种的内参基因,lilyActin 更适宜作为百合属植物的内参基因。     

茄子花青素合成中SmTTG1、SmGL3和SmTT8的表达及其蛋白质间的相互作用

采用同源克隆方法从茄子（Solanum melongena L.）中分离得到3个基因,分别命名为SmTTG1、SmGL3和SmTT8。序列分析表明,SmTTG1的cDNA全长1 220 bp,开放阅读框为1 029 bp,编码342个氨基酸,与马铃薯（S. tuberosum L.）TTG1基因序列同源性达到94%,成熟蛋白等电点为4.90,具有典型的WD结构域;SmGL3的cDNA全长2 329 bp,开放阅读框为1 887 bp,编码628个氨基酸,与马铃薯GL3基因序列相似性达到94%,蛋白等电点为5.61,有典型的HLH结构域;SmTT8的cDNA全长2 242 bp,开放阅读框为1 896 bp,编码631个氨基酸,与马铃薯TT8基因序列同源性为85%,蛋白等电点为5.18,有典型的HLH结构域。荧光定量检测结果表明,SmTTG1、SmGL3和SmTT8在茄子根、茎、叶、花、果皮和果肉中均有表达,但表达水平具有组织特异性。酵母双杂交结果表明,SmTTG1与SmTT8、SmGL3之间有相互作用,并且SmTTG1、SmGL3和SmTT8都与SmMYB之间发生作用。推测SmTTG1为WD40转录因子,SmGL3和SmTT8为bHLH转录因子,它们都参与调控茄子花青素的合成。     

甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因CmGAS1的表达与功能分析

甜瓜（Cucumis melo L.）是棉子糖系列寡糖（Raffinose Family Oligosaccharides,RFOs）转运型植物。肌醇半乳糖苷合成酶（GAS）是催化RFOs合成的关键酶。甜瓜CmGAS1基因（GenBank登录号为AY077642.1）的cDNA全长为1 903 bp,开放阅读框（ORF）为996 bp,编码331个氨基酸。CmGAS1蛋白分子量约为38 kD,理论等电点（pI）为4.81。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,CmGAS1氨基酸序列与黄瓜（AAO84915.1）亲缘关系最近,同源性为98.79%,与西瓜（Cla009222）同源性为97.58%。荧光定量结果表明,甜瓜叶片从幼叶（库）至成熟叶（源）CmGAS1的表达显著升高,第5节位叶片达到最大值。去掉50%叶片植株与对照相比,完全展开功能叶片的CmGAS1表达量明显升高。应用CmGAS1特异性启动子构建CmGAS1的过表达载体,并采用农杆菌介导进行甜瓜遗传转化,获得了PCR阳性转化植株,转化植株完全展开功能叶片的净光合速率以及叶片中的蔗糖、棉子糖、水苏糖含量与野生型相比均有所提高。推测CmGAS1在甜瓜叶片棉子糖系列寡糖合成过程中起重要作用。     

柑橘转录因子基因CitMYB22的分离、表达及亚细胞定位分析

以‘资阳’香橙(Citrus junos‘Ziyang’)为材料,利用RT-PCR技术,分离到1个MYB基因,CitMYB22。比对分析发现,CitMYB22含有两个内含子,开放阅读框(ORF)为696 bp,可编码231个氨基酸残基的多肽。氨基酸聚类和结构分析表明,CitMYB22属于MYB类转录因子家族中的R2R3-MYB亚家族。进化树分析表明,CitMYB22与拟南芥参与逆境响应的R2R3-MYB亚家族成员At MYB15的同源性最高。克隆CitMYB22的ATG上游2 500 bp内启动子顺式元件,预测其含有多个与植物逆境和激素应答相关的顺式作用元件,如HSE、SARE和MBS等。亚细胞定位结果显示CitMYB22蛋白定位在细胞核中。实时定量结果表明,CitMYB22在叶、花中的表达量明显高于根和幼果,且在外源脱落酸、水杨酸、甲基茉莉酸、1–氨基环丙烷基羧酸以及高盐、脱水和4℃低温等非生物逆境胁迫下,均被诱导上调表达,推测CitMYB22可能与‘资阳’香橙的抗逆性相关。     

红肉苹果冷信号基因MdICE1的表达及其蛋白与MdMYB的互作

根据拟南芥AtICE1蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到苹果同源蛋白序列,利用DNAMAN软件设计特异性引物并克隆苹果冷信号基因（MDP0000662999）,暂命名为MdICE1。以从新疆红肉苹果与‘富士’杂交F1代中选出的‘紫红3号’叶片诱导出的红色愈伤组织为试材克隆MdICE1,测序发现该基因的开放阅读框长度为1 626 bp,编码541个氨基酸。进化树分析表明,MdICE1与AtICE1在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。氨基酸序列比对发现,MdICE1存在bHLH基序。低温处理有利于苹果愈伤组织花青苷的累积;与培养在24 ℃下的愈伤组织相比,低温（8 ℃）诱导苹果愈伤组织冷信号基因MdICE1以及花青苷合成相关转录因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表达。酵母双杂交试验证明MdICE1可以与MdMYB10相互作用;亚细胞定位发现MdICE1蛋白存在于细胞核内;转化大肠杆菌并诱导获得了MdICE1的重组蛋白,为进一步研究MdICE1蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。