水稻冷诱导蛋白激酶基因CIPK07g 的克隆与表达分析

CIPK是一类Ca2+依赖的蛋白激酶超基因家族。对水稻中该基因家族成员之一CIPK07g进行克隆,并对其编码蛋白的信号肽、跨膜结构、结构功能域、时空表达特性和低温处理的表达特征进行分析。结果表明,CIPK07g基因c DNA全长1 891 bp,包含279 bp 5′UTR及259 bp 3′UTR,编码450个氨基酸组成的多肽链。该基因蛋白N端无信号肽,含跨膜结构域,为亲水蛋白,具有CIPK基因家族特有的保守结构域,在叶片中表达较高,低温刺激后24 h表达达到高峰。     

奶牛Cathelicidins Bac5基因的克隆、表达及抑菌活性分析

根据已发表的牛Bac5 mRNA序列设计1对特异性引物,进行RT-PCR扩增,将目的片段定向克隆到原核表达载体PET28a(+),构建原核重组表达质粒PET28a-Bac5,并转化大肠杆菌Rosetta,进行IPTG诱导和SDS-PAGE检测.结果表明:采用RT-PCR技术成功扩增出414bp去信号肽的Bac5基因片段,重组蛋白经ZPTG诱导和SDS-PAGE检测发现,在19ku附近有1条清晰蛋白条带,与理论预测值大小一致;对表达的Bac5重组蛋白(rBac5)处理后进行抑菌活性的初步鉴定结果表明,rBac5对大肠杆菌(CVCC1450)和金黄色葡萄球菌(CVCC545)2种标准菌株和乳房炎乳的3种常见分离菌株均有一定的抑菌活性.     

新疆荷斯坦牛β防御素5基因的克隆、表达及表达产物的抑菌活性

【目的】克隆和表达新疆荷斯坦牛中性粒细胞防御素5(BNBD5)基因,对BNBD5蛋白进行纯化并分析其抗菌活性。【方法】利用RT-PCR方法扩增新疆荷斯坦奶牛BNBD5的cDNA序列,将BNBD5 cDNA克隆到原核表达载体pGEX-4T-2,测序分析后转化大肠埃希菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析;利用GST亲和柱纯化BNBD5蛋白,并进行体外抑菌试验。【结果】通过PCR扩增获得了218bp的牛BNBD5全长cDNA序列,经IPTG诱导,获得了约33 ku的牛BNBD5蛋白。牛BNBD5蛋白在15~25℃培养时的可溶性较37℃时多,且大多以包涵体形式存在,经纯化后最终获得了少量的目的蛋白。纯化的BNBD5蛋白对标准金黄色葡萄球菌和标准大肠埃希菌均具有明显的抑菌活性。【结论】克隆、表达了牛BNBD5基因,表达的BNBD5蛋白对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌活性。     

罗曼鸡白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

应用RT-PCR技术从罗曼鸡脾淋巴细胞RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序。结果表明,获得了ChIL-18全序列,其大小为597 bp。将其成熟蛋白基因(510 bp)亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量为约46 kDa的融合蛋白,Western blot证实该融合蛋白可与鼠抗鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。用MTT法测定表明,重组蛋白能明显促进鸡T细胞转化的活性。     

新疆巴什拜羊ISG15基因的克隆表达及活性检测

克隆表达新疆巴什拜羊ISG15基因,并对其表达产物的活性进行检测。利用RT-PCR和RACE技术克隆了巴什拜羊ISG15基因的cDNA全长序列,将ISG15基因克隆至真核表达载体pPIC9K,经电击转化至GS115中并用甲醇进行诱导表达,用Ni2+螯合亲和层析法对表达的蛋白进行纯化,通过淋巴细胞转化试验来检测表达蛋白的活性。结果表明:克隆得到的巴什拜羊ISG15基因cDNA全长为646 bp,开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸。经酵母重组菌株GS115/pPIC9K-ISG15表达,SDS-PAGE结果显示表达的蛋白约为33 ku,表达的蛋白可用Ni2+螯合亲和层析方法纯化,淋巴细胞增殖试验结果显示,表达的ISG15蛋白能够显著地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05),表明表达的蛋白具有生物学活性。     

拟南芥蛋白激酶 SnRK2．6的原核表达、纯化及活性分析

从哥伦比亚生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana Columbia 0）中克隆 SnRK2·6[SNF1（su-crose non-fermenting-1）-related protein kinase 2·6]的完整编码序列（coding sequence,CDS）,构建该基因的原核表达载体,将其转化 BL21（DE3）,经表达纯化得到 SnRK2·6蛋白。激酶活性分析发现,原核表达纯化的 SnRK2·6有自磷酸化和磷酸化 MBP（myelin basin protein）的活性,为后续试验分析 SnRK2·6的功能奠定基础。     

水稻B-box锌指蛋白基因OsBBX26的 克隆及表达分析

[目的]克隆水稻B-box锌指蛋白基因(OsBBX26),并分析其在非生物胁迫下的表达模式,为探究水稻B-box蛋白的非生物胁迫响应机制提供理论依据.[方法]以水稻模式品种日本晴为材料,采用RT-PCR克隆OsBBX26基因,对其进行生物信息学分析,并通过构建pBA-OsBBX26-YFP植物表达载体进行亚细胞定位.同时,采用实时荧光定量PCR检测分析OsBBX26基因的组织特异性及非生物胁迫(干旱、ABA、低温和高盐)下的表达模式.[结果]克隆获得的OsBBX26基因(LOC_Os08g42440)cDNA全长序列为1467 bp,编码488个氨基酸,其编码蛋白分子量为51.86 kD,理论等电点(pI)为6.63,包含1个B-box锌指结构域和1个CCT结构域,其中B-box结构域位于第13~60位氨基酸,CCT结构域位于第435~478位氨基酸,该蛋白定位于细胞核中.OsBBX26基因位于8号染色体上,启动子区域除了含有TATA-Box和CAAT-Box等基本转录元件外,还含有与逆境相关的顺式作用元件,包括低温响应元件LTR、脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、厌氧响应元件ARE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,以及MYB转录因子结合位点.OsBBX26蛋白与粳稻B-box蛋白亲缘关系最近,其次与籼稻B-box蛋白亲缘关系较近,与其他植物B-box蛋白也存在较高的相似性,其中与小米、大麦、高粱、玉米和短柄草B-box蛋白的氨基酸序列相似性分别达72%、72%、71%、69%和68%.OsBBX26基因在幼叶中的表达量最高,其次是在成熟叶片中,在幼根、成熟根、茎和幼穗中的表达量均极低,表明该基因表达具有明显的组织表达特异性.干旱、高盐、ABA和低温胁迫处理下OsBBX26基因均上调表达,干旱、高盐和ABA胁迫处理12 h达峰值,但低温胁迫处理在24 h后才达峰值.[结论]OsBBX26基因受干旱、高盐、ABA和低温胁迫诱导均上调表达,推测其参与水稻植株响应多种非生物胁迫,在逆境响应中发挥重要调控作用.     

水稻乙醇酸氧化酶基因的克隆和表达分析

根据水稻数据库中乙醇酸氧化酶(GLO)基因的编码序列,设计引物,克隆了水稻OsGLO3基因的序列,该片段长1 104bp,编码367个氨基酸,含有11个外显子。荧光定量PCR结果表明:OsGLO4在不同水稻生育期中表达量差异较大,且OsGLO1和OsGLO4在生长发育后期表达量较高,OsGLO2和OsGLO5在生长发育前期表达量较高。     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

香蕉细菌性软腐病菌细胞壁降解酶pelD、pelE 基因的克隆表达及活性分析

细胞壁降解酶与植物病害症状有重要的相关性。根据已知软腐病细菌细胞壁降解酶基因序列,设计两对特异性引物,对香蕉细菌性软腐病菌进行PCR克隆,获得具有完整阅读框的基因pelD、pelE序列。通过构建重组表达载体pET28b(+)-pelD和pET28b(+)-pelE,重组表达载体转化子在IPTG诱导下,经SDSPAG分析,获得了pelD和pelE的表达蛋白。将两种表达蛋白接种于7~8片叶的粉蕉假茎和离体叶片上,发现接种pelE表达蛋白的粉蕉假茎和叶片出现了腐烂症状,但接种pelD表达蛋白没有引起发病症状。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白pilA基因的克隆与表达

[目的]克隆和表达副猪嗜血杆菌菌毛蛋白pilA基因。[方法]对已发表的HPS的pilA序列进行分析,合成引物,并以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS的pilA编码基因,获得目的基因片段;构建重组表达质粒,经IPTG诱导表达至大肠杆菌BI21（DE3）中,进行SDS-PAGE与Western blot检测。[结果]表达的重组蛋白分子质量与预期的43 kD一致。[结论]该研究为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

凡纳滨对虾eIF5A基因的克隆及表达分析

真核细胞翻译起始因子5A(eIF5A)是真核生物细胞内的蛋白质翻译起始因子.近年来的研究发现eIF5A在动植物细胞衰老死亡、环境胁迫应答和免疫应答等过程中起着重要的调控作用.通过对凡纳滨对虾cDNA文库进行测序,首次获得了包含eIF5A完整的氨基酸序列的cDNA.该cDNA包含474 bp的开放阅读框,编码157个氨基酸,预测分子量约为17.257 ku,理论等电点为5.06.凡纳滨对虾eIF5A和其他物种对比结果显示,该基因的氨基酸序列和其他物种有较高的同源性.实时定量RT-PCR结果显示,eIF5A基因在凡纳滨对虾不同组织中的mRNA表达没有明显的差异.对WSSV、TSV和IHHNV感染的凡纳滨对虾的肝胰腺的实时定量RT-PCR结果显示,病毒感染的凡纳滨对虾的eIF5A基因的表达明显增加,分别是对照样品表达量的2.2、2.5和1.6倍,表明eIF5A可能涉及凡纳滨对虾的抗病毒免疫应答.     

纳豆激酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

该文采用PCR方法扩增获得了纳豆激酶基因(pro-NK),通过酶切与酶连反应使其与原核表达载体Pet32a相连,构建重组质粒Pet32a-pro-NK,先转入到大肠杆菌DH5α中进行筛选与验证,再将阳性克隆子转化到宿主菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行纳豆激酶蛋白的表达研究。SDS-PAGE电泳分析结果表明,纳豆激酶蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达。     

水稻产量性状定位与基因克隆研究进展

文中主要从性状定位和基因克隆方面对产量构成三因子,即分蘖、穗粒数和粒重的研究成果进行了综述,并同时详细阐述了影响产量的其他因素,包括株高和杂种优势等的研究进展,并在最后就影响单株产量的分子基础、激素与产量的关系、水稻产量性状的定位策略3个方面对这些研究成果进行了总结和讨论。     

重组融合蛋白最佳诱导表达条件的研究

[目的]对重组融合蛋白的最佳诱导表达条件进行研究。[方法]为提高IMPACT-CN系统的pTYB11载体重组融合蛋白的表达量,针对其表达所需适宜的诱导时机、诱导剂量、诱导时间、诱导温度、氨苄青霉素浓度、摇瓶装液量等培养条件,采用不同技术指标进行了平行发酵试验。[结果]表达产物的SDS-PAGE及Western-Blotting分析表明重组融合蛋白具有良好免疫原性。[结论]为以后的蛋白纯化诊断、用蛋白质生产诊断试剂盒及其临床应用奠定了基础。     

水稻蛋白质改良的研究进展

目前,稻米蛋白质含量低、营养不够全面,满足不了人们对营养的需求。综述了水稻蛋白质改良的研究现状,以及传统育种方法和细胞工程方法在水稻蛋白质改良上的应用,并对今后的研究方向提出建议。     

鸭病毒性肝炎病毒VP3基因的克隆与表达

提取鸭肝炎病毒RNA作为模板,进行RT-PCR扩增,得到723 bp的VP3基因,将纯化的VP3基因片段与pMD18-T载体进行连接,构建DHVVP3基因克隆重组质粒。然后定向插入到pET-32a(+)表达载体,筛选获得原核表达载体pET-32a-VP3。用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,VP3蛋白得到正确表达,其分子量为47.1 ku,表达的蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应。     

枇杷果实蔗糖磷酸合酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据GenBank中已登录的多种植物的蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,从枇杷果实中扩增出该基因的cDNA片段并测序,分别为386 bp和383 bp。序列分析表明,枇杷果实蔗糖磷酸合成酶基因与桃果实蔗糖磷酸合成酶基因相似性达91%。半定量RT-PCR分析表明,该基因在枇杷果实生长发育过程中的表达量逐渐增加。所得基因片段已在GenBank中注册,386 bp和383 bp登记号分别为HM122759和HM146926。     

稻瘟病抗病基因定位及克隆研究进展

稻瘟病是水稻生产中最严重的真菌病害,严重影响着水稻的产量。随着DNA分子标记的不断发展及水稻基因组测序的完成,稻瘟病抗病基因的定位克隆取得了突破性的进展,为稻瘟病抗病机理研究以及稻瘟病抗性育种奠定了重要基础。本文综述了稻瘟病抗病基因定位及克隆的研究进展,对稻瘟病抗病基因的研究成果在实践中的应用提出了展望。     

白菜型油菜中WRKY基因的克隆与表达(英文)

[目的]为研究WRKY转录因子在ABA诱导下的表达调控。[方法]首先利用同源克隆法在白菜型油菜中克隆WRKY基因和Actin基因片段,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析;通过荧光定量PCR技术检测白菜型油菜WRKY基因在ABA处理条件下的相对表达趋势;然后利用相对定量PCR技术(real-timerelative quantificationPCR,以下简称RT-qPCR)检测WRKY基因在ABA(100μmol/L)诱导不同时段的差异表达。[结果]在白菜型油菜中克隆到一段长度为680bp的WRKY基因片段和一段长度为933bp的β-actin基因片段。RT-qPCR实验结果表明,BcWRKY能被ABA诱导表达,且在诱导1h后表达量最高。[结论]成功地克隆了白菜型油菜的WRKY转录因子基因和Actin基因片段,并证明了白菜型油菜WRKY基因的表达受ABA的影响。