大豆主要过敏原Gly m Bd 28K基因的克隆表达、纯化及多抗血清的制备

RT-PCR克隆大豆主要过敏原Gly m Bd 28K基因,根据序列设计引物,扩增目的基因的开放阅读框,与MBP载体连接,测序鉴定,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,并用IPTG诱导表达.亲和层析法纯化重组蛋白,SDS-PAGE验证蛋白的纯度,免疫新西兰大白兔,收集多抗血清,用ELISA法测效价.扩增出含Gly m Bd 28K目的基因片段,诱导并获得高浓度和预期相符的表达产物,经层析纯化出Gly m Bd 28K蛋白,免疫新西兰大白兔,获得效价为1∶1.6×106多抗血清.     

鼠CCL5蛋白的原核表达与纯化

趋化因子(CCL5)是由正常T细胞分泌的典型的具有趋化活性的细胞因子,分子量8kD,属于CC型趋化因子的β家族成员之一,并调控T淋巴细胞的活性和分泌能力.本研究旨在克隆小鼠趋化因子CCL5基因并在原核表达系统中实现表达,获得与His标签融合的重组趋化因子mCCL5蛋白,并测定其在体外的趋化活性.将趋化因子CCL5基因扩增并插入pET-28a原核表达载体,转化至Rosetta感受态细胞中.重组mCCL5蛋白以IPTG诱导表达,再以Ni-NTA纯化系统进行纯化.Transwell实验检测重组CCL5蛋白的趋化活性.结果显示pET-28a-mCCL5原核表达载体成功构建,mCCL5蛋白在细菌中大量表达并主要以包涵体的形式存在.表达产物以SDS-PAGE和免疫印迹鉴定,Transwell实验证实趋化因子能够显著促进巨噬细胞RAW264.7细胞的迁移.带有His标签重组鼠趋化因子CCL5的成功表达,为下一步CCL5抑制剂的筛选奠定基础.     

水解超高产大豆“中黄35”功能性蛋白的制备

以新疆超高产大豆"中黄35"品种为研究对象,采取传统提取、酶单因素实验和双酶解法等多种方法制备大豆的功能性蛋白,并对其SDS-PAGE电泳、溶解曲线、氮溶指数和浊度等基本性质进行了初步分析。实验结果表明"中黄35号"大豆蛋白的提取最优条件是:豆水比(g:mL)为1∶13,pH值为8,提取时间为2 h。酸性蛋白酶水解大豆蛋白的最适合工艺条件为:初始pH值为3.5,温度为45℃,酶用量为6%,固液比为1∶8,水解时间为8 h。采用SDS-PAGE电泳分离出2条酸性蛋白条带,其相对分子质量分别在95 kD和60 kD左右。     

sCAR-PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白(PPA)的亚基B(PPAb)的融合蛋白,将PPAb基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42 kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad-EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

sCAR—PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白（PPA）的亚基B（PPAb）的融合蛋白,将PPA6基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后荻得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。N时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad—EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

重组猪IFNα的构建及原核可溶性表达研究

使用原核表达系统可溶性表达猪α-干扰素,并进行纯化和鉴定。根据Gene Bank中报道的猪α-干扰素成熟肽基因序列设计引物,以猪肝脏细胞基因组DNA为模板,用PCR方法扩增猪α-干扰素成熟肽基因,并将其定向克隆到原核表达载体pET32a+中,转化大肠杆菌DH5a。阳性克隆经PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE分析、镍柱亲和层析纯化、Western-blot鉴定。结果表明:成功构建了猪α-干扰素原核表达载体pET32a+-poIFN-α;表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约3.8×104的位置出现了目的蛋白条带,与预期相符;Western-blot鉴定显示有特异性条带出现。实现了重组猪α-干扰素的可溶性表达,获得了纯度较高的重组猪α-干扰素,为进一步研究其药物作用奠定了基础。     

家蚕MBP-Bmlp7蛋白的克隆表达及免疫学鉴定

克隆表达家蚕蚕蛹30 kD(1 kD=1 u)脂蛋白家族成员Bmlp7(Bombyx mori lipoprotein 7)的融合蛋白,鉴定其致敏原性.合成Bmlp7的基因后连接至载体质粒p MAL-C5e上,在大肠杆菌BL21中诱导表达出麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)-Bmlp7,纯化后,利用Western blot鉴定MBP-Bmlp7融合蛋白与家蚕过敏患者血清中特异性免疫球蛋白E(immunoglobulins E,Ig E)的结合能力.结果显示,纯化得到了纯度较高的MBP-Bmlp7融合蛋白,且该融合蛋白能够与家蚕过敏患者血清特异性IgE结合,说明Bmlp7是家蚕中一种潜在的致敏原.     

人热激蛋白27基因的克隆表达及鉴定

用PCR技术扩增了人热激蛋白27(Hsp27)基因,构建了原核表达载体pGEX-4T-1-Hsp27。经IPTG诱导表达了带有GST标签的重组人Hsp27,SDS-PAGE鉴定显示该重组蛋白的分子量为44 kD。利用谷胱甘肽-琼脂糖树脂亲和层析纯化了该重组蛋白,经串联质谱检测证明了该重组蛋白为人Hsp27。本研究为制备Hsp27抗体及进行Hsp27的功能研究奠定了基础。     

牦牛乳中主要过敏原研究

为分析牦牛乳中主要的过敏原,腹腔注射牦牛乳蛋白质免疫Balb／C小鼠．未次免疫后,小鼠摘眼球取血,测定特异性抗体和组胺质量浓度．在无菌条件下收集并培养脾淋巴细胞．Western-Blotting方法分析牦牛脱脂乳中主要过敏原组分．结果显示,牦牛脱脂乳中主要的过敏原组分为β-乳球蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白,这3种过敏原蛋白质致敏强度的大小为β-乳球蛋白>α-酪蛋白>β-酪蛋白．因为脾淋巴细胞产生的细胞素IL-4、IL-5质量浓度较高而IFN-γ较低,所以牦牛乳蛋白质为Th2应答．     

pPIC3．5K／Thanatin-（G8S2）-PPA毕赤酵母表达载体的构建和表达

将掌叶半夏凝集素和死亡素的融合基因thanatin-linker-ppa定向连接到pPIC3．5K,构建酵母表达载体pPIC3．5K／Thanatin-（G8S2）-PPA并进行序列分析,经SalI单酶切线性化后电转化到GSll5毕赤酵母感受态细胞中,PCR鉴定后在含有G418抗性的YPD平板筛选高拷贝重组子。利用甲醇在BMMY培养基中诱导表达融合蛋白,经SDS-PAGE和Westernbloting分析显示获得分子量约31kD的融合蛋白,融合蛋白经纯化后MTT分析其抗肿瘤活性,结果显示融合蛋白具有显著的抗肿瘤效果。     

基因工程重组酵母植酸酶性质研究

对基因工程重组酵母所产的植酸酶进行分离和纯化 ,并考察纯化酶的酶学性质。该植酸酶酶蛋白分子量为 85 .2kD ;有 2个pH活力峰 :pH 2 .0和 pH 5 .0 ;最适温度为 5 0℃ ;在 3 7℃下以植酸钠为底物的反应初速度为 3 3 .5 μmol/(min·mL) ,米氏常数Km 为 0 .71mmol/L ;Ca2 +对此酶有较强的激活作用 ,Zn2 +、Fe2 +、Cu2 +、Al3+和Fe2 +对其有较强的抑制作用 ,而K+、Na+和Mg2 +对酶活性影响不大。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....     

Separation and purification of proteinases from Gastric Mucosa of Northern Sheatfish,Silurus soldatovi

The separation and purification method for pepsin of Northern Sheatfish (Silurus soldatovi) was established by using the combination technology of salting-out,gel chromatography and gel electrophoresis,and the enzymic properties were also analyzed.The experimental results indicated that 28% and 56% (NH4)2SO4 saturation could separate the activated protease from the pepsin extract of gastric mucosa of Sheatfish (Silurus soldatovi) ;compared with the homogenate extraction,the pepsin specific activity of purified extraction by Sephadex G-75 gel chromatography system increased 598 fold,was 5 times higher than that of activated liquid,and the total production rate was 10.1%.The purified pepsin liquor at the conditions of pH3.3 0.01 M alanine-formic acid buffering solution,60 cm chromatography column,and the flowing rate of 0.8 ML/min was analyzed by SDS-PAGE,which indicated that there were two bands and the molecular weight was 34.0 kDa and 40.4 kDa,respectively.There were two peaks in the enzyme activity determination of the separated collecting liquor in gel chromatography,and the SDS-PAGE showed the concentrations of the two proteins was different,which indicated that it existed at least two pepsins in the gastric mucosa of Sheatfish (Silurus soldatovi).     

广西大瑶山砂岩峰林地貌特征及形成演化过程

广西大瑶山砂岩峰林地貌分布于大瑶山西部的莲花山和圣堂山一带,面积180 km2,由下泥盆统莲花山组紫红色砂岩形成。砂岩峰林位于海拔千米山体上部,边缘为高耸的崖壁;峰林由数以千计的石峰、石柱、垂直崖壁、凹槽组成,主要形态为柱状和锥柱状,是一处与湖南张家界相似,但成岩时代更老的砂岩峰林地貌区。峰林地貌由泥盆纪台地演化而来,经历了台地方山、嶂谷、峰丛、峰林等发展演化阶段,现处于幼年至壮年期。     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.     

肝片吸虫18.6kD蛋白抗原双向电泳及免疫印迹分析

从分子水平上研究了肝片吸虫的抗原组分，用制备性SDS－PAGE纯化ES18．6kD蛋白抗原，并用它成功制备了单因子兔抗血清，用这种抗血清来分析肝片吸虫各部分抗原，证实各部分抗原的18．6kD多肽具有相同的抗原决定簇，而且这种抗原决策簇不存在于其它分子量的多肽中，体抗原（BA）和分泌排泄抗原（ES）的双向电泳（Two-dimention Electrophoresis,2-D)分析研究表明，肝片吸虫同一种分子量的蛋白质大多由多种等电点不同的多肽组成，同时也显示了体抗原和分泌一排泄抗原分子量相同的蛋白质所包含的多肽数量和性质是有差异的。     

酶反应产物中人参稀有皂苷F2与C-Mc的分离

原人参二醇类皂苷混合物经人参皂苷酶生物转化后可生成F2、C-Mc等7~10种稀有人参皂苷。天然人参中不含人参皂苷C-Mc,且F2的含量极低。在生物转化所得的人参二醇类皂苷酶反应产物中,分离纯化得到稀有人参皂苷F2与C-Mc,并进行HPLC检测。反应后得到粗产品40g,经脱糖脱色和硅胶柱分离后,成功得到稀有人参皂苷F23.49g,纯度为98.2%,得率8.72%;得到C-Mc 0.70g,纯度为82.2%,得率为1.80%。成功分离出了F2和C-Mc制品,建立了初步的分离制备方法。     

牦牛乳中主要过敏原的分离纯化

为研究牦牛乳蛋白质的过敏性,用化学方法分离牦牛乳中主要的过敏原蛋白质,采用快速蛋白纯化系统(FPLC)结合凝胶层析技术对分离出的蛋白质进行纯化．在牦牛脱脂乳中添加10％醋酸至酪蛋白的等电点pH46,使酪蛋白和乳清蛋白分离．根据酪蛋白在尿素溶液中的溶解度和对钙的敏感性不同,对酪蛋白进行粗分级,得到αs酪蛋白和β酪蛋白．应用离子交换色谱和葡聚凝胶sephadex G100进一步纯化粗分级得到的酪蛋白,得到αscasein和β酪蛋白．以柠檬酸钠为螯合剂、在低pH并有盐存在的条件下从酸乳清中分离出β乳球蛋白,FPLC纯化后用RPHPLC检测其纯度,得到αscasein和β酪蛋白纯度分别为8713％和8858％,β乳球蛋白的纯度为8000％．     

自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体的纯化与检测

为了提纯并鉴定自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体,探讨其在部分组织中的免疫定位．首先合成带谷胱甘肽转移酶标签的自噬基因融合蛋白,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗体浓度,最后用免疫亲和纯化方法提纯抗血清中的多克隆抗体,酶联免疫吸附法检测抗体效价,蛋白印迹检测抗体特异性及在组织中的表达情况．结果表明：制备得到自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其质量浓度为每10μL含5μg,用酶联免疫吸附法显示此抗体效价及特异性较高,蛋白印迹显示蛋白大小为55kD左右．