以纤维蛋白胶为载体的注射型骨修复材料对兔桡骨骨缺损修复的实验研究

目的　了解以纤维蛋白胶 (FS)为载体的注射型骨修复材料修复兔桡骨节段性骨缺损的能力 ,为其临床的应用提供实验依据。方法　实验分组为 :实验组b (FS +bFGF +牛BMPbBMP)、对照组b1(FS +bBMP)、实验组r (FS +bFGF +rhBMP- 2 )、对照组r1(FS +rhBMP)、对照组FS。于 70只新西兰白兔右侧桡骨干处造成 1 5cm缺损 ,然后严密缝合皮下组织及皮肤 ,将各组材料经正常皮肤注射骨缺损处 ,术后不同时间进行放射学、组织学和骨密度等方法检查 ,对其成骨效应进行研究。结果　在以bBMP为成骨因子的实验区中 ,实验组b骨缺损区在成骨活跃程度、骨密度和再生髓腔结构等方面均显著优于对照组b1,使骨缺损得到了较彻底的修复 (P <0 0 1) ;同样 ,在以rhBMP - 2为成骨因子的实验区中 ,实验组r骨缺损区在成骨活跃程度、骨密度和再生髓腔结构等方面均显著优于对照组r1,使骨缺损得到了较彻底的修复 (P <0 0 1) ,对照组FS不能产生骨性愈合。结论　以FS为载体复合BMP和bFGF的注射型骨修复材料具有高效的骨修复能力。     

一种新型注射型骨修复材料对犬桡骨骨缺损修复的实验研究

目的 探讨以纤维蛋白胶(fibrin sealant,FS)为载体复合牛骨形态发生蛋白(bBMP)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的注射型骨修复材料修复犬桡骨节段性缺损的效果. 方法 12只家犬随机分为实验组和对照组,每组6只.12只成年健康家犬右侧桡骨中上段造成2.0 cm缺损,制成犬桡骨2.0 cm骨缺损实验模型,然后严密缝合皮下组织及皮肤.对照组和实验组分别经切口周围正常皮肤注射FS和FS bFGF bBMP到骨缺损处,术后4、8、16、24周进行放射学检查,术后24周取标本进行组织学和骨密度检查,研究其成骨效应. 结果 ①影像学:实验组术后4周缺损区有密度较低的骨痂形成;术后24周,皮质完全连接,髓腔再通.对照组术后24周内缺损区均无骨痂生长,骨缺损未得到修复.②骨密度测定:术后24周时实验组的骨密度(456.33±13.74)mg/cm2显著高于健侧(433.33±6.77)mg/cm2(t=2.57,P=0.00)及对照组(0mg/cm2)的骨密度.③组织形态学:术后24周实验组新生皮质骨十分致密,骨皮质连接完整,髓腔完全再通;对照组无新生骨形成,缺损处完全为结缔组织修复. 结论 以FS为载体复合bBMP和bFGF的注射型骨修复材料具有高效的骨修复能力,对家犬的骨缺损有良好的修复效果.     

纤维蛋白胶复合骨形成蛋白的注射型骨修复材料对兔骨髓基质细胞增殖和分化的影响

目的观察以纤维蛋白胶（fibrin sealant，FS）为载体复合骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的注射型骨修复材料对体外培养的兔骨髓基质细胞（marrow stromal cells，MSCs）增殖和分化的影响，为其临床应用提供实验依据。方法取3日龄新西兰兔骨髓进行培养传代，采用第3代细胞进行研究。实验分为3组，实验组：以含1μg／ml rhBMP-2注射型FS培养细胞；FS对照组：以单纯FS培养细胞；空白对照组：不作任何处理。采用细胞培养、组织化学及电镜等方法对各组兔MSCs的增殖、贴壁率、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性及染色、Ⅰ型胶原表达、超微结构及细胞在材料中的生长情况进行观察。结果各组细胞促增殖作用由强到弱依次是：FS对照组→实验组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）；对细胞贴壁率的影响总体由强到弱依次是：FS对照组→实验组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）。各组ALP活性由强到弱依次是：实验组→FS对照组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）；各组细胞的Ⅰ型胶原表达水平由高到低依次是：实验组→FS对照组→空白对照组，差异均有统计学意义（P〈0.05）。扫描电镜观察，材料表面粗糙，有微孔存在，FS对照组、实验组细胞与材料融合生长。透射电镜观察：实验组细胞向成骨细胞分化程度高，但细胞增殖活性较FS对照组稍差；FS对照组细胞向成骨细胞分化的程度较实验组低，细胞增殖活性较好；空白对照组的细胞增殖活性较差，胞外基质少。结论以FS为载体复合BMP的注射型骨修复材料可显著提高MSCs向成骨细胞方向的分化水平，但对MSCs促增殖作用不明显。     

以纤维蛋白胶为载体复合BMP和bFGF的射型骨修复材料诱导异位成骨的实验研究

目的 :了解以纤维蛋白胶 (Fibrinsealant,FS )为载体的注射型骨修复材料异位诱导成骨的作用 ,为其临床的应用提供实验依据。方法 :实验分组为 :实验组b (FS bFGF bBMP)、对照组b1(FS bBMP)、对照组b2 (bBMP)、实验组r (FS bFGF rhBMP 2 )、对照组r1(FS rhBMP)、对照组r2 (rhBMP)、对照组FS及空白对照组。将各组材料注射或植入小鼠肌袋内 ,采用放射学、形态学、碱性磷酸酶 (ALP)检测等方法对其成骨效应进行研究。结果 :在以bBMP为成骨因子的实验区中 ,实验组b具有高效的骨诱导活性 ,其成骨量显著高于对照组b1、对照组b2、对照组FS及空白对照组(P <0 .0 1) ;在以rhBMP 2为成骨因子的实验区中 ,实验组r同样具有高效的骨诱导活性 ,其成骨量也显著高于对照组r1、对照组r2、对照组FS及空白对照组 (P <0 .0 1)。结论 :以FS为载体复合BMP和bFGF的注射型骨修复材料具有高效的骨诱导活性 ,bFGF可明显增强BMP的骨诱导活性。     

经皮注射骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子促进兔骨缺损愈合

作者报告了以聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）作为牛骨形态发生蛋白（ｂＢＭＰ）和基因重组碱性人成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）可溶性载体，将三者的混悬液经皮注射入小鼠肌肉和兔桡骨缺损处的实验研究。经不同时间点的Ｘ线摄片，组织学检查，结果发现成骨量及骨缺损愈合明显高于对照组（Ｐ〈０．０１）。注射入小鼠肌肉后及兔桡骨缺损区，观察到与新骨伴随的血管增生。证实该两种因子的联合植入，成骨作用大于单用骨形态发生蛋白，骨成     

可注射性纤维蛋白胶对兔骨髓基质细胞增殖和分化的影响

目的观察纤维蛋白胶（Fs）对体外培养的兔骨髓基质细胞（MSCs）增殖和分化的影响。方法实验分两组：含有Fs的实验组和不加任何材料的对照组。采用细胞培养、组织化学及电镜等方法对两组MSC的增殖活性、贴壁率、碱性磷酸酶（ALP）表达、Ⅰ型胶原表达、超微结构及细胞在材料中的生长情况进行研究。结果①实验组MSCs的增殖活性和贴壁率明显高于对照组（P〈0．05）。②实验组MSCs的ALP活性显著高于对照组（P〈0．05）。实验组第7天时的ALP活性显著高于第5天时本组的ALP活性（P〈0．05）。实验组MSCs的Ⅰ型胶原表达水平显著高于对照组（P〈0．05）。③扫描电镜观察：实验组MSCs与材料融合生长。透射电镜观察：实验组的MSCs细胞增殖活性好,向成骨细胞方向分化水平高,而对照组MSCs的细胞增殖活性相对较低,分化相对较差。结论FS生物相容性好,对MSCs增殖和向成骨细胞方向的分化均有明显促进作用,可作为骨组织工程材料的注射型载体进行进一步研究。     

BMP/bFGF生物活性材料修复关节软骨损伤的实验研究

[目的]探讨骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)生物材料在关节软骨缺损修复过程中的作用,为内源性修复关节软骨缺损提供实验基础.[方法]取24只14龄成年大白兔随机分成4组,每只动物于双侧膝关节股骨膑股关节面制备直径5mm全层关节软骨缺损模型.钻通骨髓腔.A组应用BMP/bFGF生物活性材料,B组应用BMP生物活性材料,C组应用bFGF生物活性材料,D组单纯应用生物蛋白胶材料.于8、12、24周在大体,光镜及电镜下观察损伤修复效果,组织学评分.[结果]A组于8、12周时,软骨缺损被白色半透明坚硬组织平滑修复,富有光泽,24周时修复组织正常软骨边界模糊,连接紧密,质地坚硬,表面平滑光润.B、C组于8、12、24周时候均未见软骨缺损完全修复,边界清楚,中央凹陷明显残留.D组全程均未见软骨修复.组织学平分A组明显优于B、C、D组,而B、C组之间无差别.[结论]BMP/bFGF生物活性材料可以有效修复兔大面积关节软骨损伤,疗效明显优于单独应用骨形态发生蛋白或碱性成纤维细胞生长因子,为关节软骨损伤治疗提供新的治疗方法.     

重组腺病毒体外诱导山羊骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

目的 探讨腺病毒介导骨形态发生蛋白2(BMP2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)双基因体外转染山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)后目的基因表达与诱导成骨情况. 方法 从2岁健康雌性山羊髂骨处骨穿抽取骨髓2ml,利用密度梯度离心法分离培养山羊BMSCs,将前期构建好的腺病毒载体Ad-BMP2-bFGF、Ad-BMP2分2组,以MOI=5000分别转染BMSCs,每2d用ELISA法检测BMP2和bFGF的表达情况,每周用ALP染色试剂盒及定量试剂盒检测ALP表达情况. 结果 Ad-BMP2-bFGF转染BMSCs 48 h后,目的蛋白已有显著表达(BMP2为3996.22 pg/ml、bFGF为1352.15 pg/ml),第6天达到高峰(BMP2为5146.63 pg/ml、bFGF为1434.75pg/ml),与未转染组比较差异有统计学意义(P＜0.05),3周后细胞呈现明显的成骨改变,ALP活性明显增高(266mol/L),Ad-BMP2-bFGF组ALP表达量约为Ad-BMP 2组的1.5倍(P＜0.05). 结论 经Ad-BMP2-bFGF转染的BMSCs具有持续高水平目的蛋白表达活性,转染后的BMSCs表现出明显的成骨活性,成骨活性明显强于Ad-BMP2组.     

骨形态发生蛋白-2对兔骨髓基质细胞向软骨细胞分化基因表达的影响

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因对兔骨髓基质细胞(MSCs)向软骨细胞分化mRNA表达的影响.方法 从兔骨髓细胞中分离提取BMP-2 mRNA,构建重组BMP-2真核表达质粒,并转染兔MSCs,采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组MSCs内Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达水平.结果 转染后2、4 d实验组MSCs内的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达量28.7±4.0、236.7±48.5及26.9±4.3、208.2±36.7,均明显高于转染后2、4 d的空白对照组(16.1±2.8、99.2±24.8及14.6±2.7、111.1±18.9)和空载体对照组(14.6±2.6、85.4±24.7及16.1±2.8、98.0±22.5)(P＜0.05).结论 重组真核表达载体BMP-2质粒能够诱导MSCs向软骨细胞分化.

Abstract：

Objective To observe the effect of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) on gene expression during the differentiation of marrow stromal cells (MSCs) into chondrocytes. Methods The BMP-2 mRNA was extracted from the rabbit bone marrow cells. The recombinant BMP-2 eukaryotic expression plasmids were constructed and transfected into MSCs. The mRNA expression of type Ⅱ collagen and proteoglycan was detected by using quantitative polymerase chain reaction (PGR) technique. Results At 2nd, and 4th day after transfection of plasmid pEGFP-C3-BMP-2 into MSCs, the mRNA expression levels of type Ⅱ collagen and proteoglycan in MSCs of experimental group were significantly higher than controls (P ＜ 0. 05 ). Conclusion Recombinant eukaryotic expression plastmid pEGFP-C3-BMP-2 can induce MSCs differentiation towards chondrocytes.     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的：研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响。方法：利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞。BMP-2的表达。流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响。结果：转染后，hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达，S期细胞比例和ALP活性明显增高。结论：Ad-BMP-2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖和成骨转化。     

骨生长因子对骨形成的协同作用研究进展

骨形成是一个复杂的过程，其中有成骨细胞、破骨细胞及生长因子等参与，而其中主要是局部的骨生长因子环境。目前，已知参与骨形成的生长因子有：骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、类胰岛素生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、     

双相陶瓷生物活性骨的制备及其细胞相容性研究

[目的]制备一种双相陶瓷牛物活性骨,并了解其细胞相容性.[方法]分离培养兔骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),将浓度为1×106/ml目的第3代MSCs接种于复合有Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白(bone morphogenetk protein,BMP)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)目的双相陶瓷生物骨(bniphask ceramic bioiogic bone,BCBB)上,联合培养,用倒置差显微镜、扫描电子显微镜观察,测定光密度(OD)值,了解双褶陶瓷牛物活性骨BCBB/BMP/bFGF目的细胞相容性.[结果]BCBB孔内充满Ⅰ型胶原、BMP及bFGF.MSCs在双相陶瓷生物活性骨BCBB/BMP/bFGF上黏附生长,第6 d时细胞在材料表面形成致密细胞层,增殖达稳定状态.[结论]该研究制备目的双相陶瓷生物活性骨BCBB/BMP/bFGF具有良好目的细胞相容性.     

成纤维细胞生长因子增强骨形态发生蛋白在小鼠体内骨诱导作用

在啮类动物体内植入骨形态发生蛋白后，引起细胞内一系列生化和形态学变化，在植入物内和其周转形成新骨。这过程受多因素影响。本实验将重组人成纤维细胞生长因子与部分纯化的ＢＭＰ悬液混合后注入小鼠肌肉，观察成骨反应。单独注射牛骨ＢＭＰ组和ｂＦＧＦ组为对照。     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的:研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响.方法:利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响.结果:转染后,hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达.蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达,S期细胞比例和ALP活性明显增高.结论:Ad-BMP-2可高效转染hBMSC,且促进细胞增殖和成骨转化.     

骨软骨移植联合rhBMP -2/bFGF修复软骨缺损

[目的]探讨采用冷冻同种异体骨软骨移植,配合骨形态发生蛋白(rhBMP-2)/碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)修复软骨缺损的效果,为进一步应用于临床提供理论依据。[方法]48只日本大耳白兔,96个关节,随机分A、B、C、D组。A组采用骨软骨移植联合rhBMP-2/bFGF,B组单纯应用骨软骨移植,C组单纯局部注射rh-BMP-2/bFGF混悬液,D组用作空白对照。无菌条件下制作骨软骨缺损模型。术后第4、8、12周作解剖学观察、磁共振检查、组织学检查及软骨细胞记数、免疫组化检查。[结果]A组软骨缺损修复面光滑,呈瓷白色、半透明,B、C组未完全修复,D组无明显修复。A组修复软骨组织学评分与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05),图像分析仪软骨细胞记数与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05)。修复软骨Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。[结论]联合应用冷冻同种异体骨软骨移植、rhBMP-2/bFGF,能促进新生软骨的形成,提高软骨缺损修复的质量。     

rhBMP-2对不同培养时间骨髓基质干细胞成骨能力的影响

目的：探讨不同培养阶段骨髓基质干细胞成骨能力的变化及BMP-2对其成骨能力的影响。方法：培养兔骨髓基质干细胞，测定第3代和第18代细胞碱性磷酸酶及骨钙素活性；测定BMP-2对不同培养时间骨髓基质干细胞成骨能力的影响；测定rhBMP-2对细胞增殖的影响。结果：细胞传至第18代后，分泌的骨钙素（OC）水平及ALP活力明显降低，与第3代细胞相比，差异显著（P〈0．05）。第3代细胞在rhBMP-2的诱导下，分泌的OC水平及ALP活力在原基础上进一步升高，与对照组相比，差异显著（P〈0.05）。结第18代细胞在rhBMP-2的诱导下，分泌的OC水平及ALP活力在原基础上升高，与对照组相比，差异不显著（P〉0．05）；随培养时间的延长，各组细胞数量均有所增加，rhBMP-2诱导组与对照组细胞无显著性差异（P〉0．05）。细胞的传代次数对细胞增殖无明显影响（P〉0．05）。结论：rhBMP-2对细胞增殖无影响。随着传代次数的增加，骨髓基质干细胞的成骨能力下降，rhBMP-2促进其成骨的能力亦下降。     

骨形态发生蛋白2基因治疗在修复骨缺损中对血管化影响的实验研究

目的观察骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因治疗在修复骨缺损中对血管化的影响。方法分离培养兔骨髓基质干细胞（MSCs），经BMP-2腺病毒载体转染后复合异种骨支架移植修复1．5cm桡骨缺损。分为5组：①BMP-2基因转染细胞＋去抗原牛松质骨支架（BCB）；②未转染细胞＋重组BMP-2＋BCB；③对照基因转染细胞＋BCB；④未转染细胞＋BCB；⑤BCB。术后4、8、12周行微血管墨汁灌注、血管内皮生长因子（VEGF）免疫组化染色、组织学等检测。结果术后4周，基因治疗组骨间血管的密度在周边区域较高，通常每一个骨小梁孔隙中都有一支新形成的小血管；透射电镜见成骨细胞总是毗邻血管内皮细胞而存在，并随着微血管的增生而逐渐向骨细胞发展；间质细胞VEGF表达明显增强。结论BMP-2基因治疗可通过上调VEGF表达，间接诱导移植骨血管化，对骨不连、骨缺损的治疗具有重要意义。     

TGF-β和BMP对胎兔颅骨成骨样细胞增殖和分化相互作用的实验研究

目的研究转化生长因子β(TGF-β)和骨形态发生蛋白(BMP)对成骨细胞增殖和分化的影响及其相互作用。方法取胎兔颅骨成骨样细胞进行体外培养，使用不同方法，加入TGF-β与BMP，在不同时间点检测其成骨样细胞增殖和分化的相互作用。结果TGF-β增加成骨样细胞DNA含量，抑制ALP活性、骨钙素的产生和矿化骨基质的形成。而BMP的作用相反。联合应用时，TGF-β减弱了BMP对成骨样细胞骨钙素产生和ALP活性的增强作用，BMP降低了TGF-β对成骨样细胞DNA合成的促进作用。在序惯性给药时，早期(9d)用BMP治疗并不影响随后加入的TGF-β对成骨样细胞ALP活性和基质钙化的抑制作用。而早期(10d)用TGF-β治疗却诱导了随后加入的BMP对成骨样细胞分化的促进作用。结论TGF-β促进成骨细胞增殖，BMP促进成骨细胞分化，它们在各自的不同时期发挥对成骨样细胞增殖和分化的影响。     

BMP-2基因转染对人成纤维细胞生长和增殖的影响

目的：研究人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因转染对人成纤维细胞株KMB-17生长及增殖的影响。方法：将hBMP-2基因导入KMB-17细胞，检测其表达情况及对KMB-17细胞生长和增殖的影响。结果：KMB-17细胞至少可以表达BMP-2基因3周左右；并且增殖指数上升，细胞增殖加剧。结论：人成纤维细胞株KMB-17可以作为靶细胞用于BMP-2基因疗法研究。     

骨形成蛋白-2基因在人骨髓基质细胞中的表达及对其成骨分化的作用

目的利用构建的人骨形成蛋白-2(BMP2)真核表达载体pcDNA3／BMP2，检测其转染人骨髓基质细胞后的表达及对其成骨分化的影响。方法酶切鉴定构建的真核表达载体pcDNA3／BMP2，利用脂质体介导的转染技术，将所构建的载体导入骨髓基质细胞中，体外单层培养。分别于转染后48h和4周采用原位杂交、免疫组化和碱性磷酸酶、钙化学染色方法检测BMP2的基因蛋白表达以及对骨髓基质细胞成骨分化的影响。结果pcDNA3／BMP2酶切片段的大小与理论相符。转染后细胞能检测到BMP2基因和BMP2蛋白表达，并促进成骨转化。结论pcDNA3／BMP2转染骨髓基质干细胞中可获得短暂和长期表达，并加强骨髓基质细胞的成骨分化能力。