rIL-2对T细胞CD69、CD137和CD28表达的影响

T细胞的活化是体内特异性免疫应答的重要环节,且T细胞的活化需双信号刺激。起始信号可使T淋巴细胞初步活化,共刺激信号的存在使初步活化的T淋巴细胞进入完全活化状态,发挥免疫效应,本研究用流式细胞仪检测健康人PBMC经rIL 2刺激后对T细胞及其亚群活化和共刺激信号分子表达的影响。1　材料与方法1 1　主要试剂、仪器　CD4CD6 9CD3、CD8CD6 9CD3、γ1FITC/γ1PE/CD3PerCP单克隆抗体(BD公司)。CD3、CD8单克隆抗体(ExcellenceeBioscience公司)。CD1 37单克隆抗体(Ancell公司)。CD2 8单克隆抗体(ExalphaBiologicals公司)。…     

不同孕妇分娩前后外周血小板活化程度测定

目的　探讨不同分娩方式对不同孕妇外周血小板活化分子含量的影响及其临床意义。方法　以 3种血小板膜糖蛋白单克隆抗体CD6 2p、CD6 1、CD4 1标记 5 0例正常孕妇和 4 6例妊高征患者外周血小板 ,用流式细胞仪检测。结果　正常孕妇血小板CD6 2p、CD6 1及CD4 1的检测值分别为 7 16 %± 3 10 %、5 6 0 %± 2 78%及 8 31%± 4 31% ;妊高征随程度的加重 3种分子呈增高趋势 ,且重度组检测值显著高于正常组和轻、中度组 (P <0 0 5、P <0 0 1)。轻度组产前及产时与正常妊娠无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,重度妊高征者剖宫产后CD6 2p、CD6 1及CD4 1水平显著增加 (P <0 0 1)。结论　妊高征外周血小板CD6 2p、CD6 1及CD4 1检测值显著增加 ,标志着血小板活化程度和凝血能力明显增强 ,重度妊高征者剖宫产后外周血小板活化更加增强 ,应采取的适当的抗凝措施防止血栓病的发生。     

流式细胞术检测血小板活化的影响因素分析

目的:探讨流式细胞术（FCM）检测血小板活化的影响因素。方法:采集6名志愿者静脉血,枸橼酸钠为抗凝剂, 室温放置不同时间后进行三色免疫荧光标记,FCM检测血小板早期活化标志物纤维蛋白原受体（Fib-R,即PAC-1）和晚期活化标志物P选择素（CD62P）的变化。结果:血小板活化标志物PAC-1和CD62P随着放置时间的延长而表达增加（P< 0.05）。抽血后10 min和30 min PAC-1和CD62P测定值分别相差2.7％和3.5％。且抽血后在不同的活化水平下重复检测多次,结果重复性好,其变异系数（CV）<5%。结论:在室温,枸橼酸钠抗凝条件下,放置时间对血小板活化标志物PAC-1和CD62P的检测结果有较大影响,宜在30 min内对采集血液免疫荧光标记后进行流式细胞仪检测。     

血小板生成素及血小板生成素Ⅱ对人血小板活化的影响

目的:检测血小板生成素(TPO)及TPOⅡ在体外对人血小板活化的影响。方法:取正常健康成人富血小板血浆,分别与血小板生成素(rhTPO)、TPOⅡ及磷酸盐溶液孵化,通过荧光单克隆抗体标记血小板表面CD62P及CD41分子,用流式细胞术测定CD62P/CD41比率,观察各组血小板活化率。结果:rhTPO、TPOⅡ组血小板活化率与PBS组无明显差异,P＞0.05。结论:血小板生成素不会导致血小板异常活化,可应用于血小板生成减少的各种情况。     

孕妇剖宫产前后外周血小板活化分子测定

目的　探讨剖宫产对不同孕妇外周血小板活化分子含量的影响及其临床意义。方法　以 3种血小板活化分子单克隆抗体CD6 2 p、CD6 1、CD4 1标记 5 0例普通孕妇和 36例妊高征患者剖宫产前后外周血小板 ,用流式细胞仪检测。结果　普通孕妇剖宫产前血小板CD6 2 p、CD6 1及CD4 1的检测值分别为 7.16 %± 3.10 %、5 .6 0 %± 2 .78%及 8.31%± 4 .31% ;妊高征随程度的加重 3种分子呈增高趋势 ,且重度组检测值显著高于正常组和轻、中度组 (P <0 .0 5、P<0 .0 1)。轻度组产前及产时与普通妊娠无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,重度组剖宫产后活化分子水平显著增加 (P <0 .0 1) 。结论　妊高征外周血小板活化分子检测值显著增加 ,标志着血小板活化程度和凝血能力明显增强 ,重度妊高征者剖宫产后外周血小板活化更加增强 ,应采取适当的抗凝措施防止血栓病的发生。     

重组载体免疫小鼠制备抗人CD33单克隆抗体

目的利用基因免疫方法制备抗人CD33单克隆抗体(mAb),并对抗体的特性及临床应用进行初步研究。方法真核载体pcDNA3.1(+)/CD33免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备抗人CD33 mAb,并进行性能评价和临床验证。结果成功获得1株分泌小鼠抗人CD33单克隆抗体的杂交瘤细胞株,克隆号命名为HI33a,抗体亚类为IgG2a,κ。流式细胞术检测其可与髓系细胞系反应,不与淋巴系细胞系反应;可完全抑制同类进口抗体与HL-60细胞的结合。Western blot证实可识别相对分子量(M_r)为67 000的HL-60细胞膜蛋白(符合CD33蛋白分子的特征)。标记藻红蛋白(PE)后,作为抗体试剂与进口试剂对比,准确度、线性、精密度等评估均符合行业标准。558例临床骨髓样本检测结果与对比试剂高度一致。结论制备了可持续分泌抗人CD33 mAb的杂交瘤细胞株。     

流式细胞仪三标记法检测白细胞介素-10对人树突状细胞表型的影响

目的观察白细胞介素(IL)10对体外培养人树突状细胞(DC)表型的影响,探讨流式细胞术三色荧光标记抗体检测细胞表面抗原的方法及意义。方法通过SCF、GMCSF、TGFβ1、Flt3和TNFα体外培养体系,将脐血CD34+造血干细胞诱导扩增获得DC,并于成熟过程中用重组人IL10进行干预。采用流式细胞术的三色荧光标记(FITC、PE、CY)单克隆抗体直接检测技术,分析细胞表型CD1a、CD11c、CD83、CD80、CD86和HLADR。结果IL10可下调成熟中DC表面CD11c、CD83、CD80和CD86的表达。结论IL10通过抑制DC表面黏附共刺激分子表达,可调节DC的递呈抗原功能;此外,采用流式细胞仪的三色荧光标记检测方法,不仅可以节约DC细胞用量,而且具有快速和准确的优点,值得推广应用。     

大鼠骨髓基质干细胞的改良培养方法及Hoechst体外标记研究

目的:改良大鼠骨髓基质干细胞全骨髓贴壁培养法,并进行Hoechst体外标记初步研究。方法:采用改良全骨髓贴壁法分离扩增大鼠骨髓基质干细胞,以MTT比色实验观察细胞生长状态并绘制生长曲线,行体外诱导向成骨细胞及脂肪细胞分化,以流式细胞术检测细胞表面抗原。以Hoechst体外标记大鼠骨髓基质干细胞,荧光显微镜下计数并观察Hoechest对细胞生长状态的影响。结果:改良全骨髓贴壁培养法能够在较短时间内获得纯化并具备高活性的骨髓基质干细胞,并成功诱导其分化为成骨细胞及脂肪细胞。流式细胞术检测显示细胞表面CD29、CD90、CD44均为阳性,CD45、CD34均为阴性。荧光显微镜观察Hoechst能够在体外成功标记骨髓基质干细胞,并对细胞的生长无明显影响。结论:经改良后的全骨髓贴壁培养法是获得纯化骨髓基质干细胞的一种更为简捷、高效、经济的途径,Hoechst可作为体外标记大鼠骨髓基质干细胞的标记物。     

识别不同结构域的PTA1/CD226的mAb与活化血小板的关系

目的:研究识别不同PTA1/CD226分子结构域的mAb与刺激血小板活化的关系。方法:采用识别不同结构域的抗PTA1/CD226的mAb(FMU17),应用免疫荧光染色、流式细胞术和血小板凝集试验,研究识别不同结构域mAb对血小板的活化作用。结果:识别CD226第1个结构域的3株mAb(FMU1、2和3)可以与血小板结合,并可刺激血小板发生凝集,而识别CD226第2个结构域的mAbFMU6、FMU7以及识别两个结构域之间序列的FMU4和FMU5既不能与血小板表面天然的CD226分子结合,也不能刺激血小板活化。结论:抗PTA1/CD226mAb刺激血小板活化与抗体识别的结构域有关。     

儿童癫痫患者T淋巴细胞活化并产生促炎因子

目的检测儿童癫痫患者外周T淋巴细胞活化状态以及细胞因子水平变化。方法选取20名儿童癫痫患者和19名健康对照儿童,采集外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),用细胞膜表面标记抗体流式细胞术检测T淋巴细胞表面共刺激分子CD69、CD25和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)的表达,用细胞内因子染色结合流式细胞术检测T细胞细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-17A的表达,利用细胞内因子染色结合流式细胞术检测调节性T淋巴细胞(Treg)表达IL-10的情况。结果与对照组相比,儿童癫痫患者外周血中T淋巴细胞表面高表达共刺激分子CD69、CD25和CTLA4,活化的CD4+T细胞高表达IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17 A。在儿童癫痫患者高表达IL-10的Treg数目增加。结论儿童癫痫患者外周T淋巴细胞活化并产生细胞因子。     

脑梗死患者单核细胞CD14+CD16+亚群及单核细胞-血小板聚集水平的检测及其意义

目的:通过检测脑梗死患者外周血单核细胞各亚群分布情况以及单核细胞-血小板聚集水平,探讨脑梗死患者外周血单核细胞状态、单核细胞-血小板聚集情况及其临床意义.方法:利用流式细胞仪(FCM)检测48例脑梗死患者及31例正常人外周血CD14、CD16、CD41的表达.结果:脑梗死组的CD14+CD16+亚群、单核细胞-血小板聚...     

miR-146a调控血小板免疫活化功能

目的探讨miR-146a对血小板免疫活化功能的影响。方法流式细胞术检测冠心病(n=31)及健康成年人(n=35)全血中血小板PAC-1、CD62-P阳性率,q-PCR及光比浊法分别检测血浆中miR-146a及血小板聚集率;培养K562细胞,佛波酯(PMA)诱导分化为巨核细胞后,分别转染miR-146a mimics、inhibitor及其阴性对照,Western blot检测转染后细胞中TLR-4、PAC-1及CD62-P表达水平。结果冠心病患者miR-146a、血小板聚集率及PAC-1、CD62-P阳性率较对照组升高(P0.05);转染miR-146a mimics后,TLR-4、PAC-1和CD62-P表达水平升高(P0.05)。结论miR-146a可能依赖血小板TLR-4信号通路,介导血小板免疫活化进而促进血小板聚集,加速血栓形成。     

类风湿关节炎患者CD62P、CD41/CD61的表达及意义

目的:通过检测类风湿关节炎(RA)患者血小板表面活化标志物CD41/CD61、CD62P的表达,研究血小板活化与RA及RA活动性的关系。方法:采用流式细胞技术检测RA患者及健康对照组血小板CD41/CD61、CD62P的表达阳性率。结果:血小板CD62P阳性率在RA活动组及RA组患者分别高于缓解组和健康对照组,CD41、CD61阳性率差别在各组间无统计学意义。结论:(1)RA患者血小板CD62P表达增高与疾病活动有关;(2)血小板CD62P高表达可能是RA患者好发心血管疾病的原因之一;(3)CD41/CD61可能与RA炎症及其好发心血管病无关。     

B族链球菌不同菌株对血小板的活化作用

 目的: 探索B族链球菌(GBS)不同菌株对血小板活化的作用及可能的机制。方法: 来自脓毒症伴血小板减少患者分离鉴定的6株GBS作为诱导剂,分别采用血小板聚集仪、流式细胞术、扫描电镜和Western blotting方法检测它们对血小板聚集率以及血小板膜蛋白CD62P、TLR2和TLR4表达的影响;进一步用TLR2和TLR4单克隆抗体封闭血小板表面TLR2和TLR4以检测它们与GBS诱导的血小板活化的关系。结果: 6株GBS中有3株可诱导血小板聚集,且能明显上调血小板TLR2和CD62P的表达(P < 0.05),但对血小板TLR4的表达没有影响;封闭血小板TLR2后,GBS诱导的血小板聚集率明显下降。结论: 部分GBS菌株可诱导血小板活化,血小板TLR2可能在这个过程中起重要作用。     

CD14、MD-2 在LPS 致乳腺上皮细胞炎症中的作用

目的:探究LPS致乳腺上皮细胞(MECs)炎症中白细胞分化抗原14(CD14)、髓样分化蛋白2(MD-2)的作用。方法:采用MTT法和流式细胞术检测LPS对小鼠MECs的刺激条件,PCR和流式细胞术检测MECs上CD14、MD-2的表达;siRNA沉默CD14、MD-2基因,通过流式细胞术检测FITC-LPS与细胞的结合率,ELISA法检测LPS介导炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β表达来研究CD14、MD-2在LPS致MECs炎症中的作用。结果:LPS作用于细胞IC_(50)为76.83μg/ml;当5～10μg/ml浓度的LPS刺激细胞6～12 h时,LPS与细胞的结合趋于饱和;基因和蛋白水平都表明MECs上有CD14、MD-2表达,CD14、MD-2基因沉默后,LPS与小鼠MECs结合率被抑制,同LPS组相比分别下降7.88%、3.00%、13.41%(P0.01),同时LPS介导细胞分泌TNF-α、IL-6及IL-1β的量(P0.05、P0.01)也显著或极显著下降。结论:MECs上有CD14、MD-2的存在,它们是乳腺细胞胞外LPS-TLR4炎症信号途径重要基因。     

流式细胞仪检测血小板线粒体膜电位的方法

目的运用流式细胞仪对血小板线粒体膜电位进行检测,为衰老相关性疾病和药物对线粒体机能作用的研究提供新的研究方法。方法利用抗凝血分离纯化得到的血小板,用荧光探针JC-1对血小板线粒体进行标记,在流式细胞仪上检测血小板线粒体内JC-1荧光强度的变化。结果正常的血小板线粒体保持着较高的膜电位,JC-1在线粒体内形成聚合物,以红色荧光为主。膜电位去极化的异常血小板线粒体内,JC-1分解成单体,以发绿色荧光为主。结论运用流式细胞仪对JC-1标记的血小板线粒体膜电位进行检测是一种简便可行的检测线粒体机能的有效方法。     

用流式细胞仪富集大鼠骨髓干细胞

目的：建立大鼠骨髓干细胞富集的方法。方法：用常规方法从大鼠胫骨中获取骨髓细胞，采用红细胞裂解液去除红细胞，然后以PE标记的CD3、CD45RA抗体及FITC标记的Thy抗体标记细胞，最后通过流式细胞仪检测并分选Thy CD3^- CD45RA^ 细胞。结果：①大鼠骨髓细胞中CD3^ 、CD45RA^ 和Thy^ 细胞分别约占14．1％、4．2％和20．8％；②流式细胞仪分选的Thy^ CD3^-CD45RA^-细胞约占2．8％。结论：应用红细胞裂解液去除红细胞及通过流式细胞仪分离Thy^ CD3^-CD45RA^-细胞是一种较有效的富集大鼠骨髓干细胞的方法。     

仪器分析法和手工涂片法白细胞分类结果比较

观 察外周血细胞分类变化对疾病的初诊和治疗有着极其重要的作用 ,最常用的方法是手工涂片法 ,直接在显微镜下观察细胞形态 ,直观易发现问题 ,但较费时。目前三分类血球分析仪在血标本检测中广泛使用 ,其检测白细胞分类的原理主要采用库尔特原理[1] 。仪器法的特点 :检测标本速度快 ,但分类较粗糙。本文选取 6 2例病人血标本分别用仪器法和手工法进行白细胞分类比较。1　资料与方法1.1　检测对象选出 6 2例血液标本 ,均为在本院治疗的病人。1.2　检测仪器美国雅培公司CD 16 0 0型自动血球分析仪 ,试剂为长沙华珊公司提供 ,日本OLYMPUS显…     

不同来源间充质干细胞表面标记的比较

目的 探讨人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）、人脂肪间充质干细胞（ADSCs）和人经血源子宫内膜间充质干细胞（MenSCs）之间表面标记的差异及随培养代次增加表面标记的变化。 方法 分别将HUCMSCs、 ADSCs和MenSCs培养至第3、6、9、12代,用流式细胞术、免疫荧光法检测CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD45的表达并进行比较。 结果 培养MenSCs和HUCMSCs呈纺锤状,ADSCs形态多样以梭型、多角形为主。流式细胞术检测显示,人HUCMSCs、ADSCs和MenSCs的第3代CD29、CD44、CD73和CD105阳性表达率均在95%以上,CD45阴性表达;第3代MenSCs CD90的表达率为(72.43±0.76)%,均低于其在HUCMSCs（99.67±0.12）%和ADSCs（99.70±0.15）%表达（P＜0.001）。HUCMSCs、ADSCs和MenSCs随培养代次的增加表面标记CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD45表达率差异无显著性（P>0.05）。免疫荧光结果与流式细胞术结果一致。 结论 HUCMSCs、ADSCs和MenSCs随培养时间的增加稳定高表达 CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,不表达CD45,MenSCs的CD90表达率低于其在HUCMSCs和ADSCs的表达。     

表达人CD36基因的293T细胞株的建立

目的 建立一种表达人类CD36基因的293T细胞株,用于CD36抗原的研究及CD36抗体检测.方法 采用RT-PCR技术,从人血小板中获取CD36基因的cDNA,克隆至表达载体pEGFP-C1中,对重组质粒测序鉴定后将质粒转染至293T细胞,该转基因的产物在293T细胞中的表达被观察超过1年.与CD36单克隆抗体及CD36阳性血清反应的流式细胞术试验评估这个细胞株的敏感性和特异性.结果 重组表达载体pEGFP-C1-CD36被成功构建,流式细胞术验证其转染效率达90％以上,实时荧光定量PCR和Western blot证明CD36基因在293T细胞中过表达.流式细胞试验结果为CD36单克隆抗体及CD36阳性血清为阳性,而其他所有的血清样本,包括CD36抗体阴性血清、含有HLA或HPA-3a抗体血清均为阴性.结论 建立的pEGFP-C1-CD36-293T细胞株能成功高效表达CD36抗原,并能特异快速、成功地检测CD36抗体,并且不受其他血型抗体的干扰,有一定的运用前景.