重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

普鲁兰酶可特异性地水解支链淀粉得到直链淀粉,因而在淀粉加工过程中具有重要的应用。本研究从Bacillus naganoensis ATCC53909基因组中克隆了普鲁兰酶基因pul,并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体p BE中,构建表达载体p BE-pul。在此基础上,将来源于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的17个高表达基因的启动子分别克隆到表达载体p BE-pul中,并转化至Bacillus subtilis ATCC6051?10,成功构建了十七株含有不同启动子介导普鲁兰酶分泌表达的重组菌株。对重组菌株的分泌表达比较发现,启动子P43和Pspov G介导的普鲁兰酶活性明显优于其他启动子,其中Pspov G介导的普鲁兰酶活性更高。同时,还使用了启动子Pspov G介导N端的108个氨基酸缺失的pul324突变体进行分泌表达。通过对17种启动子的比较和两个普鲁兰酶基因的比较,本研究构建的一株重组菌株的普鲁兰酶的表达更为高效,其活性高达389.85 U/mL,后者显著高于现有的相关报道。     

嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的异源表达及重组酶性质

用PCR方法扩增得到嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)XQ3506的普鲁兰酶编码基因Gs P,在大肠杆菌中进行异源表达。在没有外源信号肽的条件下,重组酶部分分泌到周质中,少量分泌到培养液中。重组酶表观分子量约为81 k Da,纯酶比活力为38.2 U/mg。重组酶最适温度为60℃,能短时耐受70℃高温;重组酶最适pH6.5,在pH5.5~7.5的范围内具有较好的稳定性;重组酶Km值为0.086μmol/L,Vmax为0.083μmol/min;K+和Mg~(2+)对重组酶有激活作用,而Ca~(2+)则有抑制作用。重组酶水解普鲁兰糖产物为单一麦芽三糖,对直链淀粉未发现降解作用,是一种I型普鲁兰酶。重组酶Gs P在直链淀粉、抗性淀粉生产和粉丝酶法生产工艺中有一定的应用前景。     

酸性普鲁兰酶基因在地衣芽孢杆菌中的表达

根据Genbank公布的来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因突变体序列(AX203843)合成普鲁兰酶成熟肽基因。将该基因插入芽孢杆菌分泌型表达载体pHY-WZX,重组质粒转化地衣芽孢杆菌B60608,重组地衣芽孢杆菌实现普鲁兰酶分泌表达。对重组菌产普鲁兰酶的条件进行优化,以含2%药媒和8%甘油的培养基最适合普鲁兰酶表达。     

产甲壳素酶多粘类芽孢杆菌A1的筛选鉴定及发酵产酶条件研究

从土壤中分离得到一株产甲壳素酶的细菌,经形态学、生理生化及分子生物学鉴定,确定为多粘类芽孢杆菌,命名为A1。研究发现甲壳素、壳聚糖和淀粉可诱导该菌产甲壳素酶;添加尿素可提高甲壳素酶产量。本文研究确定该菌发酵产酶条件如下:培养基采用1%甲壳素（120目）,0.05%Mg SO₄·7H₂O,1.2%尿素,0.5%Na Cl,0.07%K₂HPO₄,0.03%KH₂PO₄,0.3%酵母提取粉,初始p H4.5,接种龄12 h,接种量1%,于37℃培养78 h,在此条件下,该菌产甲壳素酶水平达到0.549 U/m L。该菌在对数期,其产酶曲线的上升略滞后于生长曲线变化;而在衰亡期,产酶曲线的降低略早于生长曲线的降低,说明该酶的mRNA的稳定性较差。      

多粘类芽孢杆菌发酵粗酶液酶解提取葡萄籽中的原花青素

通过多粘类芽孢杆菌液体发酵技术得到富含果胶酶的发酵液,对葡萄籽进行酶解处理提取原花青素。以葡萄籽原花青素提取率为指标,在单因素和正交试验的基础上,确定了原花青素提取的最佳工艺条件。在粘类芽孢杆菌发酵液酶活为313U/mL,料液比为30 g/L、pH值为9、酶解温度为45℃、时间为70 min的条件下,葡萄籽原花青素的提取率可达到3.39%。     

枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的分泌表达及其在粉丝制作中的应用

作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外.重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积...     

新普鲁兰酶水解淀粉及应用研究进展

新普鲁兰酶（neopullulanase,nPU,EC3.2.1.135）是一种多功能复合型的淀粉水解酶。本文介绍了新普鲁兰酶的结构与性质以及在淀粉水解和转糖苷反应中的作用机理,阐述了新普鲁兰酶在α-淀粉水解酶族13中的分类地位及其在食品工业中的应用,并对其重要的研究价值和应用前景进行了展望。      

红曲黄酒来源芽孢杆菌普鲁兰酶基因克隆和生物信息学分析

红曲黄酒酿造原料为大米,淀粉质量分数在70%以上,微生物来源淀粉酶系对淀粉的水解至关重要,影响甚至决定红曲黄酒酿造的原料转化过程和产品品质。从酒曲中分离具有淀粉水解能力的芽孢杆菌2?株,编号BHQ03和BHQ06,进行分子生物学鉴定并分别从2?株菌中克隆获得pulL1和pulL2,pulL3和pulL4共4?个I型普鲁兰酶基因,其中基因pulL1和pulL3均编码713?个氨基酸,序列相似度96.31%,基因pulL2和pulL4均编码852?个氨基酸,序列相似度99.77%。对基因pulL1和pulL2编码蛋白PulL1和PulL2进一步分析发现,二者均属于G13家族,具有4?段特征性保守区域。PulL2的N-端含有32 个氨基酸残基的信号肽序列,且催化活性位点存在突变（D407G）。结合文献研究和三维结构模拟,分析普鲁兰酶的具体催化过程。上述研究为科学解析红曲黄酒酿造的淀粉水解过程提供参考。     

多粘类芽孢杆菌PS04胞外多糖分子结构研究

采用丙烯葡聚糖凝胶S-200 HR对PS04多糖进行过滤层析,得到单一组分峰,且通过凝胶渗透色谱法分析测定,可知该多糖重均分子量为4009ku,峰位分子量为3174ku,分布宽度指数为1.348;结合红外光谱、高效液相色谱及核磁共振分析,确定该多糖由果糖与葡萄糖以7∶1的比例组成,在多糖结构中,果糖残基以呋喃环构型存在,且以β-2,6、β-1,2键连接,因PS04多糖与果聚糖最为接近,可初步判断该多糖是一种果聚糖。      

多粘类芽孢杆菌PS04胞外多糖分子结构研究

采用丙烯葡聚糖凝胶S-200 HR对PS04多糖进行过滤层析,得到单一组分峰,且通过凝胶渗透色谱法分析测定,可知该多糖重均分子量为4009ku,峰位分子量为3174ku,分布宽度指数为1.348;结合红外光谱、高效液相色谱及核磁共振分析,确定该多糖由果糖与葡萄糖以7∶1的比例组成,在多糖结构中,果糖残基以呋喃环构型存在,且以β-2,6、β-1,2键连接,因PS04多糖与果聚糖最为接近,可初步判断该多糖是一种果聚糖。     

广谱抑菌性多粘类芽孢杆菌的筛选及其细菌素理化特性

采用热处理和琼脂扩散法从湖泥中筛选出一株产广谱抗菌活性物质的芽孢杆菌XW4,通过形态观察、生理生化实验、16S rDNA分析等对其进行鉴定,并对其发酵产物进行抑菌活性探究。结果表明XW4在细菌发育分类学上鉴定为多粘类芽孢杆菌,其发酵产物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、赖氨酸芽孢杆菌等多种腐败微生物均有抑制作用XW4。XW4无细胞上清液对蛋白酶k敏感,对木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶不敏感;经60、80、100℃处理30 min后,对大肠杆菌拮抗活性基本不变;在pH3.0~11.0范围内保持其抑菌活性。     

丝胶抗冻肽在大肠杆菌中的重组表达及其抗冻活性初探

为了高效制备抗冻肽,研究一种丝胶抗冻肽目的基因SerD在大肠杆菌BL21菌株中的重组表达,并分析表达产物的抗冻活性。首先合成SerD基因片段,经KpnI和XhoI双酶切后定向插入质粒载体Pet32a中,构建表达质粒Pet32a-SerD,然后电转化入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行目的基因表达,利用镍琼脂糖亲和层析对目的重组蛋白进行纯化,并对其进行抗冻活性分析。结果表明,最佳表达条件为重组菌在20℃诱导16 h;通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹试验(Western-Blot)鉴定重组蛋白表达成功且His-SerD融合蛋白表达的分子量在25~35 kDa之间;胞内表达His-SerD融合蛋白的大肠杆菌BL21-SerD复苏后的生长活性明显高于PBL空载菌;添加His-SerD融合蛋白可明显降低溶液中冰晶颗粒大小,具有较好的重结晶抑制效果。本文通过基因工程方法在大肠杆菌中成功构建丝胶肽抗冻肽的重组表达系统,并最终获得具有抗冷冻胁迫保护作用的His-SerD融合蛋白。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌

以耐高温α 淀粉酶生产菌地衣芽孢杆菌染色体DNA为模板 ,通过PCR扩增耐高温α 淀粉酶基因 ,将扩增产物 1 9kb的DNA片段插入到pUC1 9质粒中 ,再转化大肠杆菌JM1 0 9,通过在淀粉平板上形成透明圈等方法筛选到一株阳性克隆菌株JM1 0 9(pUAM) ,其表达产物可分泌到培养基中 ,除去菌体的发酵液中每 1 0 0mL酶活可达到 2 7个单位。将发酵上清液浓缩后用冷无水乙醇分级沉淀 ,所得样品进行SDS PAGE分析 ,得到分子质量为 60ku的目的蛋白带。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku,同核酸序列测定所推导的值相符。     

枯草芽孢杆菌发酵提取物对大肠杆菌的抑制作用

为探索枯草芽孢杆菌发酵提取物对大肠杆菌的抑菌效果及作用机理,利用倍半稀释法确定其对大肠杆菌的最小抑菌浓度,通过研究枯草芽孢杆菌发酵提取物对大肠杆菌生长曲线、细胞膜通透性以及细胞超微结构的影响,探讨提取物对大肠杆菌的抑制作用机理,同时对该提取物的化合物类型进行了初步分析。结果表明,该提取物对大肠杆菌具有明显的抑制作用,其最小抑菌浓度为0.614 mg·mL^-1,在大肠杆菌生长的延滞期和对数期加入该提取物,比在稳定期加入能够显现出更好的抑菌效果。经提取物作用后的细胞表面粗糙,边缘模糊,细胞膜破裂,表明该提取物能够增加大肠杆菌细胞膜的通透性。化合物分析显示,提取物中抑菌成分主要是多烯类化合物和脂肽类化合物。     

淀粉酶基因的克隆及其在工业啤酒酵母中的表达

以扣囊复膜孢酵母菌总DNA为模板，通过PCR扩增克隆到约1．5kb的α-淀粉酶基因(AMY)。用酵母菌穿梭载体YEp352为出发质粒，磷酸甘油酸激酶基因1(PGK1)启动子和乙醇脱氢酶基因1(ADH1)终止子为调控元件构建了含α-淀粉酶基因编码序列的酵母菌重组表达质粒pLA8。pLA8导入工业啤酒酵母菌，在以淀粉为唯一碳源的YNBS培养基上筛选阳性转化子，转化子培养液中α-淀粉酶活性为1．1U／ml，细胞破碎液的酶活性为0．3U／ml，而受体菌培养液及细胞破碎液中末检测到α-淀粉酶活性。     

Thermomyces lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

Thermomyces lanuginosus脂肪酶(简称TLL)是具有重要商业应用价值的脂肪酶之一。运用RT-PCR技术,从Thermomyces lanuginosus ZJB09222基因组中克隆得到885 bp脂肪酶基因cDNA序列,其结构基因编码蛋白包含292个氨基酸。将脂肪酶基因cDNA序列开放阅读框克隆到大肠杆菌表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),构建了基因工程菌E.coli BL21/pET28b-TLL。诱导表达后SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子量约为32 ku。筛选获得廉价重组菌培养基,表达条件优化结果表明,当OD600约为0.6～0.8时,加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,在28℃诱导培养7 h,酶活达到41 U/mL。     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

Cloning and Expression of a Limonene Degradation Pathway from Bacillus stearothermophilus in Escherichia coli

The pathway encoding limonene catabolism was cloned as a 9.6kb chromosomal fragment from Bacillus stearothermophilus strain BR388 into Escherichia coli. It conferred growth on limonene as a sole carbon source and bioproduction of α-terpineol, perillyl alcohol, and perillyl aldehyde. Incubation of the recombinant with perillyl alcohol resulted in formation of perillyl aldehyde and perillic acid. Catabolic pathways apparently affected the microbial toxicity of limonene.     

Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pul A),将其连接至p ET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体p ET-28a(+)-pul A,转入到EscherichiacoliBL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃～40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用p H为6.0,在p H 6.0～8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K+和Mg~(2+)对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。