小鼠PKD1基因的克隆及打靶载体的构建

目的：克隆小鼠的多囊肾病１（ＰＫＤ１）基因,构建ＰＫＤ１基因的Ｋｎｏｃｋｏｕｔ载体,为产生ＰＫＤ１基因缺陷小鼠品系准备条件。方法;以正常小鼠基因组ＤＮＡ为模板,扩增小鼠ＰＫＤ１基因部分序列为探针,应用噬斑原位杂交技术筛选１２９ＳｖＴｅｒ小鼠基因组ＤＮＡ库,并应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,亚克隆及测序等方法鉴定所得克隆。对克隆到的ＰＫＤ１基因组ＤＮＡ片段进行结构分析,选择合适的亚克隆片段,以ｐＴＫ－Ｎ     

小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体的构建

目的 构建小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体,为建立TDO2基因条件性敲除小鼠奠定基础。方法 根据CRISPR/Cas9技术原理,设计并构建单链向导RNA(sgRNA)和Donor载体,以TDO2-201(ENSMUST00000029645.13)转录本的外显子3作为敲除区,在打靶基因两侧各放置一个Loxp元件,建立条件性敲除TDO2第3号外显子的条件性基因打靶载体。将CRISPR/Cas9复合体和Donor载体显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵中,获得阳性F0小鼠,再将阳性F0代小鼠与C57BL/6小鼠交配获得F1代小鼠,并经PCR和基因测序鉴定F1代小鼠基因型。结果 结果证实所构建的TDO2基因条件性敲除打靶载体符合设计要求,成功繁育并鉴定出B6/JGpt-TDO2^em1Cflox/Gpt小鼠。结论 成功构建了小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体,为后续进一步构建TDO2基因条件敲除小鼠奠定了基础。     

基于Cre重组酶体系的小鼠HPRT定点整合打靶载体的构建及其应用

目的：构建带有Cre重组酶识别位点变异体lox66的针对小鼠HPRT基因的基因打靶载体,并用于小鼠胚胎干细胞基因打靶研究。方法：利用含HPRT基因组DNA片段的质粒pMP8和人工合成含lox66序列的寡核苷酸,构建含Cre重组酶识别位点变异体lox66的置换型打靶载体,经过限制性内切酶酶切鉴定其结构正确后,用电穿孔法对小鼠胚胎干细胞R1株进行基因转染,经G418／6－TG（6－thioguanine)分组药物筛选,进行pSP-HPRT-lox66-Neo载体的应用研究。结果：得到了与设计一臻的置换型打靶载体pSP-HPRT-lox66-Neo;将线性化的打靶载体导入ES细胞后,能与靶位点有效地发生同源重组,获得了20个靶基因被灭活了的ES细胞克隆。结论：此研究成功构建了含Cre重组酶识别位点变异位lox66针对小鼠HPRT基因位点的置换型打靶载体,在胚胎干细胞基因打勒中得到有效的应用。     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的：克隆小鼠血管抑素(Angiostatin)cDNA，构建其真核表达载体pCMV-Angiostatin重组质粒，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法：根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列，用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Angiostatin cDNA，连接pMD18T载体测序，经测序证实后，通过中间栽体pKS，构建pCMV-Angiostatin重组质粒。结果：测序表明扩增的Angiostatin cDNA序列与报道基本一致，Angiostatin cDNA正确插入表达载体。结论：成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建。     

人鼠共打靶 ERβ特异性基因沉默载体的构建和鉴定

目的：：构建人和鼠共打靶特异性 ERβ基因沉默慢病毒载体。方法：检索人和小鼠 ERβ基因转录本及其序列,应用 SiRNA Target Finder 软件设计人和小鼠共打靶 ERβ基因沉默 siRNA 和阴性对照siRNA,合成发夹状双链 shRNA,与线性化质粒 PLL3.7连接构建为重组质粒(ERβ-shRNA-PLL3.7和阴性对照质粒 ER-N-shRNA-PLL3.7),经鉴定后,转染人成骨肉瘤细胞 MG63和小鼠成骨细胞株MC3T3-E1,经 Realtime-PCR 和 western blot 法检测重组质粒对目的基因沉默效果。应用 SPSS16.0软件统计分析,检验水准为α=0.05。结果：经测序证明重组质粒中含有目的 shRNA 序列。分别转染小鼠成骨细胞株 MC3T3-E1和人成骨肉瘤细胞 MG63细胞后,无论 Realtime-PCR 检测 ERβ基因表达,还是western blot 法检测蛋白表达,均较空白对照组或阴性对照组显著降低,差异有显著性,P <0.05。结论：成功构建了人和小鼠共同高效打靶的 ERβ基因沉默慢病毒载体质粒,并包装成假病毒颗粒,为利用小鼠作为动物模型研究人基因功能或开发基因药物奠定了基础。     

含有CD基因的腺病毒载体的构建

目的 :构建携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体。方法 :先将真核表达载体质粒 pCI中的转录框架构建入腺病毒载体中 ,后再将CD和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点内。结果 :经过酶切鉴定成功地构建了分别携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体 ,对肿瘤的前药转换基因治疗有重要意义。     

rsistin基因的克隆及载体的构建

目的:克隆小鼠resistin基因及其连载体的构建,为进一步研究resistin的功能打下基础。方法:根据报道的小鼠resistin基因的全长mRNA序列为目的基因,即提取小鼠脂肪组织中的RNA,以RNA为模板,在逆转录酶的作用下,逆转录(RT)合成resistinDNA,再在TaqDNA聚合酶的作用下聚合酶链反应(PCR)扩增resistin cDNA,将扩增PCR产物(resistin cDNA)经纯化后与A-T连接于pGEM-T载体,重组质粒转化JM109感受态菌,蓝白斑筛选阳性菌落,摇菌、提取质粒。结果:提取的总RNA纯度A260/280为1.9,电泳条带28s∶18s比例约为2∶1,RT-PCR与欲扩增的目的片段的理论长度363bp相符,重组质粒插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。结论:成功克隆了小鼠resistin cDNA基因,为构建resistin基因打下基础。     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

HGFK1基因真核表达载体的构建及鉴定研究

目的构建携带人HGFK1基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-HGFK1。方法通过PCR方法从已经构建好的病毒穿梭载体中扩增出HGFK1基因,构建pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,经PCR、酶切、测序、蛋白表达等方法进行鉴定。结果PCR、酶切、测序以及蛋白表达证实pcDNA3.1（-）-HGFK1载体序列正确。结论本研究成功构建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,可为后续进行肝癌细胞的生物学研究提供帮助。     

多肿瘤抑制基因第二外显子表达载体的构建

建立人多肿瘤抑制基因第二外显子ｃＤＮＡ的表达克隆。方法 用反转录－ＰＣＲ取得ＭＴＳ１第二外显ｃＤＮＡ，并将春直接联接入质粒ｐＧＥＭ－Ｔ中，构建为重组质粒ｐＧＥＭ－ｐ１６。结果 重组质粒的酶谱分析表明其酶切位点与原设计相符，插入ｃＤＮＡ－ＰＣＲ片段大小为３０７ｂｐ，与引物区间大小一致。     

靶向核仁素RNA干扰载体的构建与筛选

目的:设计靶向大鼠核仁素的RNAi序列,构建6个RNAi真核表达载体,采用转染工具细胞筛选有效靶点.方法:根据GenBank中的核仁素序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至pGCsilencerTMU6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,将重组质粒用脂质体转染技术导入H9C2细胞,荧光显微镜检测GFP表达以判断转染效率,Western-blot检测靶细胞中核仁素蛋白水平的表达,筛选有效干扰序列.结果:经测序鉴定,克隆的RNAi打靶序列完全正确,无碱基突变.转染H9C2细胞36 h后,荧光显微镜下可检测到GFP标记的核仁素蛋白的表达,转染效率达75%以上.Western-blot结果显示3号核仁素干扰质粒(Ncl-3)能明显下调H9C2细胞的核仁素表达.结论:成功构建靶向核仁素RNA干扰载体,并筛选出效能最优序列,为进一步相关研究奠定基础.     

基因打靶技术及其研究进展

简要阐述了基因打靶的概念和基本环节，系统介绍了筛选方法和基因打靶的策略，基因打靶在基因功能研究，家畜遗传改良，人类疾病动物模型的建立和基因治疗等方面有着广阔的应用前景。     

小鼠β2m基因打靶载体的构建及序列分析

目的 采用分子生物学技术，构建小鼠β2m基因打靶载体，为进一步进行胚胎干细胞基因敲除、建立β2m基因缺陷型干细胞奠定基础。方法 通过设计和合成引物，经PCR从小鼠β2m-pSV2ΔHXgpt基因组克隆分别扩增小鼠β2m的4.2kb和0.8kb片段作为同源臂，将其分别插入载体pPNT的neo基因两侧，构建小鼠β2m基因替换型打靶载体pPNT-β2m。结果 经过PCR、限制性酶酶切鉴定，以及DNA序列分析，证实此两条同源臂为包含小鼠β2m前三个外显子在内的基因片段，证明载体构建成功。结论 PCR法构建基因打靶载体是新颖、简便而可靠的方法。     

靶向端粒酶调节相关基因TRAP siRNA表达载体的构建

目的构建靶向端粒酶调节相关基因TRAP的siRNA表达载体。方法根据siRNA设计原则,设计并化学合成2段编码短发夹RNA序列、靶向端粒酶调节相关基因TRAP的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到线性化的pSilencerTM21u6neo质粒U6启动子下游重组构建RNAi质粒。结果重组质粒pSilencerTM21u6neoTRAP经过插入片段基因序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预定位子,并且序列完全一致。结论成功构建靶向TRAP基因的siRNA表达载体,为进一步研究TRAP在调控hTERT的表达、降低端粒酶活性和肿瘤的基因治疗方面的作用做了基础。     

基因打靶技术在人类疾病动物模型研究中的应用

人类疾病动物模型在医学研究中起着非常重要的作用，而自然发生的人类疾病已远远不能满足医学研究的需要。利用基因打靶技术开展人类疾病动物模型的研究具有广阔的应用前景。本文就基因打靶技术及其在人类疾病动物模型研究中的应用做一介绍。     

磁性白蛋白纳米球作为基因载体的研究

目的 制备载基因的磁性白蛋白纳米球,评估磁性白蛋白纳米球作为基因载体的可行性及体外的磁靶向性。方法 采用去溶剂化-交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球,分别运用透射电镜（TEM）、动态光散射分析（DLS）对其形态、粒径进行表征。应用绿色荧光蛋白基因系统（pGFP）,观察载基因磁性白蛋白纳米球体外释放基因速率的情况及转染细胞的情况。运用普鲁士蓝染色法观察磁性纳米球的体外磁靶向性。结果 载基因磁性纳米球在TEM检测下为球形,大小均匀,并且在载基因磁性纳米球中明显地观察到在电子密度较低的白蛋白纳米球中包裹着电子密度较高的磁性纳米粒。DLS显示载基因免疫磁性纳米球的水合粒径约为209nm。体外动态释放基因速率,计算其累积释放率显示,该材料13h释放基因为95.25%,曲线平缓;转染实验结果显示载基因磁性纳米球能够有效转染SMMC-7721细胞,且转染效率高于载基因纳米球。普鲁士蓝染色实验结果显示磁靶向组细胞内的铁颗粒明显多于非靶向组。结论 成功制备了载基因磁性白蛋白纳米球,具有缓释基因的作用,并且能高效转染人肝癌细胞SMMC-7721。磁性白蛋白纳米球基因载体具有体外靶向性,有望作为一种潜在的靶向基因载体应用到生物医学领域。     

小鼠白细胞介素-18高效真核分泌表达载体的构建及活性测定

目的克隆小鼠白细胞介素-18（mIL-18）基因，构建重组表达质粒，在结肠癌中表达重组小鼠白细胞介素-18（mIL-18），并对其生物学活性进行初步鉴定。方法利用RT-PCR方法从小鼠腹腔巨噬细胞（Mψ）扩增出成熟肽编码区cDNA（474bp），克隆到表达载体pSecTag2B（含有分泌信号肽Igc）中；然后转染成纤维细胞，培养上清用小鼠的IL-18 ELISA试剂盒检测分泌有活性的mIL-18。结果构建的pSecTag2B-mIL-18可在成纤维细胞中分泌表达，mIL-18可诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ。结论成功构建pSecTag2B—mIL-18表达载体，表达的IL-18刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ。     

宫颈癌相关新基因的筛选、克隆及鉴定

目的:筛选、克隆及鉴定宫颈癌相关基因———BLCAP。方法:利用基因芯片技术对1例原发性宫颈癌患者的癌组织及其癌旁正常组织进行分析;将在宫颈癌组织中表达显著降低的BLCAP基因克隆到pET-28(a)表达载体上,以构建原核表达重组质粒pET-28(a)-BLCAP,通过PCR、限制性内切酶酶切和DNA测序等技术鉴定阳性重组子。结果:通过基因芯片分析发现存在表达差异的原癌和抑癌基因共11条,其中表达降低最明显的是BLCAP基因。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,即BLCAP基因共264 bp,基因序列无改变,基因插入后阅读框(ORF)正确。结论:筛选出了在宫颈癌中表达显著降低的BLCAP基因并成功构建了pET-28(a)-BLCAP原核表达质粒,为表达BLCAP目的蛋白及研究该蛋白的性质奠定了基础。     

基因重组构建MDR基因表达载体及其表达研究

利用基因重组技术，成功地构建了ＭＤＲ Ｉ基因片断的表达载体ｐＧＥ－Ｈｍｄｒ－１，用氯化钙方法转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１，挑选２０个克隆扩增培养，经提质粒，酶切，Ａｇａｒｏｓｅ电泳检测证实：其中４个克隆含有重组质粒，选用含重组质粒载体的菌株扩增培养，经ＩＰＴＧ诱导，超声波破碎，抽提蛋白，ＧＳＨ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测证实：此重组载体已表达所需的目的蛋白（ＧＳＴ－ｍｄｒ     

针对Cox-2基因siRNA载体构建和沉默效应

目的 构建针对人Cox-2基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰对肺癌细胞Cox-2基因表达的沉默作用.方法 设计Cox-2靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSINsi-hU6载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR检测Cox-2基因mRNA表达的变化.结果 把针对Cox-2基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSINsi-hU6载体,经过酶切鉴定与测序.结果 正确;RT-PCR检测显示,Cox-2基因的表达水平明显降低.结论 成功构建出显著沉默细胞Cox-2基因表达的siRNA载体.