LPS和TNF-α对血管内皮细胞SSeCKS的表达影响

目的：研究细菌脂多糖（LPS）、肿瘤坏死因子（TNF-α）对牛肺动脉内皮细胞（BPAEC）Src抑制的蛋白激酶C底物（Src-suppressed C Kinase Substrate，SSeCKS）表达的影响和对细胞骨架结构的影响，探讨SSeCKS参与细胞骨架结构改变的可能机制。方法：应用LPS、TNF-α刺激体外培养的BPAEC，应用原位杂交、免疫印迹方法检测不同刺激条件下BPAEC中SSeCKS mRNA和蛋白的表达情况；免疫细胞荧光法观察LPS、TNF-α对内皮细胞中SSeCKS与纤维状肌动蛋白（F-actin）定位和结构的影响。结果：静息状态的BPAEC表达极少量的SSeCKS；经LPS刺激后，SSeCKS表达没有明显变化；而TNF-α以浓度和时间依赖的方式诱导内皮细胞SSeCKS表达增加；LPS和TNF-α刺激后，F-actin发生重构，且SSeCKS向核周、细胞膜纤维、板状伪足聚集；蛋白激酶C（PKC）抑制剂Ro-31．8220抑制LPS和TNF-α对内皮细胞F-actin和SSeCKS细胞内定位改变的影响。结论：TNF-α能够诱导内皮细胞SSeCKS表达增加，PKC参与LPS、TNF-α诱导内皮细胞F-actin的重构和SSeCKS重新分布。提示SSeCKS可能与LPS和TNF-α诱导内皮细胞F-actin的重构有关。     

SSeCKS对牛肺动脉内皮细胞黏附和迁移的影响

目的： 研究SSeCKS在细胞外基质成份诱导内皮细胞黏附和迁移中的作用。方法： 用纤黏连蛋白(FN)诱导内皮细胞，以Western blotting分析SSeCKS表达量的变化；用Ro31-8220、calphostin C（蛋白激酶C抑制剂）预处理内皮细胞，观察对细胞黏附和迁移的影响，以共聚焦显微镜观察其对SSeCKS、F-actin和vinculin在细胞定位的影响。结果： FN能够显著诱导内皮细胞黏附和迁移，SSeCKS的表达量也随之增加，具有时间和剂量依赖性；经Ro31-8220、calphostin C处理细胞后，SSeCKS表达量明显减少，细胞黏附率和迁移细胞数也较处理前显著减少，SSeCKS由细胞质散在分布向核周聚集，且SSeCKS与F-actin、vinculin在细胞边缘共定位比处理前减少。结论： SSeCKS参与细胞外基质诱导内皮细胞黏附和迁移的过程，由其介导的PKC信号转导促进了这一过程，蛋白激酶C抑制剂可有效抑制此过程。     

细菌脂多糖对培养星形胶质细胞中Src抑制的蛋白激酶C底物表达的影响

目的 研究细菌脂多糖(LPS)对培养的大鼠星形胶质细胞中Src抑制的蛋白激酶C的底物(SSeCKS)表达的影响.方法 培养的星形胶质细胞随机分为空白对照组、LPS单一刺激组、LPS联合PKC抑制剂(RO-31-8220)刺激组.运用荧光定量PCR(Real time RT-PCR)、免疫印迹和免疫细胞化学法分析SSeCKS的表达变化和亚细胞定位.结果 Real time RT-PCR显示,LPS可以上调SSeCKS mRNA水平,在作用浓度为100 μg/L和1 mg/L时与对照组有显著差异(P＜0.01).Western blotting表明,当LPS作用浓度为100 μg/L时,SSeCKS蛋白表达量明显上调;在此浓度作用下,SSeCKS表达于6 h达高峰并广泛磷酸化,至24 h其蛋白表达仍维持于较高水平.免疫细胞化学分析显示,正常情况下,SSeCKS散在分布于胞质,于胞膜略有浓集.在LPS单一刺激组,SSeCKS富集于核周;当LPS联合RO-31-8220共同作用时,SSeCKS的亚细胞定位与正常组无明显差异.结论 在体外培养的星形胶质细胞中,LPS可诱导SSeCKS表达,上调其磷酸化水平,影响其细胞内定位.这些改变与PKC的功能相关.提示SSeCKS可能参与星形胶质细胞中炎症信号的转导.     

大鼠坐骨神经损伤后Src抑制的蛋白激酶C的底物在背根神经节中的表达变化

目的:探讨大鼠坐骨神经损伤后,Src抑制的蛋白激酶C的底物(SSeCKS)在背根神经节(DRG)中的表达变化及其意义。方法:制备成年SD(Sprague-Dawley)大鼠坐骨神经夹伤及切断模型。通过Western印迹法、Real-time PCR及免疫组织化学方法检测坐骨神经损伤后SSeCKS在DRG中表达的时空变化。结果:大鼠坐骨神经夹伤后6h,DRG中可检测到SSeCKS的表达并逐步升高,伤后12h达到高峰,2d后逐渐下降;而大鼠坐骨神经切断后DRG中SSeCKS的表达高峰发生在伤后2周,1d时最低;SSeCKS主要分布于DRG大、中、小神经元胞质;SSeCKS与NeuN、NF200以及GAP43存在共定位。结论:大鼠坐骨神经损伤后,引起DRG中SSeCKS的表达变化,其可能参与疼痛信号转导通路并与周围神经损伤后的再生有关。     

PTX3对LPS诱导内皮细胞表达TF的影响

目的研究PTX3（pentraxin-3）对脂多糖（LPS）诱导内皮细胞表达组织因子（Tissue factor，TF）的影响及其相关机制。方法胰蛋白酶消化法原代培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），一期凝血法检测不同实验组TF促凝活性，酶联免疫吸附实验测TF抗原和反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测TF mRNA表达。结果与对照组比较，单独加入SAP、CRP和PTX3的M199培养基中HUVEC TF促凝活性、抗原和mRNA表达未见明显改变（P〉0．05）；当与LPS共同培养6h，每组HUVEC TF活性和抗原均明显升高（P〈0．05）。结论PTX3不影响内皮细胞TF促凝活性、抗原和mRNA表达，但参与LPS诱导的内皮细胞表达TF。     

ERK信号转导途径在LPS诱导的人类内皮细胞iNOS表达中的作用

目的主要研究 p44/42MAPK(ERK1/2或ERK)信号途径在LPS诱导的人内皮细胞 -ECV304iNOS表达和NO产生中的作用。方法用Griess法检测细胞培养液中NO水平 ,分别用免疫荧光法和RT -PCR检测细胞iNOS蛋白和mRNA表达 ,采用免疫激酶沉淀以Westernblot检测细胞中ERK激酶的活性。结果LPS可显著激活人类内皮细胞 -ECV304中的ERK信号途径 ,其激活高峰在LPS刺激后15～20min ,45min后活性逐渐下降。用ERK的特异性抑制剂PD98059处理细胞后可以显著抑制LPS诱导人内皮细胞ERK的活性。与对照组相比 ,LPS刺激后的ECV304细胞iNOS蛋白和mRNA的表达明显增加 ,培养基中NO水平也显著升高 ,用PD98059预处理细胞后 ,可显著抑制细胞iNOS表达和NO和产生。研究结果表明ERK信号途径参与了LPS介导的人内皮细胞iNOS表达和NO产生。结论通过阻断信号转导通路来减少iNOS及其它细胞因子的产生 ,为败血症休克的防治提供了一条新的思路     

大鼠脑损伤后SSeCKS的表达变化

目的:探讨大鼠脑损伤后,SSeCKS(Src抑制的蛋白激酶C的底物)在脑组织中的表达变化及其意义。方法:制备成年SD(Sprague-Dawley)大鼠脑损伤模型。通过Western blot和RT-PCR方法检测脑损伤后SSeCKS表达的时相变化,免疫组织化学方法检测SSeCKS在脑组织中的细胞定位。结果:Western blot显示,大鼠脑损伤后,SSeCKS的表达逐步降低,伤后3d降至最低点,之后逐渐上升,7d达到高峰,14d后趋于平稳;RT-PCR的结果与Western blot一致。免疫荧光双标记结果显示SSeCKS与星形胶质细胞的标记物GFAP、神经元的标记物NeuN共定位。结论:大鼠脑损伤可以改变SSeCKS的表达,这种改变可能参与脑损伤后星型胶质细胞的活化和增殖过程,并与神经元的凋亡、轴突再生有关。     

大鼠肺微血管内皮细胞的培养

目的建立简单有效地获取大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)的培养方法。方法从实验动物、培养基、植块方法、胎牛血清浓度等方面对植块培养法进行改进,应用W istar雄性大鼠的肺组织,进行PMVEC的原代培养并传代培养;通过倒置显微镜、扫描、透射电镜观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定。结果体外培养的大鼠PMVEC呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列,获得的血管内皮细胞纯度较高,抗Ⅷ因子阳性反应,成功建立了PMVEC的原代培养方法。结论改进的植块培养法简便、可靠,获得的PMVEC纯度高,生长状态良好,保持了内皮细胞的结构和功能,可用于其功能特性的进一步研究。     

内毒素致伤小鼠肺组织SSeCKS表达变化的研究

目的 观察内毒素，脂多糖（LPS）致伤小鼠肺组织中Src抑制的蛋白激酶C的底物（SSeCKS）的表达变化和细胞定位。方法 腹腔注射LPS制备小鼠内毒素肺损伤模型，依据注射时相和剂量不同随机分组。用Real-time PCR法和Western blot法检测各组肺组织SSeCKS的mRNA和蛋白质水平表达情况，间接免疫荧光双标法检测SSeCKS在肺组织中的细胞定位。结果 SSeCKS表达水平与LPS用量呈现剂量和时间依赖关系：1、5、10和15mg/kg组SSeCKS mRNA水平皆显著高于对照组（P〈0．05），且随注射剂量增高SSeCK SmRNA表达量亦逐渐增高；不同时相LPS（5mg/kg）注射后肺组织中SSeCKS mRNA水平表达呈动态变化过程，1h开始增高，3h达到表达高峰，12h降至正常水平；SSeCKS蛋白水平表达变化与mRNA水平变化相一致。SSeCKS在肺组织中定位于肺泡间隔毛细血管内皮细胞。结论 SSeCKS是炎症反应蛋白，其表达量与炎症的严重程度相关。内毒素可诱导肺泡间隔毛细血管内皮细胞SSeCKS表达上调。     

LPS对内皮细胞纤维状肌动蛋白和钙依赖性粘附素的细胞定位和结构的影响

目的:通过观察人脐静脉内皮细胞的纤维状肌动蛋白(F-actin)和内皮细胞钙依赖性粘附素(VE-cadherin)的细胞定位和结构变化,从形态学的角度阐述LPS对内皮细胞的作用。方法:培养人脐静脉内皮细胞,选用VE-cadherin的特异性抗体,采用免疫荧光技术观察不同浓度LPS刺激下VE-cadherin的胞膜定位和结构的变化;选用F-actin的特异性结合物鬼笔环肽进行荧光染色,观察不同浓度LPS刺激下F-actin细胞定位和结构的变化。结果:正常状态下VE-cadherin位于内皮细胞间连接处,染色轮廓清晰光滑,细胞间无明显缝隙。较高浓度LPS刺激后可看到细胞间连接处染色减少,呈锯齿状,部分视野细胞回缩,有明显的细胞间隙形成。正常组F-actin主要分布在细胞的周边以及胞核周围,分布均匀、排列整齐。较高浓度LPS刺激后,内皮细胞周边的F-actin基本消失,出现明显的应力纤维(变粗、变短、紊乱,排列呈明显的极向分布),可见丝状和板状伪足。结论:高浓度的LPS(大于300μg/L)作用于内皮细胞,可影响F-actin和VE-cadherin的结构重组和细胞内分布。     

葡萄糖对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体表达的影响及吡格列酮的干预作用

目的:研究葡萄糖对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体(EPCR)mRNA 表达的影响,以及吡格列酮的干预作用。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分别以流式细胞术和RT-PCR技术确认HUVECs膜上EPCR的表达水平和 mRNA 水平的表达。再分别以含不同浓度D-葡萄糖(5、10、30、50 mmol/L)的培养基以及含吡格列酮(5、10、20 μmol/L)或不含吡格列酮的高糖(50 mmol/L)培养基孵育HUVECs 24 h,行剂量和时间依赖性实验,并采用实时定量PCR技术测定HUVECs细胞 EPCR mRNA 的表达。结果:随着培养基D-葡萄糖浓度的增加,HUVECs培养24 h后其EPCR mRNA 的表达逐渐下调。在采用吡格列酮干预后, 50 mmol/L高糖处理的HUVECs EPCR mRNA 表达的下调得到明显改善。结论:(1)EPCR 在HUVECs上高表达,高糖可通过下调EPCR mRNA 的表达而损伤内皮细胞功能。(2)吡格列酮可阻止高糖诱导的HUVECs EPCR mRNA表达的下调,从而保护内皮细胞功能。     

蝮蛇毒血小板抑制因子减轻LPS诱导的内皮细胞损伤

目的:探讨蝮蛇毒血小板抑制因子(AHV-PI)对体外脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)损伤的影响及其作用机制。方法:体外培养HUVECs,运用LPS(1 mg/L)诱导HUVECs炎症损伤模型,实验分为空白对照组、LPS组、AHV-PI组和AHV-PI+LPS组。MTT比色法检测HUVECs的活力,倒置显微镜观察HUVECs的形态变化,筛选出AHV-PI最适浓度为5 mg/L。流式细胞术检测细胞凋亡;免疫组化法观察胞内组织型纤溶酶原激活物(T-PA)以及纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达情况;ELISA法检测HUVECs上清液中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和组织因子(TF)含量;免疫荧光染色检测胞核内NF-κB亚基p65激活转位情况。结果:LPS组细胞明显梭形化,长宽比增大,呈成纤维细胞状,胞浆出现颗粒样物质。AHV-PI浓度低于5 mg/L时对HUVECs的活性和形态没有明显影响,但可减轻LPS引起的HUVECs的活力抑制和形态改变。与对照组比较,LPS组上清液中TF和ICAM-1含量升高,胞内T-PA和PAI-1表达减少;与LPS组相比,AHV-PI+LPS组上清液中TF和ICAM-1的含量显著降低,细胞内T-PA和PAI-1表达增多,细胞核内NF-κB p65表达减少。结论:AHV-PI能减轻HUVECs损伤,其保护机制与抑制细胞因子分泌及NF-κB活化有关。     

脉冲电刺激对血管内皮细胞与其祖细胞黏附的影响

为探索脉冲电刺激下血管内皮细胞与内皮祖细胞(EPC)之间黏附强度的改变,诱导培养外周血EPC,荧光标记后与单层血管内皮细胞共培养,固定电压和频率为5 V和5 Hz,选择1、3、6、9 ms的脉宽对其进行干预,持续刺激24 h后检测贴壁EPC的荧光强度,以荧光比率衡量。结果显示,与对照组相比,3 ms刺激组荧光比率即显著增高,随着脉宽延长,6 ms组达到最大值,但9 ms刺激组却显著下降,提示适宜脉冲电刺激有利于血管内皮细胞与EPC之间的黏附,为电刺激促进血管新生的研究提供新的理论依据。     

脑动脉内皮细胞缺氧时内皮型一氧化氮合酶基因表达的变化及蛋白激酶C的作用

目的：研究缺氧时脑动脉内皮细胞(CAECs)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达的变化，并探讨可能的分子机制。方法： 分别采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹技术检测原代培养的猪脑动脉内皮细胞缺氧2、6、12、24、48 h后eNOS mRNA和蛋白质表达的变化，并观察蛋白激酶C(PKC)抑制剂对缺氧24 h引起的eNOS mRNA和蛋白质变化的影响。加入转录抑制剂放线菌素D后观察缺氧24 h对eNOS mRNA稳定性的影响。结果：缺氧2 h后脑动脉内皮细胞eNOS mRNA和蛋白质表达均增加，12 h达到高峰，约分别为常氧组的2.5倍和2.0倍，缺氧48 h仍高于常氧组。缺氧对eNOS mRNA稳定性无明显影响。选择性PKC抑制剂BIM I(1 μmol/L)、G6983(1 μmol/L)均能降低缺氧24 h所引起的eNOS基因表达的上调。结论： 脑动脉内皮细胞缺氧时可通过PKC信号途径上调eNOS基因的表达，并可能由此介导缺氧时脑血管的扩张反应，发挥其神经保护作用。     

辛伐他汀对香烟烟雾提取物诱导的人脐静脉内皮细胞表达sEPCR和mEPCR的影响

目的: 研究辛伐他汀对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 表达可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)和膜联内皮细胞蛋白C受体(mEPCR)的干预作用。方法: 体外培养的4~6代HUVECs 随机分为对照组、5%CSE组、不同浓度辛伐他汀组及辛伐他汀干预组,辛伐他汀组分别加入50、100、200 μmol/L辛伐他汀液孵育24 h,辛伐他汀干预组先以50、100、200 μmol/L辛伐他汀预处理细胞2 h,再与5%CSE孵育24 h。收集各组细胞及上清液,ELISA法检测上清液中sEPCR蛋白含量,实时定量PCR法检测各组细胞中mEPCR mRNA的表达。结果: (1)5%CSE组sEPCR蛋白含量高于对照组,mEPCR mRNA表达低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);(2)100 μmol/L与200 μmol/L辛伐他汀组sEPCR蛋白含量均高于对照组,低于5%CSE组,其mEPCR mRNA表达均低于对照组,高于5%CSE组,差异均有统计学意义(均P<0.05);(3)各辛伐他汀干预组sEPCR蛋白含量均低于5%CSE组,但高于对照组及相应浓度的辛伐他汀组;相反,各辛伐他汀干预组mEPCR mRNA表达均高于5%CSE组,低于对照组及相应浓度的辛伐他汀组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论: 在体外,辛伐他汀通过上调HUVECs mEPCR mRNA的表达,降低sEPCR的分泌,对CSE介导的内皮细胞凝血功能障碍可能具有一定的改善作用。