人NYD-SP28基因原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建人NYD-SP28基因原核表达载体,表达其原核蛋白,制备其多克隆抗体,以探讨其在精子发生中的作用。方法:以原始质粒为模板,用PCR法扩增人的NYD-SP28基因开放阅读框全长,将其克隆到原核表达质粒pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-NYD-SP28。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导原核蛋白的表达,纯化蛋白以免疫小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA法测定抗体的滴度。结果:成功构建了用于原核蛋白表达的重组质粒,并在BL21菌中表达NYD-SP28原核蛋白,用亲和层析Ni柱进行纯化得到NYD-SP28原核蛋白。用纯化的NYD-SP28蛋白免疫小鼠2个月后,得到相应的多克隆血清抗体,经ELISA检测,滴度达到1/10万。结论:成功构建人NYD-SP28原核表达载体,并获得了高纯度的NYD-SP28蛋白及鼠抗NYD-SP28多克隆抗体,为进一步研究NYD-SP28的功能奠定了基础。     

人肠道病毒71型VPO蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VPO蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性.方法:PCR方法扩增VPO基因,构建原核表达质粒pET-VPO并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VPO重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VPO多克隆抗体,ELISA方法检测抗VPO抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性.结果:VPO重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VPO抗体效价为1:106.细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VPO多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VPO蛋白.结论:原核表达了EV71的VPO蛋白并制备出抗VPO多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段.     

降钙素原基因克隆表达及多克隆抗体的制备

目的 克隆、表达降钙素原(PCT),制备相应的多克隆抗体.方法 根据GenBank上PCT的基因序列,设计10条用于基因拼接的DNA引物,利用PCR技术扩增PCT基因并构建pGEX-KG-PCT重组质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白PCT-GST,然后用融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot法进行生物活性鉴定,并利用琼脂免疫扩散实验检测了多克隆抗体的特异性和效价.结果 成功获得PCT全长基因,重组质粒pGEX-KG-PCT在大肠杆菌中成功表达,SDS-PAGE电泳显示蛋白相对分子质量(Mr)大小为36 000左右.利用纯化的蛋白同时制备了GST和PCT-GST多克隆抗体,琼脂免疫扩散实验显示多克隆抗体可以特异性识别PCT,效价为1∶4.结论 成功克隆、表达并纯化出PCT蛋白,制备了相应的多克隆抗体.     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

人BTLA分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:表达并纯化重组人BTLA(hBTLA)分子胞外区,制备和鉴定兔抗hBTLA多克隆抗体,为进一步实验研究奠定基础。方法:采用特异性引物扩增hBTLA胞外功能区DNA,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a-hBTLA。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21(DE3)菌株,采用IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对抗体进行纯化、效价测定及特异性鉴定。结果:序列测定证实构建的pET28a-hBTLA重组表达载体含有hBTLA编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为15720的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Western blot分析显示抗体能特异性结合重组hBTLA蛋白。结论:成功构建了hBTLA蛋白的原核表达载体,获得高纯度的融合蛋白,制备高效价、高特异性的多克隆抗体。     

CD83重组蛋白的原核表达、复性纯化及多克隆抗体制备北大核心CSCD

目的:利用原核表达系统表达、纯化CD83蛋白,制备CD83多克隆抗体。方法:构建CD83胞外结构域的原核表达质粒,利用TOP10F’菌株表达,使用IPTG诱导并寻找最佳条件;采用0.3%SKL将包涵体溶解变性,透析复性后通过GST亲和层析纯化GST-CD83蛋白;通过QuickAntibody免疫佐剂免疫SD大鼠制备CD83多克隆抗体,ELISA分析抗体的反应活性和特异性。结果:成功构建重组质粒pGEX-2T-CD83(Met1-Arg133),获得最佳诱导条件:0.2 mmol/L IPTG、25℃、O/N。成功获得CD83重组蛋白,免疫大鼠后获得了特异性及活性较高且效价为1∶104~1∶105的多克隆抗体。结论:获得的CD83重组蛋白及多克隆抗体,为后期深入开展CD83蛋白及CD83抗体的免疫抑制特性研究提供支持。     

人UL16结合蛋白3的原核表达及其多克隆抗体制备

目的:表达和纯化人UL16结合蛋白3(ULBP3)胞外段融合蛋白,制备兔抗人ULBP3多克隆抗体。方法:利用PCR技术获得人ULBP3分子胞外段的基因编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建出重组表达质粒pQE30-ULBP3(aa30-171)。测序鉴定正确后转化入大肠杆菌感受态细胞M15,经IPTG 30℃诱导4 h后,SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在。用镍柱对融合蛋白进行纯化,将纯化的蛋白免疫新西兰白兔,采用流式细胞术(FCM)、Western blot法和免疫组化染色对所得多克隆抗体的生物学特性进行鉴定。结果:成功表达及纯化了人ULBP3(aa30-171)重组蛋白。结果显示该多克隆抗体能够识别大肠癌细胞株COLO205表面表达的天然构象ULBP3分子,而且能与结直肠癌组织细胞的ULBP3分子结合。结论:成功构建了原核表达载体pQE30-ULBP3(aa30-171),并获得高纯度的人pQE30-ULBP3(aa30-171)重组蛋白;成功制备了兔抗人ULBP3分子的多克隆抗体。     

Rig-I蛋白C端Helicase结构域的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

目的:为Rig-I蛋白结构与模式识别功能的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测试剂。方法:PCR法克隆小鼠Rig-I基因Helicase区编码序列(726～2240bp,编码241～746位氨基酸),构建带组氨酸标签的原核表达载体pET15b-mRig-I-H,阳性克隆经酶切、测序鉴定后转化E.coliBL21进行诱导表达。目的蛋白电泳分离并割胶纯化后免疫家兔制备抗血清。抗血清用ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法进行鉴定。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,制备的抗Rig-I抗体效价达到1∶100000,Western blot、细胞免疫荧光结果显示该抗体能够有效地对细胞内Rig-I蛋白的表达水平进行检测。结论:成功地对mRig-I-H进行了原核表达、纯化,抗mRig-I-H的多克隆抗体具有较高的特异性,为进一步研究Rig-I尤其是Helicase区的结构与功能奠定了坚实的基础。     

人白细胞介素18的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化人白细胞介素18（hIL-18)，制备兔抗人白细胞介素18多克隆抗体，方法：用RT－PCR扩增出hIL-18的cDNA克隆到原核表达载体pJW2中，转化大肠杆菌JM101中诱导表达并纯化。用纯化的人白细胞介素18免疫新西兰兔制备多克隆抗体，结果：克隆得到序列正确的IL-18 cDNA，与载体连接后转化入大肠杆菌JM101中诱导表达并成功纯化，并用纯化的人白细胞介素18成功制备了兔抗人白细胞介素18多克隆抗体。结论：制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的基因克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:克隆牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB基因、原核表达并制备牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB多克隆抗体。方法:根据牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的DNA序列,设计特异性引物并经PCR扩增其基因。扩增产物经鉴定和测序分析后,与质粒pET-32a(+)重组形成pET-32a-ragB,继而转化大肠埃希菌。IPTG诱导重组蛋白的表达,再通过Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定;获得的重组蛋白行常规家兔免疫,以制备多克隆抗体,并应用ELISA测定抗体效价。结果:PCR扩增获得编码区全长为1506bp可编码501个氨基酸的RagB基因,测序结果与GenBank公布的序列(AJ130872)完全一致;构建了pET-32a-ragB原核表达载体,获得了高表达的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blot表明具有较高的纯度;ELISA结果显示,特异性兔抗RagB的多克隆抗体效价为1×105。结论:在成功构建牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB原核表达载体的基础上,高效表达及纯化了RagB融合蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。为进一步开展牙龈卟啉菌疫苗研究、建立牙龈卟啉菌感染的实验室诊断方法奠定了基础。     

CML66基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的:获得原核表达的新的肿瘤抗原CML66蛋白,并制备兔多克隆抗体。方法:采用RT-PCR技术从睾丸中获得cML66的cDNA,亚克隆至pGEMT载体中,经测序确证后,将该基因插入原核表达载体pET32b( )中,通过电穿孔技术转化E.coli表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2 亲和柱层析纯化。通过SDS-PAGE、Westernblot鉴定后,应用纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:获得的CML cDNA序列与GenBank登录的cDNA序列 一致。用纯化的目的蛋白免疫家兔后,获得高滴度的特异性兔抗血清。结论:成功地克隆CML66基因,建立了原核表达、纯化体系。制备纯化的CML66蛋白和高滴度、特异的兔抗血清。     

人源Nodal成熟肽的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:表达人Nodal成熟肽,免疫小鼠制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达质粒pReceiver-hNodal,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His6-hNodal融合蛋白,融合蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后,回收融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。通过间接ELISA、Westernblot和免疫细胞化学染色和间接免疫荧光等方法检测抗体的效价和特异性。结果:在大肠杆菌中高效表达了与预期理论值大小相符的Mr约13 000的人Nodal成熟肽的融合蛋白,通过免疫小鼠制备的多克隆抗体效价高、特异性强。结论:成功制备了抗人Nodal成熟肽多克隆抗体,为进一步深入研究Nodal在肿瘤发生发展过程中的生物学功能奠定了基础。     

人FasL分子的克隆,表达及多抗制备

目的获得人 Fas L蛋白 ,并对其功能进行初步研究。方法用 DNA重组法构建了 Fas L c DNA和谷胱甘肽转硫酶融合原核表达质粒 p GEX- KG- h FL。将重组质粒转入大肠杆菌 JM10 9,经 0 .2 mm ol/ L IPTG在 37°C条件下诱导 3h,SDS- PAGE检测。用 8m ol/ L尿素溶解的包涵体作为免疫原免疫家兔制备多抗。结果融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的2 0 %。多抗效价达 1∶ 10 2 40 0 ,此多抗可以与重组蛋白发生很好的抗原抗体反应。结论 h FL 在大肠杆菌中得到高效表达 ,为深入研究 Fas L 提供了材料     

结核分枝杆菌调节蛋白RelA的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码结核分枝杆菌调节基因RelA并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗RelA的抗体。方法:利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增RelA基因,构建重组表达质粒pET-32a(+)-RelA;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行镍离子亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Westem blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性;以表达的RelA蛋白免疫家兔,制备抗RelA的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了RelA基因,克隆于表达载体pET-32a(+)中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为120 000的目的蛋白;纯化的RelA免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶6 400以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建RelA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗RelA抗体,效价及特异性均良好,为进一步研究RelA蛋白在结核病中的致病机制奠定了基础。     

人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。     

果蝇硒蛋白D-SelK原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码果蝇硒蛋白D-SelK结构基因并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗D-SelK的抗体。方法:利用PCR从pGM-T-D-SelK质粒中扩增D-SelK基因,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-D-SelK,以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,通过变性、电泳纯化D-SelK蛋白,SDS-PAGE和Westem blot方法鉴定目的蛋白的表达;以表达的D-SelK蛋白免疫家兔,制备抗D-SelK的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了D-SelK基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出目的蛋白,纯化后免疫家兔,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶51 200以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建D-SelK基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗D-SelK抗体,效价及特异性均良好,这为进一步研究功能特异性的D-SelK提供了有效的手段。     

人UNC5CL原核蛋白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建UNC5CL基因的原核表达载体,纯化GST-UNC5CL融合蛋白,并以其为抗原免疫家兔,制备抗人UNC5CL多克隆抗体,并鉴定其反应性和特异性。方法:用PCR方法扩增UNC5CL基因(表达其280-518位氨基酸)片段并克隆至pGEX-4T-2原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21诱导融合蛋白GST-UNC5CL(aa 280-518)表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化,免疫家兔制备抗血清,再采用ELISA、Western blot和免疫组化的方法检测抗体的效价及特异性。结果:测序证实原核重组质粒构建成功;经IPTG诱导,可表达Mr为52 000的GST-UNC5CL(aa280-518)的融合蛋白;谷胱甘肽亲和层析柱纯化的融合蛋白免疫家兔制备的抗血清经Western blot和免疫组化检测证实可识别目的蛋白。结论:制备了兔抗人UNC5CL的多克隆抗体,且抗体对内源性UNC5CL具有较好的反应性和特异性,为进一步研究UNC5CL的功能奠定了基础。     

PBDC1蛋白的表达及其多克隆抗体的制备简

 目的 原核表达、纯化PBDC1蛋白,制备PBDC1多克隆抗体。方法 将PBDC1基因克隆到pET-28a(+)质粒中,构建成重组质粒pET-28a(+)-PBDC1。将此重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导其在宿主菌中大量表达,并进行SDS-PAGE检测。经镍离子亲和柱纯化得到PBDC1融合蛋白,并以此免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果 经质谱鉴定,获得了高纯度的PBDC1蛋白。经Western blot验证,获得了抗PBDC1蛋白的多克隆抗体。结论 成功获得抗PBDC1蛋白的多克隆抗体,为研究PBDC1在红系分化中的功能提供了有利工具。     

人BRDT-NY多克隆抗体的制备及其在消化道肿瘤中的表达检测

目的:构建人BRDT-NY原核表达载体,表达人BRDT-NY原核蛋白,制备其多克隆抗体,检测其在消化道肿瘤中的表达。方法:以质粒pTriplEx2-BRDT-NY为模板,用PCR法扩增人的BRDT-NY基因。将其克隆到原核表达质粒pET28a+中,构建重组质粒pET28a+-BRDT-NY。将该重组质粒转化BL21菌,以IPTG诱导原核蛋白的表达。应用纯化的原核蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA测定滴度,并用免疫组织化学法分析该蛋白在消化道肿瘤组织中的表达。结果:成功构建了用于原核蛋白表达的重组质粒,在BL21菌中表达BRDT-NY重组蛋白,用亲和层析Ni柱进行纯化得到人BRDT-NY蛋白。用纯化的BRDT-NY蛋白免疫小鼠2个月后,得到相应的多克隆血清抗体,经ELISA检测,滴度均能达到1/10万。免疫组织化学染色显示BRDT-NY蛋白在消化道肿瘤中有较高的表达率。结论:该抗体的制备为进一步研究BRDT-NY在消化道肿瘤中的发病机制奠定了基础。