曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)繁殖期行为谱特征的研究

自然海域中曼氏无针乌贼产卵亲体性成熟提前和小型化现象明显，这可能是一种适应性进化，人工干预背景下曼氏无针乌贼繁殖期行为的动态变化值得关注。2020年4-6月室内采用聚焦个体扫描法和定点连续记录法分别观察和记录了曼氏无针乌贼繁殖期的行为活动，并按其生活习性和行为的生物学功能等进行系统化分类，构建了繁殖期行为谱。结果表明，曼氏无针乌贼繁殖期行为谱主要包括三大类12种行为：（1）游泳行为主要分为前进和后退，繁殖期的雌性多处于静潜水底或静浮水中的状态；（2）捕食行为主要分为发现、定位、捕捉和咀嚼等系列动作，曼氏无针乌贼能够快速感知周围17.0-36.0 cm范围内的饵料，捕捉的有效距离为8.0-22.0 cm，能在2.0-10.0 s内完成对饵料的高效捕获；（3）繁殖行为复杂，主要分为求偶、伴游、交配、产卵等，其中求偶行为体现在雄性对雌性的自我展示、追逐配对和争斗护卫等过程，雄性在争斗护卫和伴游过程中的护雌行为尤为激烈。曼氏无针乌贼交配时采用"头对头"的方式，平均交配持续时间42.9 s。曼氏无针乌贼对产卵附着基有选择性且偏好于最初的附卵物，卵群对雌性产卵行为有诱导和刺激作用，每次产卵到附卵过程平均用时108.6 s。曼氏无针乌贼繁殖期行为谱特征的研究可为后续曼氏无针乌贼行为机制和基于全生活史的资源保护等方面提供理论依据。     

养殖对曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)群体遗传多样性的影响

采用24条随机引物对曼氏无针乌贼1个野生群体和5代养殖群体共120个个体(每个群体20个个体)进行了RAPD群体遗传多样性分析,共扩增出119个位点,片段大小为400-2800bp,平均每条引物的扩增带数为4.96条。各群体的多态位点数19-24个不等,多态位点比例为13.33%-20.16%,Shannon指数为0.0768-0.1018。6个群体的平均杂合度为0.0825-0.1231,期望杂合度为0.1325-0.1524,平均杂合子偏离指数均为负值,表明存在杂合子缺失的现象。乌贼6个群体遗传分化系数FST值在0.0188-0.2436,其中最大出现在野生群体和第5代养殖群体之间。表明6个群体间遗传分化已基本处于遗传分化中等的范围内,而野生群体和第5代养殖群体之间已接近中等分化的底线。分子方差分析(AMOVA)结果表明,6个群体的遗传变异中有29.34%是由不同群体间的基因差异造成的。而如果将养殖后的5代群体作为一个总的群体,养殖群体内部有19.38%是由群体间的差异造成的。由此可见,养殖后的曼氏无针乌贼群体相比野生群体多样性指数有所降低,且随着养殖时间的增长养殖群体内部开始出现分化。     

基于de novo高通量测序的曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)ESTs中微卫星位点筛选与特征分析

对均一化转录组测序获得的47604个曼氏无针乌贼的微卫星序列进行分析,结果表明,乌贼转录组中微卫星位点丰富,每1402nt的EST中就有一段不小于12nt长度的微卫星序列。单碱基重复是EST微卫星序列的主要形式(38.69%),其次依次为三碱基(31.14%)、二碱基(26.35%)、四碱基(3.29%)、五碱基(0.38%)、六碱基(0.14%)重复,短序列类型占微卫星总量的96.18%。同碱基类型的微卫星序列组成又存在差异,AC(54.51%)和AG(31.22%)是最常见的二碱基重复序列;而AGC(16.37%)和AAC(14.06%)是最常见的三碱基重复序列。通过引物设计和体系优化,共筛选到了24对多态性微卫星位点,对来自福建漳州海域的35只野生曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)个体进行群体遗传学检测,结果表明,每个位点检测到的等位基因数3—10个不等(均值5.9个);平均杂合度观测值(Ho)和期望值(H_e)分别为0.518和0.681。除2个位点外所有位点的多态信息含量(PIC)都大于0.5。Hardy-Weinberg平衡检测表明,仅4个位点有显著偏离(P0.05),未检测到连锁不平衡现象。这表明转录组高通量测序技术适于乌贼微卫星位点的开发,获得的SSR标记可用于今后乌贼资源遗传评估和科学有效管理过程。     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)SCD基因全长cDNA的克隆和序列分析

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是脂肪代谢的关键酶。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆了曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)SCDcDNA的全序列,序列全长1513bp,由261bp的5′非翻译区、编码306个氨基酸的921bp开放阅读框和331bp的3′非翻译区组成。在线翻译所得多肽理论分子量为34.92kDa,等电点为8.95,是疏水性蛋白,含有丰富的螺旋结构(45.10%),存在4个跨膜区。其氨基酸序列与真蛸(Octopus vulgaris)和长牡蛎(Crassostrea gigas)相似性达到91%,与其它非软体动物也表现为50%以上的相似性,说明SCD结构相对保守;系统进化树结果表明曼氏无针乌贼和真蛸及牡蛎进化关系最近,与鱼类稍远,与人及大鼠等哺乳动物亲缘关系最远。SCD基因是改善曼氏无针乌贼肉质的重要候选基因,其成功克隆及相关分析对于深入探讨软体动物脂肪酸代谢相关基因在生物体内作用机制及调控机理具有重要意义。     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)ALSM基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE技术分离、克隆得到曼氏无针乌贼肝脏ALSM(Astacin-like squid metalloprotease)基因。序列分析表明,ALSM cDNA序列全长1418bp,其包括53bp的5’端非翻译区,1290bp阅读框以及含有poly(A)信号AATAAA的75bp3’端非翻译区,阅读框编码429个氨基酸残基。推导蛋白的相对分子质量为48916.31Da,等电点为7.978。ALSM氨基酸序列的同源性分析显示,不同进化地位动物的ALSM氨基酸序列都具有较高的同源性。系统发生树分析发现,曼氏无针乌贼ALSM首先与金乌贼、莱氏拟乌贼、长枪乌贼及太平洋褶柔鱼的ALSM-Ⅰ亚型聚类,再与其ALSM-Ⅱ及ALSM-Ⅲ亚型聚类。生物信息学分析表明,ALSM编码的蛋白为一种亲水性的分泌蛋白。这些结果对进一步研究ALSM的结构与功能以及从基因调控角度探索曼氏无针乌贼在养殖条件下生物学特性变化机理具有重要意义。     

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)精子表面蛋白17(Sp17)基因克隆以及组织表达特异性分析

精子表面蛋白17(Sp17)是参与受精过程的关键分子。本研究采用RT-PCR以及RACE技术克隆得到了曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)Sp17简称Sj-Sp17 c DNA的全长序列,序列全长1463bp,5′和3′非编码区分别为92bp和222bp,预测的开放阅读框(ORF)全长1149bp。编码的蛋白理论分子量为42.0548k Da,等电点4.66,是一种亲水性蛋白,不存在跨膜区以及信号肽序列,含有丰富的螺旋结构(54%)。同源氨基酸序列比对发现,与其他软体动物的相似性最高仅为44%,表明Sp17在进化中并不保守。基于Sp17氨基酸序列构建的系统进化分析表明,曼氏无针乌贼和加州双斑蛸(Octopus bimaculoides)进化关系最近。组织特异性分析发现Sp17在曼氏无针乌贼的生殖系统中均有较高的表达量,其中在精巢和储精囊中有显著表达。Sp17基因的成功克隆以及组织表达特异性分析对于深入研究其细胞定位以及生物学功能具有重要意义。     

浙江近海曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni) 繁殖生物学特性变化研究

采用常规生物学方法和统计回归分析方法,对浙江近海曼氏无针乌贼的繁殖生物学特性进行了研究,比较了不同时期浙江近海曼氏无针乌贼卵巢成熟系数(GSI)、生物学体型及个体生殖力与生物学指标关系。结果表明,浙江近海曼氏无针乌贼GSI在4月份达到最高(9.51%±7.23%),相比20世纪60年代初、80年代初,自然海域曼氏无针乌贼的性腺发育提前,且生殖期延长。20世纪80年代初曼氏无针乌贼的生物学体型、怀卵量及个体生殖力均大于60年代初和自然海域曼氏无针乌贼,同时曼氏无针乌贼在人工养殖条件下生物学体型、怀卵量及个体生殖力增大。浙江近海曼氏无针乌贼的个体生殖力均随着胴长(ML)、体质量(W)、卵巢质量(WO)、GSI这些指标的增大而增大,除体质量相对生殖力(FW)与ML为密切正相关外,个体生殖力与这些指标的关系均达到了极显著水平(P<0.01)。多元线性逐步回归分析表明,WO是影响浙江近海曼氏无针乌贼个体生殖力的最重要指标。     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)精子形成的超微结构

采用透射电镜技术,研究了曼氏无针乌贼精子形成的超微结构变化.结果表明,曼氏无针乌贼精细胞形成初期,细胞核圆形,染色质小团块状,线粒体、高尔基体、中心粒等细胞器分散在细胞质中.随后精细胞形态发生了一系列变化:(1)核内染色质凝集经颗粒化、细纤维化及粗纤维化,最终形成高电子密度的均质结构;(2)核形由圆形或椭圆形,变成长椭圆形,再拉长成长柱状纺锤形,核后端侧部内陷形成核后窝,"9 2"轴丝结构由此形成;(3)高尔基囊泡积累电子致密物,融合发育成顶体囊,并逐渐演变成n形顶体;(4)线粒体逐渐向核后端移动,形成精子尾部中段的线粒体spur.     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)sigma-型谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及重组表达

采用EST结合RACE技术进行了曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)sigma-型GST(SmGST)基因的克隆。结果表明,该基因的cDNA全长为838bp,其中5′非编码区为73bp,3′非编码区为150bp,开放阅读框为615bp,编码的蛋白含有204个氨基酸。该基因的氨基酸序列中包含1个典型的GST-N结构域和一个GST-C结构域,与栉孔扇贝和长牡蛎的sigma-型GST的相似度分别为40.3%和39.3%。将该基因的编码区重组到pET-21(a+)载体后在大肠杆菌中得到诱导表达。重组SmGST的GST活力为(12.22±0.92)U/mg蛋白。     

光照周期对曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)繁殖、性类固醇激素系统及生长性能的调控作用

养殖条件下的性早熟、个体小型化是影响曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)的养殖效益的重要因素。为探讨养殖条件下曼氏无针乌贼性早熟的可能因素,本文探讨了3种不同光照周期(23D:1L;12D:12L;1D:23L)对其繁殖性能及个体生长的影响。结果表明:光照周期对曼氏无针乌贼的繁殖性能总体影响不大,除长光照周期(1D:23L)下,睾酮(T)、雌二醇(E2)等激素水平有较显著的降低外(P0.05),光照对乌贼繁殖时间、性腺重及性腺发育指数等指标均无明显影响。但光照周期对曼氏无针乌贼生长却有明显影响,在胴长、体重、瞬时生长率(IGR)及肥满度等生长指标上均呈现出短光照组中光照组长光照的趋势。短光照组雌乌贼在体重、瞬时生长率和肥满度,雄乌贼在胴长等指标上,均显著优于长光照组(P0.05)。该结果表明光照周期可作为影响曼氏无针乌贼生长性能的重要因素,在今后的养殖条件优化中应加以考虑。     

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)促性腺激素释放激素(GnRH)基因的鉴定、特征及成熟期的表达研究

促性腺激素释放激素（GnRH）在脊椎动物的繁殖过程中起着至关重要的作用,同时也存在于许多无脊椎动物中。利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆出曼氏无针乌贼（Sepiella japonica）促性腺激素释放激素（命名为SjGnRH,KP 982885.1）。SjGnRH基因的cDNA全长710 bp,开放阅读框（ORF）为273 bp,编码90个氨基酸,包括一条含有31个氨基酸的信号肽、12个氨基酸的GnRH多肽和44个氨基酸的GnRH相关肽（GAP）;SjGnRH与剑尖枪乌贼（Uroteuthis edulis）和真蛸（Octopus vulgaris）的同源性分别为86.7%和73.3%;SjGnRH高度保守的十二肽与剑尖枪乌贼和真蛸的octGnRH相似度达100%,其信号肽的相似性分别为66.7%和54.8%,GAP区的相似性分别为95.5%和77.3%;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示,SjGnRH基因在成熟期的表达具有特异性,在脑中表达量最高,且与其他组织差异显著（P<0.05）;采用原位杂交技术检测SjGnRH mRNA在脑内的表达模式,结果表明：SjGnRH在食道上神经团、食道下神经团和视叶的不同部位均有表达,暗示SjGnRH可能参与曼氏无针乌贼的生殖调控作用。     

基于数学模拟研究曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)在不同温度下进食后胃内容物特性变化及胃排空规律

为研究曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)在不同温度下(15oC、20oC和25oC)进食冰鲜葛氏长臂虾(Palaemon gravieri)后的胃内容物特性变化及胃排空规律,本实验将采用3种常用数学模型(线性、平方根及指数模型)对胃排空曲线进行拟合,比较进食后胃排空过程中胃内容物的水分、pH和消化酶的变化规律。结果表明,3种数学模型均能较好地描述曼氏无针乌贼胃排空曲线,但是平方根模型对曼氏无针乌贼胃内容物湿重和干重的数据拟合效果最优。根据平方根模型计算,在15oC、20oC和25oC水温时曼氏无针乌贼50%胃内容干重排出的理论时间分别为4.4h、3.7h和3.6h,而完全排空的时间分别为13.8h、12h和12h。在摄食后0—14h内,胃内容物水分含量表现为先逐渐下降后显著上升;pH值在摄食后0—8h内逐渐降低,8—14h缓慢上升;胃蛋白酶和胰蛋白酶均呈现先升高后降低的变化趋势,而淀粉酶则总体保持恒定。曼氏无针乌贼在15oC、20oC和25oC三个温度下进食冰鲜葛氏长臂虾,胃排空过程中的胃内容物水分含量、pH值和消化酶比活力均存在显著差异(P0.05)。综上所述,25oC水温条件更有利于曼氏无针乌贼的胃排空过程,同时建议在饲喂管理中按照3.6h的间隔进行投喂。     

周期性饥饿再投喂对曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)幼体生长、体组成及氨基酸和脂肪酸的影响

采用持续投喂(对照组C)和周期性饥饿1d再投喂5d(S1F5)、周期性饥饿2d再投喂4d(S2F4)、周期性饥饿3d再投喂3d(S3F3)4种投喂策略,研究了周期性饥饿再投喂对曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)幼体(10.16±0.25g)的生长、体组成、氨基酸和脂肪酸的影响。结果表明:S3F3处理组中体重增重率、胴体长增长率及成活率三个指标均分别显著低于对照组C(P0.05),而S1F5和S2F4处理组三个指标均与对照组C差异不显著(P0.05)。另外,随着周期性饥饿时间的延长,体组成水分含量呈显著上升趋势(P0.05),而粗蛋白和粗脂肪含量均呈显著下降趋势(P0.05),灰分含量变化不显著(P0.05)。三个处理组中氨基酸总量(T)、必需氨基酸总量(E)均与对照组C差异不显著(P0.05);EPA、DPA和DHA含量均与对照组C差异不显著(P0.05)。综合上述结果表明,S1F5和S2F4组的曼氏无针乌贼幼体均出现了完全补偿生长,并且对其营养组成没有影响,建议曼氏无针乌贼幼体的最佳投喂模式为周期性饥饿2d再投喂4d。     

曼氏无针乌贼（Sepiellamaindroni）ISSR体系优化及养殖群体遗传多样性分析

采用ISSR-PCR技术对曼氏无针乌贼基因组DNA进行扩增,筛选分析了ISSR—PCR扩增时的主要影响因子,包括Mg^2＋浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度以及退火温度,并用8条ISSR引物对舟山养殖群体进行了遗传多样性分析,最终确立的适用于曼氏无针乌贼ISSR扩增的25μl反应体系为：Mg2＋1．5mmol...     

浸洗对淡干海带中主要金属元素含量及海藻酸盐组成的影响

以烟台海域淡干海带为实验材料,对浸洗前后其主要金属元素含量及海藻酸根阴离子基团含量进行了研究。结果表明:淡干海带经过浸洗后钾、钠元素含量下降60%以上,镁元素含量下降31.6%,钙、锶元素含量下降小于10%,海藻酸根阴离子基团相对含量上升了一倍;通过比较主要金属阳离子和海藻酸根阴离子基团含量,证明浸洗之后的海带样品中各金属元素主要以海藻酸盐的形式存在于海带中,计算得到各类海藻酸盐含量(湿重,wt%)依次为:海藻酸钾22.2%、海藻酸钙14.6%、海藻酸镁11.4%、海藻酸钠10.5%。XRD(X-Ray Diffraction,X射线衍射)分析表明海带浸出物含有无机盐类物质,在浸洗之后海带样品无明显无机盐的衍射峰,证明浸洗可除去海带样品中的无机盐。     

人工养殖曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)繁殖生物学特性研究

采用常规生物学方法和统计回归分析,研究了养殖曼氏无针乌贼卵巢成熟系数(GSI)的变化规律和个体生殖力与其主要形态指标之间的相互关系.结果表明,曼氏无针乌贼春苗100日龄时GS/达到最高(12.2%±3.25%),秋苗140日龄时GSI达到最高(13.7%±3.69%).曼氏无针乌贼秋苗的体质量相对生殖力(F<,W>)极...