干细胞样肝原始细胞的分离和鉴定

目的：证实小鼠胎肝中肝干细胞的存在。方法：小鼠胎肝细胞的分离培养和免疫细胞化学等。结果：从小鼠胎肝组织中成功地分离得到了ＡＥＰ、ＣＤ３４及Ａｌｂｕｍｉｎ等特异性分子标记阳性、并呈集落样生长的细胞系。结论：小鼠胎肝中存在具有干细胞性的原始细胞,为肝干细胞生物学特性的进一步认识和利用奠定了基础。     

宫颈癌细胞系中干细胞球样细胞的筛选与鉴定研究

目的探讨从人宫颈癌细胞系Ca Ski中分离培养宫颈癌干细胞球样细胞的可行性,并观察其体外生物学特性。方法采用肿瘤干细胞无血清悬浮培养法富集Ca Ski细胞系球样细胞,通过体外传代培养、添加血清诱导分化等技术鉴定其干性,利用流式细胞技术检测细胞周期,并应用蛋白印记法及细胞免疫荧光等方法从分子水平检测相关因子的表达。结果从Ca Ski细胞系中分离到的干细胞球样细胞可以在无血清培养基中悬浮生长成细胞球,并可在体外稳定传代,具有自我更新能力和分化潜能;肿瘤干细胞球样细胞多处于G0/G1期。与其他分子标志物相比,干细胞球样细胞的CD44明显高表达;与亲本细胞相比,干细胞球样细胞的干性相关因子SOX2、OCT4、β-catenin表达较高。结论利用肿瘤干细胞无血清悬浮培养法可以从Ca Ski细胞系中分离富集到具有稳定肿瘤干细胞性质的细胞群。     

大细胞肺癌干细胞样细胞的分离及鉴定

目的：从大细胞肺癌组织中分离、鉴定肺癌干细胞样细胞,为进一步研究靶向肺癌干细胞的免疫治疗奠定基础。方法：利用无血清培养基从大细胞肺癌组织中分离、培养肿瘤细胞并建立大细胞肺癌细胞系。流式细胞仪分选表达CD44和（或）CD90的不同肺癌细胞亚群,通过单细胞克隆形成实验、平板集落形成实验、细胞球形成实验及X射线敏感实验研究不同肺癌细胞亚群的生物学特性。结果：应用原代细胞培养技术成功地从大细胞肺癌组织中培养出高纯度的原代肿瘤细胞,命名为LC006细胞,其传代次数可达30代以上。流式细胞仪分析显示, LC006细胞中有1.0%的细胞CD44呈强阳性表达（CD44++）。相比于主群的CD44弱阳性（CD44＋）细胞,CD44++ LC006细胞具有较强的平板集落形成能力,可形成holoclone克隆和细胞球;而CD44＋LC006细胞不能形成holoclone克隆和细胞球。应用CD44和CD90抗体可将LC006细胞分为4个亚群,分别是 CD44＋CD90+（12.8%）、CD44＋CD90-(86.3%)、CD44++CD90+(0.4%)和CD44++CD90-(0.5%)细胞;相比于其他细胞亚群,CD44++CD90+LC006细胞形成细胞球的能力最强,对X射线的抵抗力也最强。结论：成功分离和鉴定的CD44++CD90+LC006细胞是大细胞肺癌的肿瘤干细胞样细胞。     

小细胞肺癌干细胞样细胞的分离鉴定

背景与目的:小细胞肺癌是高度侵袭的恶性肿瘤,患者的5年生存率不足10%,提示小细胞肺癌组织中可能富含较多的肿瘤干细胞.本研究设计从小细胞肺癌组织中原代培养肿瘤细胞并建立细胞系,从早期传代的细胞系中分离鉴定肺癌干细胞.方法:用无血清培养基原代培养肺癌细胞,传代后建立细胞系.应用流式细胞分析及分选技术,从细胞系第3代或第4代的细胞中寻找肺癌干细胞.应用单细胞克隆形成实验、平板集落形成试验及细胞球形成实验,研究肺癌干细胞的生物学特性.结果:应用原代细胞培养技术成功地从1例小细胞肺癌标本中培养出高纯度的原代肺癌细胞,其传代次数可达25代以上.流式细胞学分析显示该细胞系中有5.1%的细胞CD44呈强阳性表达(CD44++),相比于占主群的CD44弱阳性细胞(CD44+),CD44++细胞具有较强的平板集落形成能力,只有它们可以形成完全克隆(holoclone),在超低黏附的96孔培养板中可形成细胞球,而CD44+细胞不能形成完全克隆和细胞球.这些结果提示小细胞肺癌干细胞富集在CD44++细胞群中,而CD44+细胞中没有干细胞.应用CD44和CD90共同标记,可将小细胞肺癌细胞系中的细胞分为4群,分别是CD44+CD90-、CD44+CD90+、CD44++CD90-和CD44++CD90+细胞,其中CD44++CD90+细胞所占比例为1.9%.相比于其他细胞群,CD44++CD90+细胞形成细胞球的能力最强,提示CD90可能也是肺癌的干细胞标记.结论:小细胞肺癌细胞系中存在肿瘤干细胞样细胞,CD44和CD90可能是小细胞肺癌的干细胞标记.     

LoVo细胞系中结肠癌干细胞样细胞的分离、培养及鉴定

摘 要　目的：从结肠癌LoVo细胞系中分离、鉴定具有CD44+/EPCAM high特异表型的结肠癌干细胞样细胞,观察其生物学行为,证实该细胞系中结肠癌干细胞样细胞的存在。方法：从普通血清培养的LoVo细胞系中以流式细胞仪分选具有CD44+/EPCAM high表型的细胞,接种于添加生长因子的无血清培养基中,观察其增殖过程,继而诱导分化。MTT法、流式细胞术检测CD44+/EPCAM high、EPCAM low和未分选LoVo细胞的增殖能力及细胞周期分布。3种细胞接种裸鼠,比较不同细胞的成瘤率;免疫荧光技术检测小鼠次代CD44+/EPCAM high细胞中 CD44/EPCAM的表达。结果：LoVo细胞中有17.4%的CD44+/EPCAM high细胞,并能在添加生长因子的无血清培养基中呈细胞球样生长,且可连续传代;在血清的诱导下,呈贴壁分化生长,其形态与未分选LoVo细胞无差别。CD44+/EPCAM high细胞增殖能力高于EPCAM low细胞及未分选LoVo细胞,且细胞周期多集中在G0/G1期。以500个CD44+/EPCAM high细胞接种裸鼠成瘤率为90%（9/10）,而1×104个EPCAM low细胞成瘤率为0（0/10)。小鼠移植瘤中次代CD44+/EPCAM high细胞仍能少量表达CD44和EPCAM。结论：LoVo细胞中存在CD44+/EPCAM high结肠癌干细胞样细胞,CD44+/EPCAM high可用于结肠癌肿瘤干细胞的深入研究。     

鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞亚群的分离及初步鉴定

  目的   分离和鉴定具有肿瘤干细胞特性的鼻咽癌球形成细胞亚群。   方法   利用无血清干细胞球悬浮培养技术从不同分化程度鼻咽癌细胞株中分离成球细胞,然后利用MTT法,软琼脂克隆形成实验,分别评价成球细胞的耐药性、克隆形成能力,最后利用RT-PCR和免疫荧光细胞技术分析干性基因及Wnt信号通路关键转录因子β-catenin在成球及未成球细胞中的表达情况。   结果   低分化鼻咽癌细胞含有较高成球细胞,而高分化细胞株CNE-1中未见成球细胞。与CNE-2相比较,CNE-2S（来源于CNE-2的成球细胞）具有较强的抗肿瘤药物耐药性、克隆形成能力、高表达干性基因,且β-catenin在胞浆和核内都呈高表达。   结论   本研究分离到干细胞样鼻咽癌成球细胞亚群,为最终靶向杀灭鼻咽癌肿瘤干细胞提供了可能。      

人肝癌组织中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定

目的：从人肝癌组织中分离培养肝癌干细胞样细胞,为进一步研究肝癌干细胞靶向治疗奠定基础。方法：采用酶消化法和以原代培养结合短暂传代培养的方法从人肝癌组织中分离出含人肝癌干细胞样细胞（human liver cancer stemlike cells, hLCSLCs) 的连续传代细胞,分别加入肝素、白蛋白、氢化可的松以筛选适用于hLCSLCs的无血清悬浮成球培养基。以流式细胞术检测hLCSLCs和由无血清悬浮成球培养所获得的成球细胞中旁群（side population, SP）细胞、CD133及CD90等的表达,裸鼠成瘤实验检测这两种细胞的致瘤能力。结果：成功地从人肝癌组织分离获得hLCSLCs,其SP、CD133+和CD90+细胞含量分别为0.9%、0.8%和12.7%,裸鼠皮下接种2 000个SP细胞的成瘤率为100%。含有肝素的无血清培养基更适于hLCSLCs的成球培养,所获成球细胞中SP、CD133+和CD90+细胞含量分别为4.6%、9.7%和48%,接种10 000个成球细胞即可全部成瘤。结论：成功建立了从人肝癌组织中分离肿瘤干细胞样细胞的方法,添加肝素的无血清悬浮成球培养法可有效富集肝癌干细胞样细胞。     

人卵巢癌组织肿瘤干细胞的分离和鉴定

目的 从人卵巢癌组织中分离并鉴定卵巢癌干细胞.方法 取新鲜卵巢癌组织,以胶原酶和透明质酸酶充分消化,获得单细胞悬液,经红细胞裂解液处理,CD133磁珠孵育进行磁性细胞分选,流式细胞仪验证分选效率.将阳性细胞置于含人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、牛血清白蛋白和人胰岛素的无血清培养基中,待细胞成球状生长后进行免疫荧光、分化实验和成瘤实验,鉴定其干细胞特性.结果 从人卵巢癌组织中成功分离出肿瘤干细胞,流式细胞仪检测其CD133的表达率为82.5％.该细胞在无血清培养基中呈悬浮球状生长,具有自我更新能力、分化潜能和更强的致瘤能力,具备干细胞特性.结论 人卵巢癌组织中存在卵巢癌干细胞,利用CD133磁珠分选得到的肿瘤干细胞具备干细胞的相关特性,可用于后续卵巢癌干细胞生物学特性的研究.     

肺腺癌细胞株SPC-A1中侧群细胞的分离与肿瘤干细胞样特征的鉴定

背景与目的近来已有充分的研究表明在实体肿瘤中存在肿瘤干细胞,肿瘤干细胞的发现改变了我们对肿瘤发生机制及化疗耐药的观点。本文拟从人肺腺癌细胞株中分离并鉴定具有干细胞特征的肿瘤干细胞样细胞。方法采用无血清培养结合流式细胞术分离人肺腺癌细胞株中的边群细胞(SP,side population),通过增殖能力、克隆形成、裸鼠成瘤及表型分析鉴定其干细胞特性。结果肺腺癌细胞株中存在SP细胞,经无血清培养后,SP细胞的比例显著提高,SP细胞具有高增殖活性、高克隆形成率及强致瘤性,具有肿瘤干细胞的特性。结论人肺腺癌细胞株中存在具有肿瘤干细胞性质的SP细胞,无血清培养可以富集肺腺癌细胞株中的SP细胞。     

肝癌Huh7干细胞样细胞的富集培养及鉴定

目的：建立一种体外有效富集、培养和鉴定具有肝癌干细胞特征的细胞亚群的方法。方法：采用成球培养法利用肿瘤干细胞样细胞（cancer stem cell, CSC）分化培养基对肝癌Huh7细胞进行富集培养,获得的干细胞样细胞于体外进一步扩增获得肝癌干细胞球。流式细胞术检测Huh7干细胞样细胞表面肿瘤干细胞标志物EpCAM、CD90和CD133的表达,平板克隆集落形成实验和裸鼠成瘤实验分别检测Huh7细胞和Huh7干细胞样细胞的克隆集落形成能力、体内成瘤能力。结果：Huh7细胞成球培养3~7 d后即可形成肝癌干细胞样细胞球,获得的干细胞样细胞具有自我更新和增殖能力,其EpCAM阳性细胞比例较Huh7细胞明显增加\[（99.6%±0.31）% vs（0.12%±0.05）%,P<0.01\],但两种细胞CD90\[(0.11%±0.06)% vs (0.09%±0.07)%, P>0.05\]和CD133\[(0.17%±0.08)% vs (0.15%±0.05)%, P>0.05]表达差异无统计学意义。Huh7干细胞样细胞克隆集落形成数量明显多于Huh7细胞\[（188.67±12.5）vs （79±16.7）个,P<0.01\];当接种量为5×104个细胞时,与接种Huh7细胞的对照裸鼠相比,接种Huh7干细胞样细胞的裸鼠成瘤时间更短（11 vs 30 d）,成瘤率更高（100% vs 16.67%）;接种5×105数量级的细胞时,实验组成瘤体积\[（171.90±10.94）vs（86.39±11.21）mm3, P<0.01\]和瘤体质量\[（2.98±0.82）vs（0.32±0.17）g, P<0.01\]均明显大于对照组。结论：利用成球培养法能够从Huh7肝癌细胞系中富集培养获得Huh7肝癌干细胞,其具有比Huh7细胞更强的成瘤能力。     

肝原发性肿瘤及占位性病变CT延迟增强扫描的意义

本文通过前瞻性研究,对42例原发性肝肿瘤及肝病变患者进行了肝CT平扫、常规增强及肝延迟增强扫描(简称DICT)。其中肝癌32例,共有癌瘤、癌灶58个;肝血管瘤6例,共有血管瘤7个;局灶性结节状增生(简称FNH)1例;另有孤立性肝硬变大结节3个。全部病例均经手术、病理证实。结果表明:1、肝DICT对于5.0cm以下的小肿瘤检出灵敏度高于平扫和常规增强CT扫描。本组病例,DICT灵敏度为79.1％,平扫和常规增强CT扫描联合使用灵敏度为48.8％,差异有显著性(P<0.01)。2、DICT假阳性率低于平扫和常规增强,DICT为5.0％,平扫为25％,常规增强为9.1％,DICT与CT平扫假阳性率差异有显著性(P<0.05)但DICT与常规增强无显著性差异(P>0.05)。3、DICT对具有肝组织功能的病变如FNH、肝硬变结节有一定的鉴别诊断价值。     

自体外周血造血干细胞的采集和衡量

自体外周血造血干细胞（ＰＢＳＣ）移植后血液系统的重建与采集和保存的ＰＢＳＣ的质量和数量有密切关系。在１５名病人的７６次ＰＢＳＣ的采集和保存中，发现ＰＢＳＣ的质量和数量有明显的个体差异，与疾病的类型和化疗方案有密切关系。ＮＨＬ中ＣＤ＋３４细胞与ＣＦＵ－ＧＭ的比例平均为２５％，ＣＭＬ为６７％，ＭＭ最低为１３９％，这可能是因为ＭＭ病人的血清中存在白细胞分化的抑制因子。ＣＭＬ病人中ＣＤ＋３４／ＣＤ－３３细胞在总的ＣＤ＋３４细胞中的比例很低，提示此类病人的早期造血干细胞很少。ＮＩＣＯＯＬ程控降温仪与－８０℃冰箱在细胞的冷冻保存中没有明显的差异。认为单一项目的检测不能全面评价ＢＰＳＣ的质量和数量，应该同时进行单个核细胞计数、ＣＦＵ－ＧＭ数和ＣＤ＋３４细胞数的评估。     

骨髓移植后肝功能损害的病因分析及治疗探讨

目的探讨骨髓移植（ＢＭＴ）患者肝功能损害的病因及其防治措施。方法对３６例ＢＭＴ患者分别动态检测其肝功能及肝炎病毒、ＣＭＶ病毒,肝功能损害后治疗包括停止或减量应用有关药物,常规预防性保肝治疗,加用赛诺金、环胞菌素Ａ（ＣｓＡ）、甘昔洛韦（ＤＨＰＧ）、磷钾酸钠。结果１５例异基因ＢＭＴ（Ａｌｏ－ＢＭＴ）患者肝功能１３例有异常,２１例自体ＢＭＴ（Ａｕｔｏ－ＢＭＴ）患者１３例肝功能异常（Ｐ＜０．０５）,发生移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）者肝功能损害发生率高（Ｐ＜０．０５）,ＣＭＶ感染者肝功异常率高（Ｐ＜０．００１）,肝炎病毒感染者肝损发生率高（Ｐ＜０．００１）。结论ＢＭＴ患者肝功能损害与ＢＭＴ类型、ＧＶＨＤ的发生及程度及病毒感染呈显著相关。     

肝细胞肝癌p21WAF1与p53的表达及其意义

目的探讨HCC中p21     

穿梭质粒pSP189快速提取和转染的方法

本文采用基于ＳＶ４０病毒的新型穿梭质粒ｐＳＰ１８９，作为ＰＺ１８９的衍生质粒其独特性在于ｐＳＰ１８９是一个质粒群每个质粒在其靶基因ｓｕｐＦＴＲＮＡ的３’端都所插入一段随机产生的８－ｂｐ的标识序列，通过对突变子靶基因ＳｕｐＦ和标识序列同时测序可以临别出一个转染细胞瓶中两个靶基因序列改变相同的突变子是独立突变还是同胞突变。胞中回收纯化的方法，结果表明，用我们的一步法从细菌中提质粒和改良的Ｈｉｒｔ法从细     

原发性肝癌肝切除术肝动脉与门静脉灌注化疗的比较

目的评价原发性肝癌根治性切除术后肝动脉灌注化疗与门静脉灌注化疗的疗效，探讨原发性肝癌根治性切除术后复发及转移的预防途径。方法经病理确诊的原发性肝癌７５例，其中４２例行根治性切除及术后选择性肝动脉插管化疗，３３例行根治性切除及术后门静脉灌注化疗。每隔１～３个月重复，定期复查。结果原发性肝癌切除术后肝动脉灌注化疗组的术后复发率（２１．４３％）低于门静脉灌注化疗组（３６．３６％），且生存时间（１１．４个月）明显较门静脉灌注化疗组（７．６个月）长，而门静脉灌注化疗组的转移率（９．０９％）明显低于肝动脉灌注化疗组（３２．１４％）。结论原发性肝癌根治性切除术后行肝动脉灌注化疗较门静脉灌注化疗疗效好，而原发性肝癌切除术后同时结合肝动脉、门静脉灌注化疗对术后预防肿瘤的复发与转移可能更为理想     

成年急性白血病化疗前后合并肝功异常的临床分析

本文分析了55例急性白血病合并肝功异常病人化疗后肝功变化及疾病转归情况,认为尽管肝功异常的原因、发生时间及程度不同,化疗并不会影响疾病的总体预后。提示临床医生不必对白血病合并肝功异常病人的化疗产生过多疑虑。     

重组人肿瘤坏死因子及其与阿霉素联合抗人肝癌的实验研究

本研究采用体外细胞毒方法（ＭＴＴ）检测了重组人肿瘤坏死因子（ｒＨＴＮＦ）和）（或）阿霉素（ＡＤＭ）对肝癌细胞株Ｓ ＭＭＣ－７７２１及Ｂ ＭＭＣ７７２１及Ｂｅｌ－７４０２的细胞毒效应。结果表明：ｒＨＴＮＦ＇ＡＤＭ对两肝癌细胞株的毒性有明显差异，ｒＨＴＮＦ与ＡＤＭ联合应用的体外细胞毒试验显示良好的协同增强效应，在此基础上，选用ＳＭＭＣ－７７２１细胞株进行棵鼠移植瘤试验，观察ｒＨＴＮＦ与ＡＤＭ联合应用的