陆川猪IGFBP5基因克隆及其差异表达分析

[目的]克隆陆川猪胰岛素生长因子结合蛋白5(IGFBP5)基因,并明确其在不同猪种中的表达情况,为今后揭示IGFBP5基因在陆川猪肌肉发育中的作用机理提供理论依据.[方法]通过TRIzol法提取陆川猪背最长肌总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR扩增,将正确的测序结果采用在线生物信息软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测分析IGFBP5基因在陆川猪和杜洛克猪背最长肌中的表达差异.[结果]陆川猪IGFBP5基因编码区(CDS)序列全长816 bp,编码271个氨基酸,与NCBI上已公布的野猪IGFBP5基因(NM_214099.1)CDS序列相比,存在3处碱基差异,其核苷酸同源性为99.6%.陆川猪IGFBP5氨基酸序列与NCBI上已公布的野猪(NM_214099.1)、牛(NM_001105327.2)、水牛(NM_001290940.1)、马(NM_001308603.2)、人类(NM_000599.3)、猕猴(NM_001284032.1)、小鼠(NM_010518.2)和大鼠(NM_012817.1)IGFBP5氨基酸序列同源性分别为98.9%、98.2%、98.9%、97.4%、96.7%、97.4%、95.2%和95.2%;基于IGFBP5氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树也显示,陆川猪与野猪的遗传距离最近.陆川猪IGFBP5蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,其中无规则卷曲占比最高,为65.68%;陆川猪IGFBP5蛋白不存在跨膜结构,在第1~20位氨基酸残基存在1个信号肽序列;蛋白修饰结构预测结果表明,陆川猪IGFBP5蛋白存在2个O糖基化位点、2个N糖基化位点和多个潜在磷酸化位点,包含IB保守结构域和Thyro-globulin-1保守结构域.IGFBP5基因在杜洛克猪背最长肌中的相对表达量极显著高于其在陆川猪背最长肌中的相对表达量(P<0.01).[结论]IGFBP5基因保守性较强,其在不同猪种间的差异表达可能是导致猪肉瘦肉率差异的主要原因,可作为陆川猪胴体重和瘦肉率等生长性状的遗传标记予以开发利用.     

宗地花猪心脏型脂肪酸结合蛋白基因的表达

为有效提高宗地花猪的肉品质,合理评价养殖模式提供理论依据,参照GenBank中猪H-FABP基因序列设计引物,以猪18SRNA为内参基因,应用实时荧光定量PCR方法检测H-FABP基因在不同饲养条件下宗地花猪不同组织器官中的表达量。结果表明:H-FABP基因在肺脏、心脏、肾脏、小肠、脾脏、肝脏、背最长肌、腰大肌中均有表达,但不同饲养条件下其表达水平各异,放养型背最长肌腰大肌肾脏心脏小肠肺脏脾脏肝脏,背最长肌中表达量显著高于其他组织(P0.05);圈养型腰大肌脾脏心脏肺脏小肠肝脏背最长肌肾脏,腰大肌中表达量显著高于其他组织(P0.05),肝脏中表达量高于背最长肌(P0.05)。两种饲养条件下宗地花猪肺脏、肝脏中表达量相当,而在心脏、肾脏、小肠、脾脏、背最长肌中表达差异较大。     

陆川猪CSRP3基因克隆及其组织表达差异分析

【目的】克隆陆川猪的富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白3(CSRP3)基因,并对其进行生物信息学和组织表达谱分析,为研究CSRP3基因在陆川猪肌肉生长过程中的作用机制打下基础。【方法】根据NCBI已公布的野猪CSRP3基因序列设计特异性定量引物和克隆引物,运用RT-PCR克隆CSRP3基因并进行生物信息学在线分析,采用实时荧光定量PCR检测CSRP3基因在陆川猪各组织中的表达差异。【结果】陆川猪CSRP3基因编码区(CDS)全长854 bp,编码194个氨基酸残基,与NCBI已公布的野猪CSRP3基因CDS序列相比存在5处同义碱基突变,且陆川猪与野猪氨基酸序列相似性达100.0%;陆川猪CSRP3基因的编码蛋白分子量为20935.82 Da,分子式为C₉₆₄H₁₄₀₄N₂₆₂O₂₇₄S₁₉,理论等电点(pI)为8.89,不稳定系数为39.11,表明其是偏碱性的稳定蛋白;CSRP3蛋白二级结构主要由无规则卷曲构成,三级结构可能有一种模型;陆川猪CSRP3蛋白除有多个磷酸化位点之外,无跨膜结构和信号肽;陆川猪CSRP3基因在心脏中表达量最高,背最长肌次之,在肝脏中的表达量最低。【结论】CSRP3基因在陆川猪心脏中表达量最高,背最长肌次之且明显高于其他组织,说明该基因可能对肌肉生长有一定影响。     

陆川猪MYL9基因克隆及其表达差异分析

[目的]克隆陆川猪肌球蛋白调节轻链9基因(MYL9),并进行生物信息学分析及检测其在不同猪种中的表达差异,为明确陆川猪骨骼肌生长规律及研究MYL9的生理功能打下基础.[方法]根据NCBI上的家猪MYL9基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR克隆陆川猪MYL9基因,利用在线软件对其进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测陆川猪和杜洛克猪背最长肌中MYL9基因的表达情况.[结果]陆川猪MYL9基因编码区(CDS)序列长519 bp,共编码172个氨基酸;与NCBI上已公布的家猪MYL9基因(NM_001244472.1)CDS序列比对,陆川猪MYL9基因存在2处碱基突变,分别是195 bp处C→A和498 bp处T→C,均为同义突变;陆川猪MYL9基因推导氨基酸序列与家猪MYL9基因推导氨基酸序列的同源性最高,为99.6%,与鸡的同源性最低,为88.4%.陆川猪MYL9蛋白存在3个N糖基化位点和15个磷酸化位点,不存在跨膜结构域和信号肽,符合一般EFh-PEF超家族的结构特征.陆川猪MYL9蛋白二级结构中α-螺旋占54.65%,无规则卷曲占35.47%,β-转角占8.14%,延伸链占1.74%.MYL9基因在杜洛克猪背最长肌中的相对表达量极显著高于陆川猪背最长肌(P<0.01).[结论]MYL9基因序列在不同物种中具有较高的保守性,其在10周龄陆川猪背最长肌中的相对表达量极显著低于杜洛克猪,与其在不同猪种背最长肌中的磷酸化程度有关,也说明MYL9基因对猪肌肉生长速度有一定影响.     

贵州地方山羊Leptin基因表达的组织分布规律及品种差异

[目的]揭示贵州地方山羊瘦素基因(Leptin)表达水平的组织分布规律及品种差异,为研究Leptin基因与山羊肉质的关系提供参考依据.[方法]以黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊4个贵州地方山羊为研究对象,南江黄羊为对照,采用TaqMan实时荧光定量PCR对其肝脏、肾脏、心脏、肺脏、背最长肌、半膜肌和皮下脂肪中的Leptin基因表达水平进行测定.[结果]Lptin基因在不同山羊品种的肝脏、肾脏、心脏、肺脏、背最长肌、半膜肌和皮下脂肪中呈高表达,均以皮下脂肪的Leptin基因表达水平最高,且在黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊4个贵州地方山羊品种中,皮下脂肪中的表达水平显著高于心脏、肺脏、背最长肌和半膜肌(P＜0.05).除肝脏内Leptin基因表达水平在各品种间无显著差异(P＞0.05)外,在肾脏、心脏、肺脏、背最长肌、半膜肌、皮下脂肪中的表达水平均存在品种差异,且以贵州白山羊最高.[结论]贵州地方山羊品种Leptin基因表达的组织分布规律相似,均以皮下脂肪最高,在品种方面则以贵州白山羊的整体表达水平较高.     

松辽黑猪×野猪杂交猪H-FABP mRNA基因的组织分布研究

1材料与方法 1．1材料松辽黑猪X野猪杂交猪（含野猪血缘50％）组织样品采自吉林省农业科学院畜牧分院,采集的皮下脂肪、腹脂、乳腺、背最长肌、臂三头肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、回肠、十二指肠共计12种组织样品迅速置于液氮中,实验室-80℃保存。     

陆川猪和杜长大猪Nrf2基因克隆及其在背最长肌中的表达分析

【目的】明确核因子NF-E2相关因子(Nrf2)基因生物学特性,并探究其在陆川猪和杜长大猪背最长肌中的表达差异,为深入研究陆川猪优质肌肉抗氧化性能的分子机制打下基础。【方法】以150日龄的陆川猪和杜长大猪背最长肌组织总RNA为模板,分段克隆Nrf2基因编码区(CDS)序列,并通过ExPASy ProtScale、ExPASy ProtParam及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,同时应用实时荧光定量PCR和Western blotting检测Nrf2基因在150日龄陆川猪和杜长大猪背最长肌中的表达差异。【结果】陆川猪和杜长大猪Nrf2基因CDS序列长1686 bp,与GenBank中已公布的野猪、杜长大猪、牛、绵羊、黑猩猩、猕猴、狼、人类、家鼠、大白鼠、鸵鸟和普通家鸡的Nrf2基因CDS序列的同源相似性分别为99.7%、99.5%、91.2%、90.6%、90.5%、90.1%、89.5%、86.5%、81.9%、81.7%、72.0%和70.6%。陆川猪与杜长大猪的遗传距离最近,与狼的遗传距离最远。陆川猪和杜长大猪的Nrf2蛋白都由561个氨基酸组成,且以丝氨酸含量最高,占比12.5%,色氨酸含量最低,仅占0.4%,均具有较强的亲水性。在Nrf2蛋白二级结构中,杜长大猪Nrf2蛋白的无规则卷曲占57.75%,α-螺旋占34.05%,延伸链占5.35%,β-转角占2.85%;陆川猪Nrf2蛋白的无规则卷曲占57.93%,α-螺旋占33.51%,延伸链占6.06%,β-转角占2.50%。150日龄陆川猪背最长肌中Nrf2基因相对表达量显著高于同日龄杜长大猪背最长肌中Nrf2基因的相对表达量(P<0.05);且陆川猪Nrf2蛋白表达量极显著高于同日龄杜长大猪背最长肌中Nrf2蛋白表达量(P<0.01)。【结论】成功克隆陆川猪和杜长大猪Nrf2基因CDS序列,陆川猪背最长肌中Nrf2基因表达量显著高于同日龄杜长大猪,推测陆川猪肌肉具有比杜长大猪更加优良的抗氧化性能。     

陕西紫阳县山羊Fas和Bcl-2基因表达研究

为了研究陕西省紫阳县(富硒地区)山羊各组织中Fas和Bcl-2基因表达的情况,探讨微量元素硒对Fas和Bcl-2基因表达的影响。将年龄相仿、体质量相近,分别来自紫阳县双安镇(高硒区,n=7)和高滩镇(低硒区,n=7)的山羊作为研究对象,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾周脂肪、背最长肌、股二头肌和淋巴组织中Fas和Bcl-2基因mRNA的表达量。结果表明:双安镇山羊各组织Fas基因mRNA表达量由高到低依次为肝脏心脏肺脏肾脏肾周脂肪脾脏股二头肌淋巴背最长肌;高滩镇心脏和肝脏中mRNA的表达量最高,显著高于肾周脂肪、肾脏、背最长肌、股二头肌、肺脏、淋巴、脾脏(P0.05),肝脏、肺脏(P0.01)和肾脏(P0.05)中的表达量均显著低于双安镇。双安镇山羊肺脏中Bcl-2基因mRNA表达量最高,与脾脏和肾周脂肪组织差异不显著(P0.05),但是显著高于其他组织(P0.05);而高滩镇山羊Bcl-2基因mRNA表达量由高到低依次为肾周脂肪肺脏心脏脾脏肾脏淋巴股二头肌肝脏背最长肌,且心脏、脾脏、肾周脂肪(P0.01)和肺脏(P0.05)均高于双安镇山羊。由此可见,Fas和Bcl-2基因mRNA在紫阳县山羊各组织中均有不同程度表达,且微量元素硒上调了山羊组织中Fas基因的表达,抑制Bcl-2基因,但是硒对Fas和Bcl-2基因表达的影响存在组织差异性。     

富硒地区山羊组织中的硒沉积量及其对PHGPx表达的影响

【目的】检测富硒地区山羊部分组织中的硒沉积量,分析组织硒沉积量对磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase,PHGPx)基因表达的影响。【方法】将年龄相仿、体质量相近,分别来自富硒地区陕西紫阳县双安镇(试验Ⅰ组)、高滩镇(试验Ⅱ组)的山羊作为研究对象,以硒水平正常的宝鸡市陈仓区的山羊作为对照,采集各组山羊血液,分离血清,然后采用切断颈动脉放血法屠宰,随后立即采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、股二头肌以及羊毛组织样,利用氢化物发生-原子荧光光谱法测定样品中的硒含量;运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、股二头肌组织中PHGPx基因mRNA的表达量,分析硒沉积量对PHGPx基因mRNA表达的影响。【结果】Ⅰ组山羊,除肾脏中的硒含量显著高于对照组(P0.05)外,其他组织均极显著高于对照组(P0.01);Ⅱ组山羊,心脏、肝脏、脾脏、羊毛和血清中硒含量极显著高于对照组(P0.01),背最长肌和股二头肌中的硒含量显著高于对照组(P0.05),肺脏、肾脏与对照组差异不显著(P0.05)。PHGPx基因mRNA在Ⅰ组山羊各组织中的表达量由高到低依次为肺脏股二头肌脾脏肾脏心脏背最长肌肝脏;在Ⅱ组为肺脏股二头肌脾脏肝脏肾脏心脏背最长肌。与对照组相比,Ⅰ组山羊心脏中PHGPx基因mRNA的表达量显著升高(P0.05),肺脏极显著升高(P0.01);试验Ⅱ组山羊肝脏中PHGPx基因mRNA的表达量显著高于试验Ⅰ组和对照组(P0.05)。试验Ⅰ组、Ⅱ组、对照组山羊脾脏、肾脏、背最长肌和股二头肌中PHGPx基因mRNA的表达量差异不明显。【结论】富硒地区山羊各组织中硒沉积量和PHGPx基因mRNA表达水平总体上高于宝鸡市陈仓地区山羊,而且山羊心脏、肝脏、肺脏中PHGPx基因mRNA的表达量受到其硒元素沉积量的影响,这表明硒在转录水平上可调控PHGPx基因的表达,但是具有组织差异性。     

陆川猪ACOX1基因不同亚型克隆及其表达差异分析

【目的】克隆陆川猪脂酰辅酶A氧化酶1(Acyl-CoA oxidase 1,ACOX1)基因不同亚型,进行生物信息学分析,并分析ACOX1基因及其亚型在不同品种猪背最长肌中的表达情况,为研究ACOX1基因在陆川猪机体内的功能作用提供参考依据。【方法】根据GenBank中ACOX1基因序列（NM＿001101028.1）及所克隆获得陆川猪ACOX1基因编码区（CDS）序列,设计特异性扩增和验证引物,采用TRIzol法提取0月龄陆川猪肝脏及8月龄陆川猪、杜洛克猪、杜陆猪和陆杜猪背最长肌的总RNA,反转录合成cDNA,以0月龄陆川猪肝脏cDNA为模板进行克隆和验证,获得陆川猪ACOX1基因不同亚型序列,并利用在线工具进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测ACOX1基因不同亚型在背最长肌组织中的表达情况。【结果】陆川猪ACOX1基因存在2种亚型结构（ACOX1-Ⅰ和ACOX1-Ⅱ）,NCBI登录号分别为OQ701687和OQ701688;2种亚型CDS长度均为1986 bp,共编码661个氨基酸残基,2种异构体主要是第270～429位氨基酸进行选择性剪切,陆川猪ACOX1-Ⅰ型编码蛋白...