ldhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TCCC11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△ldh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因ldhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的。结果表明,与出发菌株相比ldhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6%,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6%和5.5%,但生物量略有下降。本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考。     

NCgl1221敲除和pyc过表达对谷氨酰胺发酵的影响

谷氨酰胺在生命活动中具有重要的作用,已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。谷氨酸是谷氨酰胺生物合成的前体物质,也是谷氨酰胺生产过程中最常见的副产物。研究发现,NCgl1221基因的编码蛋白是谷氨酸分泌的重要载体,丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌回补途径中的关键酶。为减少谷氨酰胺发酵过程中谷氨酸的积累量并提高谷氨酰胺产量,本研究利用同源重组技术敲除谷氨酰胺生产菌GM34的谷氨酸分泌载体编码基因NCgl1221,获得GM34ΔNCgl1221菌株;构建了丙酮酸羧化酶基因pyc过表达菌株GM34-pXMJ19pyc。5 L罐发酵实验表明,NCgl1221基因缺失可以使得谷氨酸积累量降低19.05%,过表达pyc基因使得谷氨酰胺产量和转化率分别提高5.54%和2.37%。可见,敲除NCgl1221、过表达pyc能够有效降低谷氨酸分泌并提高谷氨酰胺产量。     

1dhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822 发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌（Corynebactenum glutamicum） TCCC 11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△1dh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因1dhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的.结果表明,与出发菌株相比1dhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6％,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6％和5.5％,但生物量略有下降.本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考.     

3-磷酸甘油醛脱氢酶促进谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸

在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) SNK118中表达NADP~+依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因,提高胞内NADPH水平,以提高L-精氨酸(L-Arginine)和L-鸟氨酸(L-Ornithine)发酵产量。通过NCBI数据库检索,选取了3个不同来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因。经测定酶活力,最终选择糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum) DSM 13864来源的NADP~+依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Csgap C)。构建了产L-精氨酸的重组菌SNK118/p XMJ19-Csgap C,当摇瓶发酵70 h时产L-精氨酸11. 55 g/L,糖酸转化率0. 13 g/g,与对照菌SNK118/p XMJ19相比,精氨酸产量和糖酸转化率分别提高了26%和10. 2%。在L-鸟氨酸生产菌株SNK118Δarg FΔargR中重组表达Csgap C,重组菌SNK118Δarg FΔargR/p XMJ19-Csgap C摇瓶发酵70 h产L-鸟氨酸27. 76 g/L,糖酸转化率0. 274 g/g,与对照菌SNK118Δarg FΔargR/p XMJ19相比,L-鸟氨酸产量和糖酸转化率分别提高了20. 1%和15. 6%。结果表明,异源表达Csgap C有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸的水平。     

精氨酸缺陷型菌株发酵生产反式-4-羟脯氨酸

为了获得高产反式-4-羟脯氨酸的菌株,基于大肠杆菌的代谢网络模型的指导,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Δput A为出发菌株,通过基因敲除技术成功敲除arg B基因,阻断L-脯氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-脯氨酸合成的代谢流,构建了精氨酸缺陷型菌株E.coli BL21(DE3)Δput AΔarg B。同时转入表达质粒p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp,该质粒含有突变基因pro B2,该突变基因所编码的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反馈抑制作用显著降低。摇瓶发酵结果表明,在外源添加600 mg/L L-精氨酸时,该重组菌株产反式-4-羟脯氨酸的量达到312.67 mg/L,较菌株E.coli BL21(DE3)Δput A/p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp提高了25.29%。     

代谢工程改造Corynebacterium glutamicum生产L-苹果酸

以提高L-苹果酸的产量为目标,采用一次交换两次同源重组的方法,利用反向筛选标记,在敲除了丙酮酸醌氧化还原酶编码基因(pqo),丙酮酸脱氢酶编码基因(pdh)和乳酸脱氢酶编码基因(lldh)的C.glutamicumΔpqoΔpdhΔlldh(C.glutamicumΔPPL)基础上,无痕敲除了L-苹果酸积累支流代谢途径的2个关键酶基因:苹果酸醌氧化还原酶编码基因(mqo)和苹果酸酶编码基因(male),同时敲入了苹果酸分泌转运蛋白基因(transb),获得了产L-苹果酸的工程菌株;采用高效液相色谱法检测了工程菌株C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的发酵产物。实验结果表明:C.glutamicum ATCC 13032发酵后不积累L-苹果酸,而工程菌C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale发酵48 h,积累了12.8 g/L的L-苹果酸,工程菌的糖酸转化率为33.18%,为利用C.glutamicum ATCC 13032发酵生产L-苹果酸提供了基础遗传资源。     

柠檬酸转运蛋白突变基因在L-亮氨酸发酵中的应用

该研究利用同源重组方法敲除L-亮氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ALDP的柠檬酸合酶基因glt A,并引入柠檬酸转运蛋白突变基因CP_103,获得一株能高效摄取柠檬酸的菌株。在此基础上,比较不同的柠檬酸添加方式对菌株的OD_(600nm)值、L-亮氨酸产量和糖酸转化率的影响。结果表明,通过引入柠檬酸转运蛋白突变基因CP_103,显著提高了C. glutamicum ALDPΔglt A的柠檬酸摄取能力。当初始发酵液中的柠檬酸添加量为5 g/L,并在发酵过程中通过流加的方式维持柠檬酸含量在10～15 g/L范围内,较出发菌株C. glutamicum ALDP,C. glutamicum ALDPΔglt ACP_103的OD_(600nm)值轻微下降,但是L-亮氨酸产量达到最高,为(22.5±1.5)g/L、糖酸转化率为23.1%,分别提高23.0%和48.1%。     

代谢工程构建谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸

非蛋白氨基酸5-氨基乙酰丙酸是合成四氢吡咯化合物的前体物,被广泛应用于医药、农业和畜牧业。为提升5-氨基乙酰丙酸合成效率,该研究以谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032为出发菌株,首先敲除L-谷氨酸输出蛋白编码基因NCgl1221阻断其分泌,菌株5-氨基乙酰丙酸产量达到0.62 g/L。然后利用脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)脚手架体系组装关键酶谷氨酰-tRNA还原酶和谷氨酸-1-半醛氨基转移酶,当二者比例为2∶1时最有利于5-氨基乙酰丙酸的合成,产量为0.84 g/L;为增强三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环,分别通过过表达pyc、ppc和pckA强化回补途径,结合过表达gltA强化柠檬酸合成,结果表明以共表达pckA和gltA的效果最佳;在此基础上通过敲除aceA并过表达pntAB以增强α-酮戊二酸和NADPH供应,所获菌株ALA-10的5-氨基乙酰丙酸产量为1.47 g/L。该研究可为提升5-氨基乙酰丙酸的发酵合成效率提供参考。     

谷氨酸棒杆菌代谢副产物对α-酮戊二酸积累的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中ldh基因编码乳酸脱氢酶,可以催化丙酮酸转化生成乳酸,ackA和pqo基因编码乙酸激酶和丙酮酸:醌氧化还原酶,可以催化丙酮酸转化为乙酸.为了研究这三个基因缺失对谷氨酸棒杆菌α-酮戊二酸积累的影响,以Cglutamic um GDK-10为出发菌株,通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建ldh,pqo,ackA,pqo和ackA基因缺失突变株GDK-14,GDK-15,GDK-16,GDK-17.对出发菌及上述重组菌株进行发酵验证比较,发酵结果表明:ldh和pqo基因缺失菌株的α--酮戊二酸产量分别比出发菌降低了8.54％和27.9％,而ackA基因的缺失使α-酮戊二酸产量比出发菌提高了8.99％.     

基于代谢途径改造谷氨酸棒杆菌生产L-缬氨酸

L-缬氨酸是一种重要的支链氨基酸，随着市场对其需求量的不断提升，进一步提高L-缬氨酸的产量和糖酸转化率具有重要意义。在该研究中，使用实验室保藏的谷氨酸棒杆菌VHL-1作为出发菌株，通过对L-缬氨酸合成路径进行代谢改造显著提高了L-缬氨酸的产量和丙酮酸前体物的供应。首先，通过敲除ldh(编码乳酸脱氢酶)、poxB(编码丙酮酸氧化酶)、pyc(编码丙酮酸羧化酶)基因以及弱化alaT(编码丙氨酸转氨酶)基因表达来实现丙酮酸的富集。其次，通过强启动子P_tuf替换ilvBNC操纵子原始启动子并增加ilvBN(编码乙酰羟酸合酶)基因拷贝数来增强丙酮酸向L-缬氨酸合成的碳代谢流。最后，通过过表达支链氨基酸转运蛋白编码基因brnFE和调节蛋白编码基因lrp增强L-缬氨酸胞外输出效率。最终构建的重组菌株VHL-9在5 L生物反应器中进行补料分批培养，L-缬氨酸产量可到达(82.5±5.6) g/L,生产强度为1.15 g/(L·h),糖酸转化率为0.302 g/g葡萄糖。     

有机氮源对L-色氨酸发酵的影响

以L-色氨酸生产菌Escherichia coli TRP03为供试菌株,研究了多种有机氮源对L-色氨酸发酵的影响。 首先对不同来源的酵母 粉进行了优化试验,确定一种最优酵母粉,摇瓶发酵时L-色氨酸可积累10.21g/L;利用5 L发酵罐发酵1.5～3.0h时,细胞出现二次生 长现象,选择添加氨基酸粉和氯化胆碱促进细胞生长,经优化实验,确定同时添加氨基酸粉2g/L、氯化胆碱0.5g/L可在很大程度上解 决细胞的二次生长问题并提高L-色氨酸产量至44.21g/L;为提高中后期菌体活力及产酸能力,选择在不同发酵时期流加质量浓度为 1g/L的酵母粉、蛋氨酸及谷氨酰胺混合液,确定10h流加时,中后期的活细胞数提高了30.18%,保证了菌体活力。菌株E. coli TRP03经36h发酵,可积累L-色氨酸51.23g/L,较未经任何优化的菌株提高41.91%。     

复合诱变筛选高产柠檬酸黑曲霉及其发酵研究

采用γ射线(Co60)及亚硝基胍复合诱变的方法对产柠檬酸黑曲霉菌株进行诱变。γ射线(Co60)诱变剂量为1400Gy,亚硝基胍的浓度为1mg/mL,作用时间为4min,在此条件进行复合诱变。经多轮筛选最终获得到一株产酸为15.5g/dL且遗传稳定性高的菌株。并对黑曲霉发酵产柠檬酸的工艺进行优化。确定种子液的最适条件:氮源选取豆饼粉,糖浓度为10%;最适发酵条件:培养温度为35℃,初始pH值5~6,氮源选取豆饼粉且氮源用量为0.8%,在50L发酵罐中进行中试试验,试验结果为周期63h,产酸17.94g/100mL,转化率为99.7%,比出发菌株发酵周期缩短3h,产酸提高10%,转化率提高5%。     

滑菇肽对青春双歧杆菌的益生作用

研究滑菇肽对青春双歧杆菌的体外益生作用。将滑菇肽添加到青春双歧杆菌液体培养基中,测定发酵和贮存过程中活菌数变化。结果表明,滑菇肽在添加量为0.5 g/L～4.0 g/L时对青春双歧杆菌生长具有促进作用,发酵12小时后活菌数最高可达1.78×10~9cfu/mL,为对照组的2.88倍(P<0.05)。滑菇肽能够增强青春双歧杆菌对酸性环境的耐受力,4℃冷藏28天后,活菌数仍维持在80%以上。添加1.0 g/L滑菇肽对青春双歧杆菌的促生长作用优于低聚果糖,发酵12小时后活菌数可达1.18×10~9cfu/mL,为对照组的2.04倍(P<0.05)。滑菇肽能够促进青春双歧杆菌生长,作为双歧因子应用于青春双歧杆菌产品具有潜在价值。     

不同β-葡萄糖苷酶性能分析及对罗汉果苷的转化

以Pichia pastorisGS115为宿主,对来源于特异腐质霉Humicolainsolens、棘孢曲霉Aspergillus aculeatus和黑曲霉Aspergillus niger的β-葡萄糖苷酶基因bglHi、bglAa和bglAn进行异源表达。以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,分析了3种酶的酶学性质,其中BglAn的酶活力最高,为90.83U/mg。3种酶的最适反应温度和最适pH值范围分别为55~65℃和5.0~6.0。在pH值为6.0、温度50℃、酶量2U的条件下,利用3种酶水解不同浓度的罗汉果苷Ⅴ。结果表明:不同来源的酶水解底物的特异性差别较大,其中BglHi和BglAa水解罗汉果苷Ⅴ生成罗汉果苷ⅢE的转化率较低,仅为5%~7%;而BglAn在底物质量浓度1mg/mL,反应20min时转化率为96.5%;提高底物质量浓度到5mg/mL,反应1h时转化率也可达97.9%,基本实现完全转化。通过酶法转化罗汉果苷Ⅴ,获得了较高纯度的产物罗汉果苷ⅢE,为后期开发不同结构、不同功能罗汉果苷类甜剂提供了新的途径。     

不同来源红缘拟层孔菌粗多糖的抗氧化活性

采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基、2,2’-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS）阳离子自由基、羟自由基清除实验和铁氰化钾还原法,对3 种不同产地（吉林、黑龙江、云南）红缘拟层孔菌子实体（Fomitopsis pinicola fruiting body,分别记为JFPF、HFPF、YFPF）、红缘拟层孔菌菌丝体（Fomitopsis pinicola mycelium,FPM）及其发酵液（Fomitopsis pinicola fermentation broth,FPFB）粗多糖的体外抗氧化活性进行对比研究;并采用紫外线和H2O2氧化损伤酵母细胞保护实验模型,评价上述5 种粗多糖对氧化损伤酵母细胞的保护作用。结果表明：这5 种红缘拟层孔菌粗多糖均表现出不同程度的体外抗氧化活性,并均能明显提高氧化损伤酵母细胞的存活率,且呈一定的剂量依赖效应;其中,YFPF粗多糖对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基的清除能力及还原能力在5 种粗多糖中较强;在质量浓度为5 mg/mL时,其对3 种自由基的清除率分别为78.78%、99.24%、64.38%,还原能力为0.84。FPM粗多糖对氧化损伤酵母细胞保护作用最强,可明显提高氧化损伤酵母细胞的存活率,当其质量浓度为20 mg/mL时,紫外和H2O2氧化损伤酵母细胞的存活率分别为75.48%、48.38%。因此,不同来源红缘拟层孔菌粗多糖的抗氧化活性存在差异,这为红缘拟层孔菌的开发利用提供理论依据。     

高产酯化酶红曲菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

该研究从研究室保藏的10株红曲霉菌株中筛选高产酯化酶菌株,通过分子生物学技术对其进行鉴定,并对其最适培养基进 行选择,最后对其所产的酯化酶酶学特性进行初步研究。结果表明,筛选获得一株高产酯化酶菌株X1,并被鉴定为血红红曲霉（Monascus sanguineus）。 其最适产酶培养基为可溶性淀粉70g/L,大豆蛋白胨20g/L,NaNO3 2 g/L,KH2PO4 1 g/L,MgSO4·7H2O 2g/L, 初始pH值4.5。采用最优培养基,在30℃、180 r/min条件下发酵4d,酯化酶活力为315.19 U/mL。 该酯化酶的最适反应温度为40℃,在 25～35℃范围内稳定性较好;最适pH值为5.0,在pH为6.0时稳定性较高;金属离子Ca2+可提高该酯化酶活性,Mg2+、Fe2+、Na+和Ag+则有 不同程度抑制作用,且Ag+抑制作用最明显。     

枸杞果酒低温发酵工艺优化及挥发性风味物质分析

以枸杞汁为原料,感官评价为考察指标,利用单因素试验与正交试验优化枸杞果酒的发酵工艺,同时利用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术分析枸杞果酒中挥发性风味物质种类及相对含量。结果表明,枸杞果酒最佳发酵工艺为初始pH值6.0,初始糖度16%,接种量0.7%,18 ℃条件下静置发酵8 d。在此优化条件下,枸杞果酒的感官评分为96分,酒精度为6.28%vol,残糖量为8.33 g/L;通过分析其挥发性风味物质发现,枸杞果酒中共检测出40种化合物,相对含量较高的为醇类和酯类,共占总挥发性成分的71.09%,发酵过程对酒体产生了影响,醇类和酯类对枸杞果酒的香味起着积极的作用。     

不同包装方式对鲜切秦冠苹果贮藏品质的影响

以市售秦冠苹果为试材,结合柠檬酸保鲜剂处理,研究4 ℃贮藏条件下,普通包装、真空包装、高氧包装及充氮包装对鲜切秦冠苹贮藏品质变化规律的影响,确定最佳包装方式。结果表明:在综合鲜切苹果贮藏期各项指标的前提下,真空包装对鲜切苹果保鲜效果最佳,使鲜切苹果外观品质得以保持,延缓鲜切苹果的褐变进程和可溶性固形物含量降低速率,同时抑制了鲜切苹果贮藏期间多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)和过氧化物酶(peroxidase,POD)活性,减缓丙二醛(malondiadehyde,MDA)含量的升高。     

量子点传感体系在有机磷农药残留检测中的应用

食品中有机磷农药残留进入人体,会危害中枢神经系统从而出现急性中毒症状或者慢性累积效应。因此,对有机磷农药残留的检测显得迫在眉睫。对量子点在有机磷农药残留检测的国内外研究进展进行综述,重点介绍基于量子点的荧光传感体系的构建及在有机磷农药残留检测中的应用,同时对量子点与分子印迹、电化学、适配体、酶联用技术及碳量子点的应用进行了总结,以期为农药残留快速检测提供一种新思路。     

马乳酒样乳杆菌（XL10）的分离、鉴定及对小鼠肠道菌群的影响

以西藏开菲尔粒为原料,从中筛选出一株马乳酒样乳杆菌XL10,对其进行鉴定及生长特性研究;并以小鼠为研究对象,观察XL10对小鼠肠道菌群的影响。结果表明XL10菌株能够促进小鼠肠道有益菌生长,抑制有害菌繁殖。结果表明XL10菌株具有能够调节肠道菌群平衡,保护肠道健康的潜能。