小鼠B7-H4重组蛋白的表达及鉴定

目的:构建小鼠B7-H4胞外区基因的真核表达载体,转染酵母细胞以表达mB7-H4,并检测其生物学活性.方法:以mB7-H4的重组质粒为模板,在克隆引物上加入Xho I和EcoR I酶切位点,并用PCR方法扩增得到mB7-H4胞外区的基因片段,经Xho I和EcoR I双酶切后接入酵母表达载体Ppic9上,构建成Ppic9-mB7-H4重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染至酵母细胞,用PCR、Western Blot及ELISA等方法检测重组基因的表达,并鉴定表达蛋白的生物学活性.结果:转染Ppic9-mB7-H4重组质粒的酵母细胞内表达mB7-H4,诱导表达的mB7-H4能有效抑制CD3单抗活化的T淋巴细胞的增殖(相对抑制率为28.3%)和IL-2(相对抑制率为68.8%)、IL-4(相对抑制率为78.8%)、IL-10(相对抑制率为67.6%)、IFN-γ(相对抑制率为77.7%)等细胞因子的分泌.结论:成功构建了mB7-H4真核表达系统,并获得了有生物学活性的mB7-H4分子.     

重组多功能抗凝多肽的表达及活性测定

目的 探讨多功能抗凝多肽基因的克隆、表达的可行性及其活性的测定。方法 设计一个具有双重抗凝功能的重组多肽分子结构,它由谷胱甘肽-S-转移酶(GST)作为载体蛋白与重组抗凝多肽融合而成。编码重组抗凝多肽的DNA序列是根据氨基酸序列逆向翻译后经人工合成,并插入表达质粒pGEX-5X-3中,与其中的编码GST序列的3‘端融合。采用大肠杆菌DH5α进行原核表达。应用亲和层析的方法得到纯化的融合蛋白。重组抗凝多肽含有31个氨基酸,由3个功能部分组成：(1)Lys-Gly-Asp(KGD)氨基酸序列,可抑制血小板GpⅡb／Ⅲα受体与纤维蛋白原的结合;(2)纤维蛋白单肽A的7-16残基(FBA^7-16),是凝血酶的抑制剂。(3)水蛭素C末端的12肽,可直接抑制凝血酶。结果 纯化的融合蛋白能抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集(100μmol／L时其活性为对照组的20．7％);随浓度增加而显著延长部分凝血活酶时间(80μmol／L时凝血活酶时间为74．7s)和凝血酶时间(80μmol／L时为102．3s)并抑制凝血酶的蛋白酶分解活性(100μmol／L时活性为对照的11％)。同时,也发现GST也有抗血小板作用,但其作用要明显弱于融合蛋白。结论 通过基因重组的方法设计一具复合抗凝功能的多肽是可行的。     

鼠连接蛋白43基因真核表达重组质粒的构建和鉴定

目的 构建含鼠连接蛋白43基因的真核表达重组质粒。方法 从胎鼠中提取总RNA，经RT-PCR方法获得并扩增含全部编码序列的连接蛋白43cDNA片段，将其克隆到pBudCE4．1真核表达载体上，并进行酶切鉴定和测序分析。结果 RT-PCR技术扩增出约1．1kb的连接蛋白43基因全部编码序列的片段。测序分析证实所插入连接蛋白43基因片段的序列完全正确。结论 鼠连接蛋白43基因真核表达重组质粒成功构建。     

重组人白介素2—穿孔蛋白免疫毒素的制备及功能活性

以人白细胞介素２为载体，人Ｐｅｒｆｏｒｉｎ为毒素，利用基因工程技术构建成ｐＢＶ２１１／ＩＬ２－Ｐｅｒｆｏｒｉｎ表达质粒，在大肠杆菌中成功地表达出ＩＬ２－Ｐｅｒｆｏｒｉｎ重组毒素，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ获得分子量的２０ＫＤ的蛋白条带，细胞毒测定对活化的人Ｔ淋巴细胞和ＩＬ２依赖株ＣＴＬＬ２有明显的杀作用，并且明显抑制同种混合淋巴细胞反应，这是一种性质全新的重组毒素，其杀伤机制不同于以往所用的毒素（ＰＥ，ＤＴ     

人颗粒溶素活性肽重组卡介苗的构建与表达

目的 构建携带人颗粒溶素(GLS)活性肽的重组卡介苗(BCG),并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.方法 以分子生物学方法构建携带GLS活性肽基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBMS,以电转化方式将pBMS质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT-PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.结果 采用电转化方式可将pBMS导入BCG,抽提质粒鉴定出与GLS基因相符的目的 条带.以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96 h后用RT-PCR法可扩增出相应的基因条带.结论 成功构建含pBMS的重组BCG.该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因.     

重组γ干扰素的表达与纯化

目的 探讨γ干扰素在大肠杆菌中的表达及纯化方法,为下一步批量生产提供实验依据。方法 应用ＤＮＡ重组技术把中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物ＩＦＮ－γｃＤＮＡ克隆到析核表达质料ｐＢＶ２２０上,构建出ｐＢＶＩＦＮ高效表达载体,转化大肠杆菌ｐｌｙｓｓ。通过温度诱导,高效表达ＩＦＮ－γ ｃＤＮＡ。然后,经过包涵体溶解、复性、浓缩及ＤＥＡＥ离子交换层析,使γ干扰素纯化。结果 ＩＦＮ－γ ｃＤＮＡ表达水平占菌体     

日本血吸虫重组抗原的诱导表达及其免疫学活性鉴定

为了筛选和发现日本血吸虫新的疫苗候选抗原分子我们构建了日本血吸虫抗原ＰＳｊ＾５１４与表达载体ｐＧＥＸ－１λｔ重组体，表达克隆ｐＧＳｊ２４。对工程菌的诱导表达及表达产物分析证实，特异性表达产物是分子量约为２２ｋＤａ的两条十分接近的蛋白带。该蛋白可溶性蛋白，表达方式为分离表达，可被日本血吸虫免疫兔血清，感染兔血清及病人血清特异地识别。     

重组CD13单链抗体／蝎毒素AGAP原核表达质粒的构建

目的:构建pRSETA/AGAP/CD13scFv重组表达质粒,为重组CD13单链抗体/蝎毒素AGAP融合蛋白的表达奠定实验基础.方法:利用RT-PCR法从东亚钳蝎尾腺中获得AGAP目的基因,并与克隆质粒TOPO载体连接转入DH5α菌,用EcoR I和Hind III将目的基因从克隆质粒上切下并与同样双酶切后的表达质粒 pRSETA连接;在含CD13单链抗体(CD13scFv)的pSecTag2HygroC/CD13 -1/RFP质粒中获得CD13scFv目的基因,用EcoR I、Xho I双酶切并与同样双酶切后的pRSETA/AGAP连接转入DH5α菌,提取重组质粒进行酶切及测序鉴定.结果:目的基因AGAP与表达质粒pRSETA连接,成功构建了pRSETA/AGAP重组质粒;目的基因CD13scFv再与该重组质粒连接,成功构建了pRSETA/AGAP/CD13scFv.结论:AGAP目的基因能经RT-PCR法获得,并能成功与表达质粒连接,构建pRSETA/AGAP;目的基因CD13scFv能由pSecTag2HygroC质粒中获得,并成功与pRSETA/AGAP连接,得pRSETA/AGAP/CD13scFv重组质粒.为该重组质粒体外融合蛋白的表达及今后研究CD13scFv和蝎毒素AGAP协同性杀伤CD13阳性肿瘤细胞提供了良好的实验基础及理论依据.     

Alloferon-1抗生肽串联重组表达及重组Alloferon-1体外抗肿瘤活性

目的:构建含胰蛋白酶酶切位点的Alloferon-1抗生肽重复串联DNA片段及其原核表达系统,了解有赖氨酸尾重组Alloferon-1( rAlloferon-1)体外抗肿瘤活性.方法:根据Alloferon-1序列不合精氨酸和赖氨酸的特点,构建C端加有含胰蛋白酶酶切位点赖氨酸的14 x Alloferon-1抗生肽重复串联DNA片段.采用pET42a 表达载体和E.coli BL21 DE3表达宿主菌,构建Alloferon-1重复串联DNA片段原核表达系统.SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组产物表达量,Ni-NTA亲和层析、胰蛋白酶酶切和Sephadex G-50层析法提纯14×rAlloferon-1-K及其rAlloferon-1 -K单体.BALB/c小鼠脾细胞分别与K562、KB和SGC肿瘤细胞共培养模,采用CCK-8法检测rAlloferon-1 -K、化学合成Alloferon-1( cAlloferon-1)及Alloferon-1 -K( cAlloferon-1 -K)体外抑制肿瘤细胞生长及增殖的活性并进行比较.结果:原核表达系统E.coli BL21 DE3pET142a-14 x Alloferon-l-K在IPTG诱导下能有效表达14×rAlloferon-1-K蛋白,其产量约为细菌总蛋白的30%.0.1～10 ng/ml 的rAlloferon-1-K具有明显提高小鼠脾细胞抑制K562、KB和SGC肿瘤细胞的生长及增殖(P＜0.01),rAlloferon-1 -K的抗肿瘤活性与cAlloferon-1及cAlloferon-1 -K比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:本研究成功构建了Alloferon-1抗生肽重复串联原核表达系统,有效地提高了Alloferon-1产量;而且rAlloferon-1 -K仍保持原有的体外抗肿瘤活性.     

重组人血小板因子4的表达、纯化及活性鉴定

目的: 用基因工程手段去获取有活性的重组人血小板因子4(rhPF4),为下一步的基础理论研究和临床应用奠定基础.方法: 用PCR手段获得人PF4的编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET-PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,用SDS-PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白,用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验(CAM)验证rhPF4的活性.结果: 成功构建了表达载体pRSET-PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致.IPTG诱导表达的rhPF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11%.亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84%.CAM实验表明,经纯化获得的rhPF4对鸡胚血管形成具有抑制作用.结论: 成功地获得了具有高度生物学活性的rhPF4蛋白.     

重组人脑利钠肽治疗高龄顽固性心力衰竭

目的:研究重组人脑利钠肽治疗高龄顽固性心力衰竭患者的有效性及安全性。方法:以我科住院的56例高龄顽固性心力衰竭患者为研究对象,将其随机分为治疗组和对照组,对照组在应用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)或血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blocker,ARB)、地高辛、螺内酯、他汀类等药物的基础上,予以静脉泵入硝普钠,治疗1周;而治疗组则给予持续静脉泵入重组人脑利钠肽,治疗1周。分别于治疗3、7 d后观察两组患者心力衰竭症状的改善情况,并观察两组患者左室射血分数(left ven-tricular ejection fraction,LVEF)、血浆NT-proBNP、尿量、日常生活活动量表(Barthel指数);治疗期间每日监测治疗组的尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血管收缩压(SBP)等指标。结果:与对照组相比,治疗组患者治疗有效率显著提高,左室射血功能改善、尿量增加、心脏负荷减轻,日常生活能力改善,差异有统计学意义(P<0.05);治疗期间对患者肾功能无明显影响,血压虽有轻度下降,但不影响重要器官的灌注。结论:重组人脑利钠肽治疗高龄顽固性心力衰竭患者是有效、安全的。     

Secretory Expression of Recombinant Diphtheria Toxin Mutants in B. Subtilis

B.Subtiltjisanotherwidelyusedhostforproductionofrecombinantproteinsal-ternativetoE.COli.Theexcellentsecreto-rycapacityofexpressedproteinandendo-toxin-freenaturemakeB.Subtilisapoten-tial"biofactory"superiortoE.Coli[1j.Diphtheriatoxin(DT)isthemostpowerfulexotoxinfusedwith"cancer-specific"anti-bodiestoformimmunotoxincommon1yusedintheexperimentsofcancertherapies['J.ThenontoxicDTmutantswerealsobe-lievedtobethecandidatesfornextgenera-tionrecombinantvaccineandthereforeisnowdrawingattentioninitse…     

重组人脑钠肽治疗急性心力衰竭的研究进展

近年来,心血管疾病已经成为影响人类健康和社会劳动能力的重要疾病。急性心力衰竭(心衰)是各种心脏疾病的终末期,可用利尿剂、扩血管药、正性肌力药、肾素-血管紧张素-醛固酮系统拮抗剂治疗。但这些传统药物治疗效果单一,不良反应多。脑钠肽是一种由心肌细胞合成和分泌的肽类激素,它不仅可以评定心衰进程和判断预后,而且在治疗急性心衰方面具有利钠利尿、扩管、拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统等作用。作为与内源性脑钠肽结构相同的人工合成肽类激素,该文对重组人脑钠肽在治疗急性心衰中的作用予以综述。     

重组人心钠肽治疗急性心力衰竭的临床研究

目的：探讨重组人心钠肽治疗急性心力衰竭疗效。方法：对自2011年5月～2013年2月我院收治的急性心力衰竭患者应用重组人心钠肽治疗,于用药前后监测患者的血流动力学参数。结果：66例患者59例症状缓解,显效27例,有效32例,无效7例,有效率89．39％。结论：重组人心钠肽是治疗急性心力衰竭疗效可靠的药物,安全性高。     

重组人脑钠肽和米力农治疗老年充血性心力衰竭的比较

目的:本文应用重组人脑钠肽(rhBNP)和米力农对顽固性的老年充血性心力衰竭进行治疗,并观察临床治疗的疗效比较。方法:将30例老年充血性心力衰竭患者随机分为两组,一组在常规治疗的基础上加用米力农,另一组在常规治疗的基础上加用重组人脑钠肽,观察治疗前后两组患者的临床症状、体征、心功能等的改善情况。结果:两组治疗前后,重组人脑钠肽疗效明显优于米力农组,两者比较,差异有统计学意义。结论:重组人脑钠肽治疗老年充血性心力衰竭疗效确切,较米力农改善更加明显。     

不同剂量新活素治疗充血性心衰疗效和安全性观察

目的 评价不同剂量新活素治疗充血性心力衰竭（CHF）的疗效及其不良反应.方法 A组30例,给予新活素0.1μg/kg的负荷量静脉注射,随后予0.01μg/（kg·min）持续静脉泵入24h;B组30例,给予新活素0.1μg/kg的负荷量静脉注射,随后予0.015μg/（kg·min）持续静脉泵入24h.观察两组用药前后生命体征、呼吸困难程度、体循环淤血及N-末端脑钠肽前体（N-terminal proBNP,NT-proBNP）的变化;1个月时6分钟步行距离和超声心动图评估左心室舒缩末期各径线、左心房径及EF.结果两组比较,在改善呼吸困难和体循环淤血程度等临床症状方面差异有统计学意义（P〈0.05）;两组患者NT-proBNP水平均较前下降（P〈0.05）,但两组之间变化差异无统计学意义（P〉0.05）;1个月时6min步行距离差异有统计学意义（P〈0.05）,LVEDD、LVEF差异无统计学意义（P〉0.05）;低血压、肾功能损害和电解质紊乱的发生率两组之间差异无统计学意义（P〉0.05）.结论 新活素治疗CHF疗效显著,0.1μg/kg的负荷量静脉注射,随后予0.015μg/（kg·min）持续静脉泵入24h的疗效更好.     

基于毒素多肽BmK NaTx-13的全蝎质控工艺研究

目的 基于毒素多肽建立一种新型的全蝎质量检测工艺。方法 从东亚钳蝎毒液中分离得到了一种新型钠通道毒素BmK NaTx-13,制备并鉴定了BmK NaTx-13的特异性抗体,并通过竞争性ELISA法检测全蝎提取物中的BmK NaTx-13的含量。结果 建立的竞争性酶联免疫吸附法可快速检测全蝎提取物中的BmK NaTx-13的含量并呈现良好的浓度线性依赖。结论 该研究为全蝎质控提供了一种快速免疫检测方法,为提升全蝎入药质量标准提供了借鉴。      

信号肽重组mBD2在宫颈癌细胞中的稳定表达及活性测定

目的 探讨鼠重组beta防御素2(rmBD2)对SiHa细胞增殖的影响.方法 采用脂质体转染法将真核表达质粒pcDNA3.1( )/rmBD2转染SiHa细胞系,G418筛选出稳定表达细胞克隆.分别采用间接免疫荧光染色、RT-PCR方法检测稳定转染细胞中rmBD2蛋白和rmBD2 mRNA表达,并采用MTT法对稳定转染细胞株进行细胞增殖能力的测定.结果 采用100 μg/mL的G418浓度筛选质粒转染的SiHa细胞20 d,得到了rmBD2稳定表达细胞株SiHa/rmBD2及转染pcDNA3.1( )空质粒的对照细胞SiHa/K.免疫荧光染色显示SiHa/rmBD2细胞质中均有目的 蛋白的表达,转染效率为100%.提取稳定转染4、6、8、10 周SiHa/rmBD2细胞总RNA,RT-PCR反应扩增得到220 bp左右的目的 片段,而SiHa/K及SiHa细胞未见目的 蛋白表达.细胞生长曲线显示SiHa/rmBD2细胞的生长速度低于SiHa/K及SiHa细胞(P＜0.05).结论 本研究成功筛选了稳定表达rmBD2的细胞株SiHa/rmBD2,并采用间接免疫荧光染色、RT-PCR证实了rmBD2蛋白和rmBD2 mRNA的稳定表达,细胞增殖实验表明rmBD2可以明显抑制肿瘤细胞的增殖,为进一步研究rmBD2的抗肿瘤作用奠定了细胞学基础.     

早期应用重组人脑利钠肽治疗急性心肌梗死的临床研究

目的探究早期应用重组人脑利钠肽(rh BNP)对于急性前壁心肌梗死患者急性心力衰竭(AHF)的预防效果。方法回顾我院2012年1月至2016年1月期间入院治疗的急性前壁心肌梗死患者的治疗情况,选择其中90例作为研究对象,将患者按照早期不同的治疗方式分为观察组以及对照组各45例,对照组患者采取常规治疗方案治疗,观察组患者采取常规治疗方案联合rh BNP进行治疗,分析不同治疗方式对于患者的治疗效果以及对于AHF的预防情况。结果观察组患者治疗前的N末端前体脑利钠肽、血浆肾素、血管紧张素Ⅱ以及肾上腺素浓度与对照组比较差别无统计学意义,而两组患者在经过治疗72 h后各项指标下调(P0.05)观察组比对照组更显著(P0.05)。观察组患者在治疗后的随访中显示,患者因心力衰竭再住院的为0例,心源性死亡的为0例,明显少于对照组患者(P0.05)。结论早期应用rhBNP对急性前壁心肌梗死患者进行治疗可有效的改善患者心功能,减少心力衰竭的发生情况,提高治疗效果。     

急性心肌梗死合并心力衰竭应用替罗非班及重组人脑利钠肽的临床研究

目的：研究急性心肌梗死合并心力衰竭(AMI-HF)应用替罗非班及重组人脑利钠肽的临床疗效。方法整群选取该院2013年9月—2015年8月确诊并收治的168名AMI-HF患者按照随机数字表法分为研究组和对照组各84人。两组均采用AMI-HF基线治疗。对照组在基线治疗基础上应用尿激酶实施溶栓治疗,研究组在基线治疗基础上应用替罗非班及重组人脑利钠肽治疗。对比两组临床疗效、治疗前后心彩超主要参数变化情况、不良反应。结果研究组总有效率为96.43%,显著优于对照组的83.33%。研究组左室舒张末径、左室收缩末径、左室射血分数治疗后改善幅度显著优于对照组。两组均无明显不良反应发生。结论 AMI-HF应用替罗非班及重组人脑利钠肽疗效确切,可更显著改善患者心功能,安全性好。