人肥胖基因在大肠杆菌中的表达

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5’端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为：16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45％以上。表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

人高血压相关基因(HRG-1)编码蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

为了研究一个新的人高血压相关基因HRG－1的编码蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性,使用PCR的方法扩增人HRG－1基因ORF的编码序列,构建了原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达及进行体外活性鉴定,实验结果证明得到了具有生物学活性的人HRG－1原核表达蛋白,且人HRG－1原核表达蛋白具有真核表达蛋白一致的生物学活性。     

制备性SDS—PAGE纯化大肠杆菌表达的重组人VEGF

在利用基因工程方法实现大肠杆菌表达外源重组人ＶＥＧＦ的基础上，应用制备性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ从包涵体中分离纯化了这一因子。纯化蛋白在含有氧化型与还原型谷胱甘肽和肝素的缓冲液中复性，复性后的ＶＥＧＦ蛋白成为同源双体，经Ｍｉｌｅｓ方法检测，证明可提高血管通透性，具有生物活性。这一研究为制备具有生物活性的重组人ＶＥＧＦ蛋白，从而开展有关其生理与病理意义的研究奠定了基础。     

靛蓝色素酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

将来源于Ralstonia eutropha磁中的靛蓝色素酶基因IDG与从棉花基因组DNA中克隆到的棉纤维特异启动子PTL12相连构建了真核表达载体。该表达载体中包含靛蓝色素酶基因的原核启动子，它能在大肠杆菌中启动靛蓝色素酶基因的表达。     

重组人胶原蛋白多肽工程菌的表达条件的优化

通过对工程菌培养条件进行优化,结果表明最佳的表达条件：接种量4％和50／0,37X2,200r／min,培养至OD600为0．7时,向培养基中加入0．5mol／L IPTG培养5h。     

人血小板生成素（hTPO）的cDNA克隆与序列测定

由于人血小板生成素ｃＤＮＡ的阅读框架较长而且序列中无合适的酶切位点，因此，我们利用一个同义突变创造的ＫｐｎＩ酶切位点人为将ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ分成Ｎ－端和Ｃ－端两个片段。首先利用反转录聚合酶链式反应从人胎肝ｍＲＮＡ中分别扩增出两个ｃＤＮＡ片段，于ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ位点分别克隆入测序载体ｐＵＣ１９中。     

位点特异性重组酶Cre的克隆、表达、纯化及体外活性鉴定

克隆了Cre基因，分别构建了真核表达载体pEF-EBFP-Cre和pGEX-Cre，在大肠杆菌中表达了Cre重组酶，并证明了重组酶的删除特性，为进一步在转基因动物乳腺生物反应器中使用此酶打下基础。     

Antibacterial Mechanism of Copper-bearing Antibacterial Stainless Steel against E.Coli

A preliminary study was made on the antibacterial mechanism of copper-bearing antibacterial stainless steels against E.coli through experiments of microbiology such as EDTA （ethylenediaminetetraacetic acid） complexing, DNA smearing and AFM （atomic force microscope） observation. It was measured that the antibacterial stainless steels showed excellent antibacterial functions with antibacterial rate to E.coli over 99.99%. The antibacterial rate was weak if the bacteria solution was complexed by EDTA, indicating that the copper ions play a dominant role in the antibacterial effect of the antibacterial stainless steels. The electrophoresis experiment did not show the phenomenon of DNA smearing for E.coli after contacting antibacterial stainless steels, which meant that DNA of E.coli was not obviously damaged. It was observed by AFM that the morphology of E.coli changed a lot after contacting antibacterial stainless steels, such as cell walls being seriously changed and lots of contents in the cells being leaked.     

密码子优化的牛精蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以PCR的方法得到牛精蛋白基因的基因，去其内含子，得到牛精蛋白cDNA，克隆入原核表达载体pGEX-2T中，组装成表达载体pGEX-2T-PE，利用大肠杆菌偏好的编码精氨酸的密码子CGT将野生型牛精蛋白基因中编码精氨酸的稀有密码子（AGA或AGG）替换掉，通过基因合成得到密码子优化的牛精蛋白的基因，将其克隆入原核表达载体pGEX-2T中，组装成表达载体pGEX-2T-PS。将这两个表达载体分别转化入大肠杆菌表达菌株BL21中，经IPTG诱导，同样条件下，野生型牛精蛋白基因无法得到表达，密码子优化的牛精蛋白基因能够得到良好的表达，表达产物约占细菌总蛋白的18％，将表达蛋白纯化，进行DNA－蛋白结合实验，发现其能与DNA发生非特异性的结合。     

人免疫缺陷病毒I型p24gag基因的重组与表达

将编码人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，产物为３０ｋＤａ的ｓ１９－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组ｐ２４蛋白均与抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ－１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性。     

离子强度对于牛精蛋白在大肠杆菌中的表达的影响

通过基因合成将大肠杆菌偏好的精氨酸密码子CGT取代野生型牛精蛋白基因中的稀有精氨酸密码子AGA和AGG，得到密码子优化的牛精蛋白基因，并将其克隆入原核表达载体pGEX-2T中，组装成表达载体pGEX-2T-PS。将这个表达载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21中，经IPTG诱导，可得到一33kD融合蛋白表达带，首次成功地将牛精蛋白在大肠杆菌中进行了表达，但其表达量很低，约为总菌体蛋白的13％。增加表遂菌株培养液的离子强度，可将蛋白表达含量提高到28％，且蛋白表达量与离子强度呈正相关。纯化后的牛精蛋白可在体外条件下与DNA发生结合。     

镭普克的制备及对小鼠H22肝癌的抑制作用

报道重组别藻蓝蛋白(rAPC,镭普克)表达菌株的20L高密度发酵、镭普克制备及对小鼠H22肝癌抑制作用的实验结果。采用两步发酵法最终OD600为36．18,比一步发酵法的40．16值低,但镭普克表达率是后者的1．8倍,为30．24％,镭普克生物量提高1．62倍。亲合层析结合分子筛层析纯化后,镭普克纯度可达98．03％。对小鼠H22肝癌静脉注射剂量为50mg/kg／d,抑瘤率为62．2％。初步的免疫实验结果表明,镭普克对淋巴B细胞功能具有增强作用。结果提示镭普克大规模生产的潜力和临床应用的可能性。     

HIV-1核心蛋白的表达与纯化

将编码人I型免疫缺陷病毒(HIV1)核心蛋白p24gag的基因序列克隆到原核表达载体pET28(b)中,高效表达了N,C端融合His·Tagp24蛋白,所表达的重组p24蛋白占菌体总蛋白的46%。在变性条件下,使用NiNTA亲和层析法纯化了p24蛋白,纯度为94%。菌体中及纯化、复性后的目的蛋白均能与抗HIV1p24单克隆抗体发生特异性反应。用纯化的p24蛋白免疫小鼠,4周时小鼠血清抗p24抗体效价达1∶400。实验结果表明:大肠杆菌表达的HIV1p24蛋白纯化后可用作HIV1检测试剂的原料。     

长程表面等离子体共振技术在检测大肠杆菌浓度中的应用研究

建立了一种基于长程表面等离子体共振技术检测大肠杆菌浓度的方法及系统。基于此,制备了能够产生长程表面等离子体共振效应的双层膜传感芯片,并在实验上将长程表面等离子体共振(LSPR)和传统表面等离子体共振(CSPR)两种生物传感器的性能进行了对比。结果表明LSPR生物传感器共振曲线的平均半高宽比CSPR传感器共振曲线的平均半高宽窄1.79倍,且其灵敏度是CSPR的2倍。由此,证实了基于LSPR的生物传感器对大肠杆菌浓度的改变更加敏感。此外,该方法分辨率高,试剂用量少,有效克服分界面所带来的影响,并能够对大肠杆菌进行实时检测。     

表达rAPC大肠杆菌的高密度发酵及纯化产物的抑瘤活性

重组菌的高密度发酵技术是高效表达异源蛋白的一项重要技术。本文研究了培养基组成。培养条件以及诱导条件等对最终的菌体密度和rAPC表达量的影响，确立了最优的高密度发酵条件。此外，还探讨了不同补料流加方式对菌体生长和rAPC表达的影响，结果表明DO-stat补料流加方式具有显著增加菌体量和重组蛋白表达量的作用。发酵16小时后，菌体密度可达OD600106，每升发酵液中rAPC含量可达3.52g，用纯化好的rAPC对皮下接种S180的小鼠灌胃或腹腔注射，剂量为每天3.4mg/kg-13.4mg/kg，共10天。结果表明rAPC对小鼠S180肉瘤有显著的抑制作用，瘤重抑瘤率分别在45%-64%之间，且对荷瘤小鼠的白细胞数量和胸腺指数均无明显影响。