抗弓形虫重组SAG1抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗弓形虫SAG1单克隆抗体（McAb）. 方法将pET32（a）-trSAG1重组质粒转化Escherichia coli BL21（DE3）,用0.1 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA一步法纯化,以纯化的rSAG1为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,Western blot分析其特异性. 结果筛选出能稳定分泌抗rSAG1单克隆抗体的5株杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1, 轻链均为κ链;Western blot 分析显示,5株单抗均能与弓形虫速殖子超声抗原中的天然SAG1发生特异性结合. 结论制备的抗rSAG1杂交瘤细胞株能分泌识别SAG1的高特异性单抗,为进一步研究其在弓形虫病免疫诊断中的应用奠定了基础.     

抗日本血吸虫重组蛋白20.8kDa抗原单克隆抗体的建株

以日本血吸虫重组蛋白 2 0 .8k Da抗原免疫 BAL B/ c小鼠 ,制备单克隆抗体。每鼠注入蛋白 10 0μg,共免疫 3次 ,第1次加福氏完全佐剂 ,第 2、 3次加福氏不完全佐剂 ,间隔 3wk。融合前 ,于免疫的 BAL B/ c小鼠尾静脉注射 5 0 μg血吸虫重组蛋白 2 0 .8k Da抗原 ,4 d后取脾脏与骨髓瘤细胞 SP2 / O融合 ,11d后检测 ,融合率为 13.5 4 % (2 6 / 192 )。EL ISA检测培养上清 ,筛选阳性孔 ,经 3次克隆 ,获得 6株阳性杂交瘤细胞株。将这 6株细胞上清浓缩 10倍 ,用琼脂双扩散法测得免疫球蛋白亚类为 Ig G1 4株 ,Ig M2株。将 6株细胞扩增后注…     

血吸虫虫卵主要抗原P38分子的研究进展

P38是血吸虫虫卵的主要抗原，其重要性越来越受到人们的重视。本概述了P38诱导的细胞免疫、体液免疫、肉芽肿形成及其表位鉴定了分子克隆方面的研究进展。     

抗弓形虫重组SAG1抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗弓形虫SAG1单克隆抗体(McAb)。方法将pET32(a)-trSAG1重组质粒转化EscherichiacoliBL21(DE3),用0.1mmol/LIPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA一步法纯化,以纯化的rSAG1为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,Western blot分析其特异性。结果筛选出能稳定分泌抗rSAG1单克隆抗体的5株杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1,轻链均为κ链;Western blot分析显示,5株单抗均能与弓形虫速殖子超声抗原中的天然SAG1发生特异性结合。结论制备的抗rSAG1杂交瘤细胞株能分泌识别SAG1的高特异性单抗,为进一步研究其在弓形虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。     

日本血吸虫可溶性虫卵抗原38kDa分子的纯化及诊断价值的初步评估

[目的 ]探讨日本血吸虫虫卵可溶性抗原 (SEA) 38k Da分子诊断血吸虫病的应用价值。 [方法 ]用 SDS-PAGE配合电渗洗脱技术分离纯化了诊断靶抗原 SEA38k Da,并经 SDS- PAGE和 Western blot鉴定 ;将 SEA38k Da分子和 SEA用于 EL ISA法检测日本血吸虫病患者血清 ,急性期 31例、慢性期 31例 ,正常人 6 0例 ,华支睾吸虫病患者血清 30例 ,并殖吸虫病患者血清 30例。 [结果 ]SEA38k Da分子抗原和 SEA所测得的阳性率分别为90 .3%、90 .3%、1.7%、0、0和 90 .3%、83.9%、3.3%、0、0。将 SEA 38k Da分子和 SEA在 EL ISA中的 P/N比值进行比较 ,经 t检验 ,发现在检测急性血吸虫病患者 ,慢性血吸虫病患者和正常人血清时 ,两者间的 P/N比值在 3组间差异均有显著性意义 (P值均 <0 .0 0 1) ;SEA 38k Da分子在检测患者血清时的 P/N比值显著高于 SEA,而检测正常人血清时的 P/N比值显著低于 SEA。 [结论 ]纯化 SEA38k Da具有较好的敏感性和特异性 ,具有诊断潜能     

日本血吸虫成虫38kDa天然分子抗原的分离纯化与免疫保护性的研究

目的研究日本血吸虫成虫可溶性抗原38kDa（SjAWA38kDa）的动物保护作用，并对SjAWA38kDa作为抗日本血吸虫病分子疫苗的可行性进行评估。方法用SDS-PAGE电泳、切胶、电洗脱、超滤等方法分离纯化SjAWA38kDa．继而用SjAWA38kDa免疫昆明小鼠，然后进行尾蚴攻击感染（40尾／只），进行减虫率和减卵率研究。结果SjAWA38kDa天然蛋白质分子能刺激机体产生抗日本血吸虫的作用，其减虫率为33．8％，减卵率为51．7％，有统计学意义（P〈0．05）。结论SjAWA38kDa分子抗原具有刺激机体产生抗日本血吸虫病的免疫保护作用，可以作为抗日本血吸虫病分子疫苗研究的靶标。     

抗日本血吸虫蛋白质“靶抗原”单克隆抗体的研究

在成功地抽提出国际公认在诱导血吸虫保护性免疫力上起重要作用的24-26kD和90kD蛋白质“靶抗原”的基础上,进一步应用上述抗原免疫小鼠,经融合试验及克隆化获得分泌抗日本血吸虫蛋白质“靶抗原”单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞29株,其中IgG类16株(IgG_1 7株,IgG_(2a) 5株,IgG_(2b) 1株,IgG_3 3株),IgM 13株。以后,又从McAb的定位研究、McAb体外ADCC对血吸虫童虫的杀伤效应、McAb在不同血吸虫抗原中的识别位点(抗原结合位)等方面,对报获的McAb进行了研究。     

抗日本血吸虫卵单克隆抗体的制备和免疫化学的鉴定

用可溶性日本血吸虫卵抗原(SEA)免疫小鼠制备单克隆抗体,获得5株特异的抗日本血吸虫卵单抗。免疫球蛋白亚类鉴定均为IgG_1。免疫印迹法结果表明其所识别的日本血吸虫卵抗原的分子量分别为>200kDa、116kDa和22kDa。经两维免疫印迹法(2-Dimensional Western Blot),显示被单抗IE1识别的22kDa SEA等电点pI4.6—6之间至少有3个以上同晶型体(isomorphs)。放射免疫沉淀试验表明IE1可识别30kDa抗原。     

日本血吸虫重组抗原的免疫原性鉴定

为发展新的日本血吸虫病疫苗候选抗原分子，对已构建的阳性表达克隆PGsj24进行大量诱导表达，制备为20kD的重组抗原。以之免疫家兔，产生了较强的抗体反应。该单特导抗血清可识别成上天然蛋白中与重组蛋白相对应的抗原成分。两者分子量及Westernblot识别反应带型均基本一致，说明约20kD重组蛋白确为日本血吸虫基因编码产物，具有较强的免疫原性，可刺激机体产生较强的免疫应答。     

抗弓形虫表膜抗原P30单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗弓形虫主要表膜抗原P30单克隆抗体并进行鉴定,进而为弓形虫病诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的制备等提供可靠依据。用弓形虫速殖子膜蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选出能够稳定分泌高滴度抗P30单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并测定单克隆抗体免疫球蛋白亚类和抗体效价,用IFAT进行单抗识别的抗原定位,并通过SDS-PAGE和Western-Blot分析鉴定。结果获得了两株抗P30抗原的杂交瘤细胞株E3和G2,其分泌的抗体与肺孢子虫、隐孢子虫等抗原均不发生交叉反应。2株单抗均属IgG1亚类,且识别的抗原定位于速殖子表膜。结果表明,制备的抗P30抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和特异性的单克隆抗体。     

抗日本血吸虫SEA鸡卵黄抗体的制备与鉴定

目的 制备特异性抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）的鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）并检测其特异性、敏感性。 方法 用日本血吸虫SEA经翅膀下静脉和皮下免疫25周龄海兰母鸡4次（首次剂量为60 μg/只，加强剂量为30 μg/只），每次间隔10 d。取免疫前和首次免疫后35 d的鸡蛋卵黄，分别用水稀释法提取IgY，BCA法测定蛋白含量，并进行十二烷基磺酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析，ELISA检测纯化后IgY特异性和敏感性。分别提取免疫后不同时间的卵黄抗体，观察抗体效价的变化。 结果 海兰母鸡经SEA首次免疫后35 d，每枚蛋经提纯后可得到约61 mg抗体，经SDS-PAGE和Western blotting分析，纯化的IgY有1条主要蛋白带，相对分子质量（Mr）为130 000，并可被SEA识别。母鸡初次免疫后第10天，经SDS-PAGE和ELISA分析，鸡蛋卵黄内即有抗体产生，初次免疫后31 d效价可达1∶1 600。双抗体夹心ELISA结果显示纯化后的IgY有较高的敏感性，可检测到的SEA达2.4 ng/ml。 结论 制备的抗SEA鸡卵黄抗体的特异性和敏感性均较高。     

日本血吸虫可溶性虫卵抗原经两种免疫途径获得的鸡卵黄抗体IgY动态观察

目的对比两种免疫途径产生抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的特异性IgY抗体水平动态变化。方法7只新西兰兔感染日本血吸虫尾蚴(1500/只)42d后解剖收集虫卵,制备SEA。将SEA分别经皮下和静脉注射免疫健康海蓝蛋鸡(3只/组),首次和第2次免疫间隔2周,之后每次间隔4周,共免疫5次,50μg/(只·次)。取两组免疫前,以及首次免疫后2～18周生产的鸡蛋,用水稀释法粗提IgY,ELISA检测每2周IgY的动态变化。IgY纯化试剂盒(EGGstract IgY Purifiction System)纯化静脉组首次免疫后8～18周的IgY,紫外吸收法检测抗体浓度,琼脂糖双扩散法和ELISA检测IgY峰值水平的抗体效价,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析比较免疫前后抗体特异性。结果静脉组和皮下组分别在首次免疫后8和12周IgY抗体水平达高峰,A492值分别为1.28和0.78,静脉组IgY水平至18周仍维持较高水平,皮下组抗体水平达到峰值后逐渐下降。纯化后IgY浓度约为6.5～9.0mg/ml,琼脂糖双扩散法和ELISA测得静脉注射组峰值水平抗体效价分别为1∶16和1∶51200。经SDS-PAGE和Western blotting分析,纯化后的IgY在相对分子质量(Mr)25000和68000处各有一条清晰条带,且免疫后IgY可与SEA发生特异性反应。结论静脉注射法比皮下注射法能获得更高水平的鸡抗日本血吸虫SEA特异性IgY抗体,且纯化后的IgY抗体具有较好的特异性。     

日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa重组抗原对小鼠免疫保护性的初步研究

目的：为研究日本血吸虫（中国大陆株）22．6kDa抗原的免疫保护性。方法：将其编码cDNA经PCR扩增后亚克隆入载体质粒PGEX—1λt进行表达，并用重组抗原免疫了一批昆明鼠。结果：与对照组相比，重组抗原免疫小鼠获得了38．93％的减虫率。结论：证明重组的日本血吸虫22．6kDa抗原可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力。     

基于A1E3及B1C4单克隆抗体检测日本血吸虫循环抗原ELISA法的建立及现场初步应用

目的 目的 建立基于A1E3及B1C4单克隆抗体检测日本血吸虫循环抗原的夹心酶联免疫吸附试验 （ELISA）, 并对其 应用情况进行初步评价。 方法 方法 采用十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS?PAGE） 和免疫印迹试验 （Western blot? ting） 对A1E3及B1C4单克隆抗体进行特性分析, 用ELISA 法测定B1C4、 A1E3单克隆抗体效价。采用棋盘格滴定法确定双 单抗夹心ELISA法检测循环抗原的最佳工作浓度。在最佳条件下, 分别检测20份急性血吸虫病病人血清、 46份慢性血吸 虫病病人血清及20份正常人血清, 评价其检测敏感性和特异性。用建立的双单抗夹心ELISA法和市售检测血吸虫循环抗 原的ELISA试剂盒检测湖北省江陵县IHA阳性血吸虫病病人血清72份, 以评估双单抗夹心ELISA法的检测效能。 结果 结果 经SDS?PAGE和Western blotting分析, 纯化后的A1E3及B1C4在相对分子质量 （Mr ） 88 000和52 000处各有一条清晰重链, 在Mr 20 000处有一条相同的轻链, 且A1E3及B1C4可与可溶性虫卵抗原 （SEA） 及急性血吸虫病病人血清发生特异性反 应。B1C4单抗效价可达1∶105 , A1E3单抗效价可达1∶30 000。用B1C4、 A1E3双单抗夹心ELISA法检测急、 慢性血吸虫病 病人血清阳性率分别为100%和86.9%, 检测20份正常人血清特异性为100%。双单抗夹心ELISA法及市售ELISA试剂盒 检测日本血吸虫循环抗原阳性率分别为45.8%及43.1%。 结论 结论 成功建立了基于A1E3及B1C4双单抗夹心ELISA法, 该 法检测日本血吸虫循环抗原具有较高的敏感性及特异性。     

组合单克隆抗体多表位检测日本血吸虫循环抗原的研究

目的探讨抗肠相关抗原单克隆抗体（单抗）JPG5和抗虫卵可溶性抗原单抗JPS6、JPG5＋JPG1组合和JPS6＋JPG1组合对血吸虫循环抗原（CAg）的诊断效能。方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）对慢性血吸虫病、急性血吸虫病、晚期血吸虫病、卫氏并殖吸虫病、华支睾吸虫病、乙型肝炎患者血清,以及治疗前、治疗后半年、治疗后1年的慢性血吸虫病疗效考核血清进行CAg单位点和多位点检测。结果JPG5检测慢性血吸虫病患者的敏感性和特异性分别为74.3%和96.8%,JPS6分别为78.7%和95.3%;两株单抗与卫氏并殖吸虫病、华支睾吸虫病及乙型肝炎患者血清的交叉反应率分别为15.2%、15.6%、3.2%和21.5%、15.6%、16.0%。JPG5检测治疗后1年的慢性血吸虫病患者血清CAg阴转率高于JPS6。JPG5＋JPG1组合检测慢性血吸虫病患者的敏感性和特异性分别为80.1%和93.7%,JPS6＋JPG1组合分别为73.5%和96.1%;两种组合与卫氏并殖吸虫病、华支睾吸虫病及乙型肝炎患者血清交叉反应率分别为21.5%、15.6%、18.0%和22.8%、15.6%、16.0%。两种组合多位点检测治疗后1年的慢性血吸虫病患者血清CAg阴转率分别为66．7％和45．5％。结论JPG5、JPS6可用作CAg检测的备选探针。JPG5＋JPG1组合与JPS6＋JPG1组合对CAg的诊断效能相近;较之单位点检测,多位点检测敏感性无明显提高。     

抗日本血吸虫循环抗原单链抗体的抗原定位和初步应用

目的　将获得的抗日本血吸虫循环抗原的单链抗体进行抗原定位和用于诊断。方法　用间接荧光抗体试验(IFA)对 2株可溶性单链抗体所针对的抗原进行定位 ;将可溶性单链抗体进行生物素标记后 ,用于检测急、慢性血吸虫病人血清标本。结果　两个特异性单链抗体分别于日本血吸虫成虫的肠管和生殖系统呈现明显的荧光反应。检测急性血吸虫病人血样 2 0份 ,慢性血吸虫病人血样 30份 ,正常人血样 2 0份。结果用其中 1株单链抗体检测急性病人的敏感度为 6 0 % ,慢性病人的敏感度为 36 7% ,特异度为 90 % ;以 2株单链抗体混合检测急性病人的敏感度为 75 % ,慢性病人的敏感度为 5 6 7% ,特异度为 85 %。结论　经抗体库技术制备的单链抗体可用作日本血吸虫病的诊断 ,单抗组合较单株单抗可提高免疫学检测的敏感性。     

抗日本血吸虫噬菌体抗体库的筛选和阳性克隆的鉴定

目的　研制抗日本血吸虫循环抗原SjMAg的单链抗体。　方法　用日本血吸虫成虫代谢抗原SjMAg包板,对已构建的抗日本血吸虫噬菌体抗体库进行3轮富集,然后用ELISA法从富集的次级抗体库中筛选阳性克隆,最后借助ELISA、SDSPAGE和Western印迹等方法,根据阳性克隆表达产物与其它4种吸虫抗原反应的情况,进行特异性鉴定。　结果　从随机挑取的72个克隆中筛选到阳性克隆6个,经交叉筛选和鉴定最终获得特异性抗日本血吸虫阳性克隆2个。　结论　用固相富集和ELISA筛选法可以从抗体库中有效地筛选到抗日本血吸虫循环抗原的阳性克隆,获得的抗体克隆可用于抗日本血吸虫循环抗原单链抗体的制备。     

日本血吸虫抗体检测试剂盒(IHA法)的研制与应用

目的 目的 研制日本血吸虫抗体检测试剂盒 （IHA法）。方法 方法 按 《药品生产质量管理规范》 要求, 研究日本血吸虫抗 体检测试剂盒 （IHA法） 组成成份、 制备方法及程序, 并对研制的试剂盒进行诊断效果评价。结果 结果 研制的日本血吸虫抗体 检测试剂盒 （IHA法） 检测慢性血吸虫病患者敏感性为94.49%, 检测健康人群特异性为97.14%, Youden指数为0.92; 与并殖 吸虫和旋毛虫病患者血清交叉反应率分别为15.00%和10.00%。与市售日本裂体吸虫抗体检测试剂盒 （ELISA法） 和日本 血吸虫抗体检测试剂盒 （IHA法） 平行检测流行区居民血吸虫抗体的总体符合率分别为93.06%和92.25%。结论 结论 日本血 吸虫抗体检测试剂盒 （IHA法） 敏感性高、 特异性强, 适合疫区现场血吸虫病筛查, 具有推广应用价值。     

日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因的克隆和鉴定

目的　从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因。　方法　用ABC ELISA法从日本血吸虫病流行区筛选出高水平抗血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体 15人 ,采集血清并混合。混合血清经Protein G柱吸收后 ,用于日本血吸虫成虫cDNA文库的免疫学筛选。PCR扩增阳性克隆插入cDNA片段。序列分析后 ,于该序列第一开读框两端设计引物并分别引入EcoRⅠ和NotⅠ位点 ,PCR扩增并纯化目的基因片段后克隆入质粒载体pGME T ,再亚克隆入表达载体pGEX 6p 1。经IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE和Westernblotting鉴定。　结果　阳性克隆插入片段约 12 0 0bp ,第一开读框长 5 0 7bp ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 3kDa。DNA序列分析显示 ,与已知序列同源性小于 4 0 %。重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B能高效表达融合蛋白 ,且能被日本血吸虫特异性IgE抗体识别。　结论　成功构建的重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B ,Sj4 3B可编码日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原