藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶（catalase,CAT）。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx．HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

表达藤黄微球菌过氧化氢酶基因的工程大肠杆菌发酵条件优化

目的 优化表达重组藤黄微球菌(M.luteus)过氧化氢酶基因工程菌的发酵条件.方法 以生物量和目标蛋白表达量为判断标准,利用单因子试验和正交试验在摇瓶水平优化初始pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间等影响工程菌发酵制备藤黄微球菌过氧化氢酶的发酵条件.结果 最佳发酵工艺参数:培养基初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,装液量75 mL,接种量6％,培养温度37℃,诱导表达时间5h.蛋白表达量比优化前提高近30％,重组蛋白经Ni-NTA纯化和透析后,酶活性为166.0 U/(mg·protein),以实验条件相同野生菌酶活100.0 U/ (mg·protein)为对照,重组酶的酶活性提高66％.结论 工艺优化后,酶表达量及酶活性均显著提高.     

表达藤黄微球菌过氧化氢酶基因的工程大肠杆菌发酵条件优化

目的优化表达重组藤黄微球菌(M.luteus)过氧化氢酶基因工程菌的发酵条件。方法以生物量和目标蛋白表达量为判断标准,利用单因子试验和正交试验在摇瓶水平优化初始pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间等影响工程菌发酵制备藤黄微球菌过氧化氢酶的发酵条件。结果最佳发酵工艺参数:培养基初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,装液量75 mL,接种量6%,培养温度37℃,诱导表达时间5 h。蛋白表达量比优化前提高近30%,重组蛋白经Ni-NTA纯化和透析后,酶活性为166.0 U/(mg.protein),以实验条件相同野生菌酶活100.0 U/(mg.protein)为对照,重组酶的酶活性提高66%。结论工艺优化后,酶表达量及酶活性均显著提高。     

Aspergillus ficuum内切菊粉酶基因在大肠杆菌中表达

研究内切菊粉酶基因在大肠杆菌中表达,利用基因工程的原理和方法,将来源于Asper-gillus ficuum JNSP5-06的内切菊粉酶基因(endoI)克隆到pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组菌经IPTG诱导后对表达产物进行酶活检测和酶水解产物分析。结果表明已成功构建表达载体pET28a-endoI,表达后的粗酶活为35 U/mL发酵液;重组酶水解菊粉的产物经TLC分析证实酶液具有内切菊粉酶活性,水解产物主要为低聚二糖、三糖和四糖。为其应用和工业化生产奠定基础。     

转谷氨酰胺酶酶原在大肠杆菌中的重组优化表达

茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)转谷氨酰胺酶酶原(pro-transglutaminase,pro-TG)在重组大肠杆菌中的表达量低,限制了其在食品、化妆品、纺织行业中的应用。通过对转谷氨酰胺酶酶原的基因序列进行密码子优化,降低其GC含量,提高了它在大肠杆菌中的表达水平,结果表明经优化后转谷氨酰胺酶原的表达量达到了优化前的4.4倍。为提高转谷氨酰胺酶的比活力,通过基于融合PCR的定点突变技术将转谷氨酰胺酶第二位的丝氨酸突变为脯氨酸,突变后转谷氨酰胺酶的比活力达到了突变前的1.26倍。上述研究结果表明,密码子优化及定点突变技术可以应用于优化转谷氨酰胺酶酶原在大肠杆菌中的表达。     

绿色木霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆

以绿色木霉（Trichoderma viride）的总RNA为模板,根据GenBank上检索的β-葡萄糖苷酶基因bglⅠ（M55080）DNA序列,设计特异性引物,进行PT-PCR扩增bglⅠ片段,将其连接到pMD18-T载体并转化到大肠杆菌JM109测序。测序结果表明,所获得的DNA序列与GenBank上检索的β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列同源性达98.8%。      

重组过氧化氢酶与一种商品过氧化氢酶的性质比较

将重组过氧化氢酶和市售一种商品过氧化氢酶的性质进行了比较。重组酶的最适温度为70℃，某商品过氧化氢酶的最适温度为40℃；与这种商品过氧化氢酶相比，重组酶的热稳定性更好。重组过氧化氢酶和这种商品过氧化氢酶的最适pH都是7．0；重组酶和这种商品过氧化氢酶在pH3-8的范围内均较为稳定；重组酶在室温放置1个月后酶活力基本保持不变，而此种商品过氧化氢酶活力损失约70％；金属离子对重组酶和这种商品过氧化氢酶都有抑制作用，抑制程度有所不同；EDTA抑制这种商品过氧化氢酶的活性，但不抑制重组酶的活性。     

γ-PGA合成酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

研究了γ-PGA合成酶基因pgsBCA在大肠杆菌中的克隆和表达,以pET28a(+)为载体,构建表达载体pET28a(+)-pgsBCA,导入宿主Escherichia coli Rosetta中,诱导使之表达。将发酵液离心去除菌体,得到上清液用旋转蒸发仪浓缩后,采用SDS-PAGE电泳检测重组菌E.coli Rosetta/pET28a-pgsBCA产生的γ-PGA分子量在200-300kDa之间,将产物水解,采用薄层层析法鉴定产物由单一的谷氨酸组成,表明γ-PGA合成酶基因pgsBCA在大肠杆菌中成功表达。     

精氨酸脱亚胺酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化

通过PCR扩增得到菌株编码ADI的arcA基因,并构建表达载体pET24a-ADI。将该载体导入大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达ADI基因的重组菌。对ADI诱导表达条件进行优化,结果发现宿主菌在A600达到1.0时加入0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在30℃诱导4 h酶活最高,为2.04 U/mL发酵液。经超声波破碎、HiPrep DEAE FF阴离子交换层析、SuperdexTM200凝胶过滤层析,可获得SDS-PAGE电泳纯重组精氨酸脱亚胺酶(rADI)。rADI相对分子质量大小为92 600,由两个相同亚基组成,纯化后的rADI比酶活达20.9 U/mg。     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌

以耐高温α 淀粉酶生产菌地衣芽孢杆菌染色体DNA为模板 ,通过PCR扩增耐高温α 淀粉酶基因 ,将扩增产物 1 9kb的DNA片段插入到pUC1 9质粒中 ,再转化大肠杆菌JM1 0 9,通过在淀粉平板上形成透明圈等方法筛选到一株阳性克隆菌株JM1 0 9(pUAM) ,其表达产物可分泌到培养基中 ,除去菌体的发酵液中每 1 0 0mL酶活可达到 2 7个单位。将发酵上清液浓缩后用冷无水乙醇分级沉淀 ,所得样品进行SDS PAGE分析 ,得到分子质量为 60ku的目的蛋白带。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku,同核酸序列测定所推导的值相符。     

对虾抗菌肽PEN-3和PEN-4嵌合基因在大肠杆菌中的表达及抗菌活性测定

目的表达融合2种具有对虾抗菌肽活性的新型抗菌肽。方法利用overlap-PCR连接并扩增对虾抗菌肽Penaeidin-3和Penaeidin-4的嵌合基因序列,定向插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建此嵌合基因的表达质粒。将表达质粒转化至E.coliBL21(DE3),经终浓度1.0mmol/LIPTG分别在37℃和15℃诱导表达4h和14h,SDS-PAGE分析嵌合蛋白质的表达,用抑菌圈法测定产物的抑菌活性。结果获得了含有Penaeidin-3和Penaeidin-4嵌合基因的表达质粒;18%SDS-PAGE电泳显示,大肠杆菌中表达的嵌合蛋白质相对分子质量约14.7×103,主要以包涵体形式存在,包涵体15℃的表达量高于37℃的表达量;包涵体复性后,对枯草杆菌和溶藻弧菌具有明显的抑菌活性。结论实现了2种对虾抗菌肽嵌合基因在大肠杆菌中的表达。     

抗高血压肽在大肠杆菌中表达的研究

本研究根据已经公开发表的具有降血压作用的来源于酪蛋白的一段多肽氨基酸序列CEI12,人工合成了一段双链DNA分子,经酶切后与表达载体pQE16连接,转化进入到大肠杆菌E.ColiJM109和E.ColiDH5嶂校又猩秆〕鲅粜灾刈榭寺。⒔杏盏急泶铮璖DS-PAGE电泳分析和westernblotting蛋白质印迹检测表明,该抗高血压小肽CEI12(与DHFR融合后)在E.ColiJM109中得到了成功表达。     

蛇毒类凝血酶基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

将大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶(Gloshedobin)基因克隆到载体pET32-a(+)上,在T7lac启动子下以N端融合硫氧还蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,诱导条件为:30℃诱导6 h,IPTG浓度为1 mmol/L.利用固定化金属离子(Ni2+)亲和层析分别对胞内可溶物和变性条件下的包涵体进行纯化.通过SDS-PAGE检测融合蛋白的纯度,采用点杂交和纤维蛋白凝结活性检测分析,显示纯化产物具有较高生物活性.     

重组大肠杆菌生产人血管抑素的发酵条件

对重组人血管抑素表达菌株pQE32 AGN的生长及产物表达规律进行了探索,确定了最佳发酵条件.培养温度为37℃,初始pH7.0,OD600为0.8～1.0时开始诱导,诱导持续时间为6h,诱导剂浓度为0.1mmol/L,最终目的产物达到菌体总蛋白的35%,rhAGN的表达量达到560mg/L.     

锰超氧化物歧化酶基因的克隆和在保加利亚乳杆菌中的表达

目的：克隆大肠杆菌锰超氧化物歧化酶摹因(50dA)并在保加利亚乳杆菌(L6032)中表达，以提高该菌对氧的耐受性，同时为SOD发酵奶的研制奠定实验室基础。方法：PCR扩增大肠杆菌sodA，将其克隆入乳酸菌表达载体pMG36e中，并将该重组质粒pMG36e—sod电转入L6032中表达。用SOD测试龠测定SOD的表达活性，同时对L6032及其重组了在MRS平板上的生长情况及其在有氧条件下的存活情况进行比较，初步探讨SOD在L6032中的活性表达对其氧耐受性的影响。结果：构建了重组质粒pMG36e—sod，经酶切和PCR鉴定与预期完全吻合。核酸测序显示插入的sodA片段能正确编码SOD氨基酸序列。利用电转化成功地将重组质粒导入L6032中，SOD的表达活性约590．5NU/mg prot。SOD的活性表达，能增强保加利亚乳杆菌对氧的耐受性，在有氧条件下重组了的生长和存活率都优于原菌。结论：SodA在保加利亚乳杆菌中获得了成功表达，增强了该菌对氧的耐受性，有利于该菌的开发应用。同时也为下一步SOD发酵奶的研制奠定了实验室基础。