霍乱弧菌O1群和O139群NhaA基因的克隆和变异性研究

霍乱弧菌是一种嗜盐性细菌 ,可在较宽盐浓度和ｐＨ值范围内生长 ,Ｎａ /Ｈ 离子交换泵与此密切相关。ＮｈａＡ基因所编码的ＮｈａＡ蛋白是维持该离子交换泵必需的功能蛋白。ＮｈａＡ基因的变异可使霍乱弧菌适应不同的外环境而得以生存。为了解我国霍乱弧菌Ｏ1群和Ｏ1 3 9群ＮｈａＡ基因的变异性与致病性的关系 ,我们采用ＰＣＲ和序列分析的方法 ,对来源于我国广东省和内地部分省份的 4 0株霍乱弧菌 (包括Ｏ1群和Ｏ1 3 9群 )ＮｈａＡ基因进行克隆和序列比较分析。根据霍乱弧菌Ｏ1群野毒株ＮｈａＡ基因序列 ,设计扩增引物序列为 :上游5′ ＣＣ…     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

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应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

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应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

抗霍乱弧菌O139群单克隆抗体的制备及初步鉴定

制备抗霍乱弧菌(V. cholerae)O139群特异性单克隆抗体(MAbs),进而制备检测霍乱弧菌O139群的胶体金免疫层析试纸条.福尔马林灭活的霍乱弧菌O139群免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术建立分泌抗霍乱弧菌O139群MAbs的杂交瘤细胞株.对配对较好的4株MAbs用ELISA法测定MAbs免疫球蛋白类及亚类,用ELISA法和凝集法鉴定MAbs的特异性.结果表明4株MAbs免疫球蛋白均为小鼠IgM;这些MAbs均与霍乱弧菌O139群菌株发生凝集反应,与霍乱弧菌O1群、大肠杆菌、出血性大肠杆菌O157∶H7、副溶血弧菌、麦氏弧菌、河弧菌、结肠炎耶尔森氏菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及甲型、乙型、丙型副伤寒杆菌不发生凝集反应.4株MAbs具有较高的特异性,有可能用于制备检测霍乱弧菌O139群的检测试剂.     

霍乱弧菌O139某些生物学特性及毒力基因检测

Ｏ１３９霍乱弧菌是１９９２年发现的新型霍乱弧菌，其毒力强，危害严重。对中国、印度、孟加拉国分离的２３株Ｏ１３９菌株的部分生物学特征检查表明：对弧菌抑制剂Ｏ／１２９均具有抗性、溶原菌、山梨醇慢发酵、非溶血性。核酸分子杂交显示，所有被检Ｏ１３９菌株都具有主要的霍乱弧菌毒素基因：ｃｔｘ，ｚｏｔ，ａｃｅ和ＲＳ１序列。ＰＣＲ检测ｃｔｘ基因与Ｏ１群流行珠具有相同的扩增产物，ｔｃｐＡ基因扩增表现为与埃尔托型霍乱弧菌相似的扩增产物。兔肠段结扎测毒表明，Ｏ１３９霍乱弧菌为强毒株。因此Ｏ１３９菌与Ｏ１群霍乱弧菌流行株具有共同的毒力特征。     

抗O139群霍乱弧菌单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的制备抗O139群霍乱弧菌(vibriocholeraeO139)的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性,为进一步研制检测O139群霍乱弧菌的胶体金免疫试纸条创造条件。方法以灭活的O139群霍乱弧菌免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗O139群霍乱弧菌的mAb。采用间接ELISA方法和Westernblot对mAb的特异性进行鉴定。采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类、检测其腹水效价及相对亲和力,并进行表位分析。结果获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(O4D7和O4D10),其Ig亚类分别为IgG2b和IgG3;腹水mAb的效价均为1∶107;mAbO4D7的相对亲和力在1×105以上,O4D10在1×104以上。ELISA相加实验的结果显示,2株mAb可识别不同的抗原表位。结论成功地制备抗O139群霍乱弧菌的两株mAb,为建立快速特异检测O139群霍乱弧菌感染的试验方法提供了有力的工具。     

双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌

目的建立改良分子信标双重实时PCR同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的快速方法,应用于霍乱监测、副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)和副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,分别设计引物和改良分子信标探针,以10种细菌作对照,建立双重实时PCR改良分子信标检测体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和霍乱监测。结果改良分子信标双重实时PCR反应体系DNA灵敏度为102.4～166.6fgμl,菌液灵敏度为32～64CFUml或3～6CFUPCR反应体系,无交叉反应。此反应体系同时检测40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时PCR阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性。从样品处理到检测结果仅需1天时间。结论改良分子信标双重实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱和副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

一株来自我国海南的O139霍乱弧菌与8株国外流行菌…

一株由海南某地一名霍乱患者水样便中分离的Ｏ１３９霍乱弧菌。通过表型和遗传特性测定；并与来自印度等国家的８株Ｏ１３９霍乱流行菌株作比较，结果证实此海南菌株具有与国外Ｏ１３９流行菌株相同的特性；它属于ＨｅｉｂｅｒｇＩ群，具Ｏ１群霍乱弧菌相同的生化特性，但对弧菌抑制剂（Ｏ／１２９）不敏感，它不能被Ｏ１群多价血清凝集，也不与其他型非Ｏ１群血清产生凝集，不能产生Ｏ１群霍乱弧菌的杀菌抗体，但携带与Ｏ１群信霍乱     

霍乱弧菌PCR快速检测及应用研究

霍乱弧菌快速、准确的检定是控制霍乱流行的重要手段。本研究建立了ｃｔｘＡ－ＰＣＲ快速检测鉴定方法，并用于新疆霍乱弧菌Ｏ１３９腹泻暴发的病人诊断和环境水体的污染状况评价，取得了较理想的效果。该方法灵敏度高、特异性好、被扩增样品中含４个以上活菌细胞即可检出，为霍乱防治和分子流行病学研究提供了又一有效手段。     

一株来自我国海南的O139霍乱弧菌与8株国外流行菌株特性比较

一株由海南某地一名霍乱患者水样便中分离的Ｏ１３９霍乱弧菌，通过表型和遗传特性测定；并与来自印度等国家的８株Ｏ１３９霍乱流行菌株作比较，结果证实此海南菌株具有与国外Ｏ１３９流行菌株相同的特性；它属于ＨｅｉｂｅｒｇＩ群，具Ｏ１群霍乱弧菌相同的生化特性，但对弧菌抑制剂（Ｏ／１２９）不敏感，它不能被Ｏ１群多价血清凝集，也不与其他型非Ｏ１群血清产生凝集。不能产生Ｏ１群霍乱弧菌的杀菌抗体。但携带与Ｏ１群霍乱弧菌同源性毒素（ＣＴ）基因，并能表达，在其培养物上清中可测到ＣＴ活性。     

O139群霍乱弧菌染色体中整合两种CTXΦ前噬菌体基因组的多样性

目的：研究同时携带两种CTXφ基因组的O139群霍乱弧菌中CTXφ基因组的多样性。方法:Southern blot检测分离自福建的部分O139霍乱弧菌菌株中ctxAB和zot基因的多态性，然后选取ctxAB和zot基因拷贝数差异较大的3株菌，扩增其调控抑制基因rstR基因片段，克隆并进行序列测定、分析。结果：此3株菌染色体zot杂交条带多于ctxAB2－5条，提示1个菌株染色体上有编码ctxAB的CTXφ以及不编码ctxAB的CTXφ两种基因组。以保守区设计的引物扩增此3株菌的rstR区，均得到2条大小 不同的条带，分别克隆后进行测序，经GenBank同源性检索，发现在此3个菌株染色体中分别有来自El Tor型的CTX^ETφ与不编码ctxAB的nct-CTX^0139φ、来自加尔各答型的CTX^calcφ与nctCTX^0139φ、以及CTX^ETφ与新报道的一种具有独特rstR序列的CTXφ类基因组两两共存于1个菌株染色体上。这3个菌株还具有不同的16S核糖体基因杂交图谱。结论：不同rstR序列的CTXφ基因组可以共存于1个菌株染色体中，提示CTXφ家族进化过程中的复杂分化，CTXφ家族在不同霍乱菌株间的出现及传递、在霍乱弧菌菌株的变异分化中具有相关性。