CD80人-鼠嵌合抗体对B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi的生长抑制及杀伤作用

目的:研究CD80人-鼠嵌合抗体(命名为ch-4E5)对天然高表达CD80分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi的生长抑制及杀伤作用.方法:采用免疫荧光及流式细胞术(FCM)分析ch-4E5对Raji及Daudi细胞膜型CD80分子的识别;将ch-4E5分别加入到Raji及Daudi中共培养, 终浓度为10 mg/L.在培养的第0、 4、 10、 16、 24及48 h, 采用FCM检测细胞表面Fas及FasL的表达;培养至72 h, MTT法检测细胞的增殖;以人外周血PBMC为效应细胞, Raji与Daudi为靶细胞, 效靶比为20∶ 1, 加入ch-4E5, 终浓度为10 mg/L.培养至24 h, MTT法分析ADCC效应.结果:ch-4E5与Raji及Daudi的阳性结合率分别为98.6%和96.4%.ch-4E5分别与Raji及Daudi共培养至4 h, Raji细胞表面FasL的表达开始上调, 16 h的阳性表达率为16.8%, 与人IgG1对照组1.5%比较明显升高(P<0.01);Fas的表达从10 h起逐渐增高, 24 h达高峰, 阳性表达率为15.6%, 与人IgG1对照组4.5%比较具有统计学意义(P<0.01).Daudi的FasL及Fas的变化趋势与Raji一致.ch-4E5分别与Raji及Daudi共培养至72 h, 细胞增殖的抑制率分别为34.60%和32.64%(P<0.01);ch-4E5介导PBMC对Raji及Daudi的杀伤率分别为55.61%及54.42%(P<0.01).结论:CD80人-鼠嵌合抗体能够通过其Fab段及Fc段发挥双重的抗肿瘤效应.     

抗人CD86人-鼠嵌合抗体的构建及在CHO细胞的表达

从分泌鼠抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:1D1)中抽提总RNA,采用简并引物,经RT-PCR扩增单抗VH和VL的DNA编码区基因。通过SMART-PCR扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。采用基因重组技术,将单抗VH、VL基因及其相应信号肽序列,与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/1D1。转染293T细胞进行瞬时表达,采用流式细胞术分析,转染上清与L929-CD86基因转染细胞的阳性结合率为97.6%。既而转染CHO细胞,经G418筛选,获取稳定分泌嵌合抗体的基因转染细胞株(CHO-ch1D1)。收集无血清培养基的培养上清,采用Protein G亲和层析柱分离纯化,经Lowr法定量。从上清中获取的嵌合抗体蛋白的得率为3.066 mg/L。经进一步间接免疫荧光及流式细胞术分析,纯化嵌合抗体与L929-CD86基因转染细胞,及Daudi细胞膜型CD86分子的阳性结合率分别为98.5%和95.7%。将嵌合抗体(终浓度为5μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,嵌合抗体对Daudi细胞的生长具有抑制作用(P<0.05)。本研究获取的嵌合抗体在CD86分子的基础和应用研究中具有重要的价值。     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体的构建及其表达

目的:通过基因工程抗体改造技术构建并表达抗人CD40人-鼠嵌合抗体。方法:从分泌鼠抗人CD40单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株(5C11)中提取总RNA,用一对特异性引物通过RT-PCR扩增mAbVH和VL的DNA编码区基因。根据序列分析的结果,设计引物扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。利用基因重组技术,将mAb5C11的VH、VL基因及其相应信号肽序列与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/h5C11。用脂质体法将其导入293T细胞株中进行瞬时表达。利用流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI基因数据库Blast的结果显示,克隆的基因序列符合小鼠VH、VL基因及其信号肽序列的特征。表达质粒pIRES/h5C11的构建正确,并在293T细胞株中获得瞬时表达。表达的抗人CD40的人-鼠嵌合抗体和mAb5C11具有相同的抗原结合位点。结论:成功地克隆了鼠抗人CD40mAbV区编码基因,并实现了可溶性抗人CD40的人-鼠嵌合抗体在293T细胞中的瞬时表达。     

抗人黑色素瘤嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的：构建嵌合型抗人黑色素瘤抗体的真核表达载体，并实现真核表达。方法：从3株杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因，插入含有抗人Tac抗原信号肽以及人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因和γ1重链恒定区基因的真核表达载体pMH-CA中，转染293T细胞，进行嵌合抗体表达，并用RT-PCR、ELISA、Westem blot免疫印迹等对抗体表达鉴定。结果：成功构建了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体，并实现其真核表达。RT-PCR证实了该抗体在mRNA水平上的表达，ELISA和Westemblot证实了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体的表达。结论：成功表达了抗人黑色素瘤人-鼠嵌合抗体。     

组织因子人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建组织因子人-鼠嵌合抗体的真核共表达载体pCN40-V_L-V_H,并转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行稳定表达,以克服鼠源单克隆抗体(mAb)用于临床的局限性.方法:从分泌鼠抗人的组织因子mAb的杂交瘤细胞株(克隆号:mTA)中抽提总RNA,经RT-PCR扩增mAb V_L和V_H的基因序列,构建重组真核表达载体pCN40-V_L-V_H,并进行酶切鉴定和测序.通过磷酸钙沉淀法转染CHO细胞,以终浓度800 μg/L G418筛选阳性细胞,通过间接ELISA、Western blot检测细胞培养上清中嵌合抗体的表达量、活性及特异性.结果:成功构建了抗人组织因子嵌合抗体真核共表达载体pCN40-V_L-V_H并在CHO细胞中表达.ELISA、Western blot证实,表达的抗组织因子嵌合抗体为人鼠嵌合抗体,该抗体能与重组人TF抗原特异性的结合且表达量为51.25 mg/L.结论:成功地构建并在真核细胞中表达了抗人组织因子嵌合抗体,为进一步的研究奠定了基础.     

CD80鼠-人嵌合抗体的CHO细胞表达及体外生物学功能的初步研究

目的:CHO细胞表达抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,并研究其在体外阻断CD80介导的共刺激信号转导的生物学功能.方法:构建含有嵌合重、轻链基因的表达载体pIRES/ch4E5;表达载体先转染293T细胞,FCM检测到ch4E5抗体的瞬时表达后,表达载体再转染CHO细胞,构建稳定表达细胞株CHO-ch4E5;Protein G亲和层析法从CHO-ch4E5细胞无血清培养上清中纯化ch4E5抗体,FCM检测ch4E5抗体对膜型CD80的识别;以丝裂霉素处理的正常人外周血单核细胞PBMCs为刺激细胞,以异体正常人外周血淋巴细胞PBLs为反应细胞,用MTT法分析ch4E5抗体的阻断作用.结果:ch4E5抗体在293T细胞的瞬时表达于48小时达到高峰,上清与L929-B7-1细胞结合率为96.0%;CHO-ch4E5细胞持续表达ch4E5抗体,其培养上清与L929-B7-1细胞结合率为95.7%;3天培养上清中,ch4E5抗体的产率约为5.56 mg/L;ch4E5抗体和L929-B7-1、Daudi、Sub-T细胞结合率分别为94.1%、25.7%、23.5%;ch4E5抗体可以阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制异体PBLs的体外增殖.结论:在CHO细胞中成功表达了抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,在体外该嵌合抗体具有亲本抗体阻断CD80介导的共刺激信号的生物学活性.     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体的表达及体外对癌细胞浸润的抑制效应

目的 制备抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体。方法从分泌抗人组织蛋白酶B单克隆抗体的杂交瘤细胞株提取总RNA，通过RT-PCR扩增单克隆抗体VH和VL的DNA片段，对其进行序列分析，证实具有小鼠可变区完整的结构，利用基因工程技术将它们分别和人Ig的Cγ1和Ck恒定区基因连接组建人鼠嵌合轻链和重链Fab抗体，并克隆到pcDNA3真核细胞表达载体。将重组体转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，通过G418筛选、ELISA检测和Western blot鉴定，分离纯化抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体，用于体外抑制癌细胞浸润的试验。结果得到分泌抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体的中国仓鼠卵巢细胞克隆(O62A2)，分泌的抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体在体外能抑制癌细胞浸润。结论人-鼠嵌合抗体的成功表达，将有可能用于组织蛋白酶B过度表达的有关疾病的治疗。     

抗人CD86双价抗体的表达及与抗原的结合特性

目的:用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达抗人CD86双价抗体(CD86-diabody),鉴定该抗体对表达CD86分子肿瘤细胞的识别及介导的生物学效应.方法:从分泌抗人CD86小鼠源抗体的杂交瘤1D1中克隆抗体重、轻链可变区基因VH及VL.SOE-PCR构建VH-(GGGGS)-VL双价抗体基因,整合到真核表达载体plRES2-EGFP中,脂质体法转染CHO细胞,FCM筛选G418加压培养的阳性克隆.IMAC纯化并定量抗体.免疫荧光法分析抗体对人B系淋巴瘤细胞株Raji及Daudi膜型CD86分子的阳性结合率,将抗体加入到Raji细胞的培养体系中,培养72 h,MTT法分析抗体对细胞体外增殖的影响.结果:获得了稳定分泌抗人CD86-diabody的CHO细胞株.培养上清中抗体纯品的得率为5.24 mg/L.抗体与Raji及Daudi细胞的阳性结合率分别为77.2％及70.6％.经抗体孵育72 h,Raji细胞体外增殖抑制率为37％.结论:成功制备了抗人CD86-diabody,可特异性结合细胞膜型CD86分子,并对表达该分子的肿瘤细胞体外增殖具有抑制效应.     

抗HBV preS1嵌合抗体的真核表达及活性分析

目的通过真核系统表达抗HBV preS1嵌合抗体4D11并分析其活性。方法通过RT-PCR方法从分泌抗乙型肝炎病毒preS1的鼠源单克隆抗体4D11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)序列,并分别克隆到含有Υ1重链和κ轻链恒定区序列的pcDNA3.1-AH和pcDNA3.1-Ak质粒中,共转染人胚肾细胞变种(293 FT)细胞。通过Western blot、竞争ELISA、阳性血清阻断及血清中preS1的检测实验来分析其活性。结果轻重链基因在细胞内正确组装成嵌合抗体分子并分泌至细胞外,具有结合活性。嵌合抗体可以很好的与病毒preS1结合,对阳性血清的检测效果与鼠单抗一致。结论成功的利用293 FT细胞表达了4D11嵌合抗体,抗体保留了原鼠单抗的特异性和活性,为探讨乙肝抗体的治疗提供了试验资料。     

抗人CD3嵌合抗体基因的构建、表达及表达产物的初步功能研究

目的：构建并表达抗人CD3嵌合抗体，以克服鼠源单克隆抗体(mAb)用于临床的局限性。方法：采用基因工程技术，将抗体VL、VH因分别克隆入嵌合抗体表达载体VL Express及VH Express中。共转染COS-7细胞后，用ELISA检测培养上清中嵌合抗体的表达水平；采用Protein A亲和层析法纯化抗体，并进行Western blot鉴定。用FACS检测嵌合抗体结合抗原的活性；混合淋巴细胞培养检测抗体的功能。结果：成功地构建了VH Express-VH及VL Express-VL表达载体并表达纯化。Westem blot的结果显示，表达的抗人CD3抗体为人鼠嵌合抗体。FACS的结果显示．该抗体具有良好的结合抗原活性；混合淋巴细胞培养结果显示．该抗体具有一定的免疫抑制功能。结论：成功地构建、表达了抗人CD3嵌合抗体，为进一步的研究打下了基础。     

抗炭疽保护性抗原人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达和活性研究

目的 在CHO细胞中表达抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)人-鼠嵌合抗体,并对其活性进行分析.方法 RT-PCR克隆具有中和活性鼠源单克隆抗体的轻、重链可变区基因,分别与人Kappa型轻链恒定区、IgG1重链恒定区基因融合后构建了轻重链嵌合抗体基因.将轻重链嵌合抗体基因克隆表达载体上,构建了嵌合抗体的双启动子表达载体pSeeTag-5E1.将pSecTag-5E1转染CHO-dhfr(DG44)细胞,撤掉胸腺嘧啶和次黄嘌呤并不断提高氨甲蝶呤(MTX)的浓度,筛选表达量高的克隆,扩大培养,收集上清,并纯化,用纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western blot、抗原结合活性、体外细胞保护试验和动物试验.结果 在MTX的浓度为5×10~(-8)mol/L时,获得稳定表达细胞株,表达量为18 mg/L.结论 成功在CHO-dhfr(DG44)细胞中表达了具有中和活性的抗rPA人-鼠嵌合抗体,为制备抗炭疽的被动免疫制剂奠定了良好的基础.     

用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究

目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆。检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+。将表达质粒pA FRTHFLF和pOG44以1∶9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+。转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测。筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆。在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其最后的表达量为5mg/L。对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Westernblot和抗原结合活性的检测。结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L。结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础     

嵌合抗CD20Fab诱导Daudi细胞凋亡

为了研究嵌合抗CD20基因工程抗体Fab的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制,本研究采用竞争性免疫荧光抑制实验,证实抗CD20 Fab片段能竞争性抑制亲本鼠源性抗CD20单克隆抗体HI47和Daudi细胞CD20的结合。MTT法测定嵌合抗CD20 Fab对Daudi细胞生长的影响,结果显示嵌合抗CD20 Fab对Daudi细胞的生长具有抑制作用,抑制作用呈剂量依赖性,其IC50为69μg/ml;利用流式细胞仪测定嵌合抗CD20 Fab诱导细胞凋亡作用,结果显示嵌合抗CD20 Fab可诱导 Daudi细胞凋亡,其凋亡率是Rituxan的2倍。这些实验结果证实嵌合抗CD20 Fab通过诱导Daudi细胞凋亡的机制抑制Daudi细胞生长。     

抗TNF-α人-鼠嵌合抗体的构建及表达

目的：构建和表达抗ＴＮＦ－α人－鼠嵌合抗体。方法：将抗ＴＮＦ－α鼠单抗Ｚ８的轻、重链可变区基因插入到含有人ｋ链和ＩｇＧ１重链恒定区基因的真核细胞表达载体中,分别构建轻、重链分开表达和共同表达的人－鼠嵌合抗体真核表达载体转染真核细胞,通过ＥＬＩＳＡ,ＲＴ－ＰＣＲ、免疫印迹检测ＴＮＦ－α的活性。用Ｌ９２９细胞检测嵌合抗体体外中和ＴＮＦ－α的活性。结果：ＥＬＩＳＡ鉴定结果表明该嵌合抗体与ＴＮＦ－α特异性     

人-鼠嵌合抗体表达载体的构建和抗人HER2抗体的表达

目的 :构建表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体 ,用于以嵌合抗体的形式表达PCR获取的小鼠抗体可变区基因 ,以便将人 鼠嵌合抗体应用于临床治疗。方法 :用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建人 鼠嵌合抗体的表达载体 ,并转染真核细胞 2 93T进行表达。用RT PCR、FACS和ELISA进行抗体表达的鉴定。结果 :利用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建了用于表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体。用本研究设计的引物 ,扩增小鼠抗人HER2抗体的V区基因片段 ,酶切后先后插入所构建的载体的相应克隆位点 ,转染 2 93T细胞可将PCR获得的小鼠抗体V区基因片段表达为人 鼠嵌合抗体。用RT PCR、FACS和ELISA证实 ,本系统可表达嵌合抗体。结论 :构建了人 鼠嵌合抗体的真核表达载体 ,并证实了其可在 2 93T细胞中表达。     

抗人肿瘤坏死因子α嵌合抗体的研制

目的：研制抗人肿瘤坏死因子(rTNF—α)嵌合抗体。方法：以具有中和TNF—α活性的鼠源性单抗(Z12)的轻、重链可变区基因，构建人—鼠嵌合抗体基因的表达载体，并转染COS7细胞。用RT—PCR、ELISA、免疫印迹及体外中和rTNF—α活性实验，分别对瞬时表达的抗rTNF—α嵌合抗体(CZ12)的细胞培养上清进行检测：结果：①瞬时转染后，细胞系经RT—PCR检测有人—鼠嵌合抗体mRNA的转录：②ELISA和Western blot检测表明，CZ12与TNF—α产牛特异性反应，并识别相对分子质量(Mr)为17000的TNF—α。③竞争抑制实验中，CZ12能竞争抑制Z12与rTNF—α的特异惟结合，④体外中和实验汪实，CZ12能中和TNF—α对L929细胞的毒性。结论：成功地研制具有中和活性的人—鼠嵌合抗体CZ12。