新疆边境库车县图兰扇头蜱形态学及分子生物学鉴定

应用数码体视显微镜观察采自新疆库车县羊体寄生蜱虫的形态学特征,应用分子生物学分析方法对采集的蜱虫进行线粒体16S r DNA基因序列扩增、测序,运用MEGA 6.0软件邻接法(neighbour-joining,简称NJ)构建遗传进化树,确定蜱虫的进化生物学特征。结果表明,新疆库车县的蜱种主要为图兰扇头蜱,分子水平上具有较高的生物多样性。     

新疆部分地区蜱传斑点热立克次体的分子流行病学研究

【目的】调查新疆地区斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)在蜱虫中的感染情况及其分布.【方法】2018年4～5月,采用人工布旗法对新疆地区10个县(市)的游离蜱和寄生于家畜体表的蜱虫进行采集并鉴定.对采集的蜱虫提取基因组,利用SFGR特异引物对提取的基因组进行PCR扩增及测序分析,用MEGA 6.0软件构建分子系统进化树.【结果】共采集蜱虫2 079只,经鉴定分析,采集的蜱种包括革蜱属、璃眼蜱属和扇头蜱属3属的7个种.扩增得到了包括拉欧蒂立克次体(Rickettsia raoultii)、斯洛伐克立克次体(Rickettsia slovaca)等在内的4种已知SFGR和2株未定种.对其阳性率进行统计结果表明,不同地区的蜱虫阳性率为40%～80%,平均阳性率为51.5%;不同蜱种间的感染率为1.1%～80%.【结论】通过对新疆地区SFGR病原的流行病学调查表明,被检地区SFGR病原阳性率较高,存在2种病原交叉感染现象,且扩增到的病原多属我国少见的人兽共患病病原.     

新疆南疆羊蜱蝇基于12S rDNA,16S rDNA和18S rDNA基因的分子生物学鉴定

旨在建立羊蜱蝇的分子生物学鉴定方法,从新疆南疆库车县的绵羊体表采集样品,形态学鉴定初步确定为羊蜱蝇,随后进行羊蜱蝇12SrDNA、16SrDNA和18SrDNA基因的扩增和测序,将所得序列进行Blast在线分析和MEGA 5.0分析。结果表明,12SrDNA序列与云南2016年提交的相似性为100%,16S rDNA序列与丹麦2007年、捷克2017年和新疆2017年提交的相似性均为99%,18SrDNA序列与新疆2016年提交的相似性为99%。羊蜱蝇16SrDNA和18SrDNA序列均能与GenBank数据库中已知羊蜱蝇基因序列聚类,且羊蜱蝇种内K2P遗传距离为0～2.3%,通过12SrDNA、16SrDNA和18SrDNA基因的扩增和测序可准确鉴定羊蜱蝇。     

新疆南疆地区微小牛蜱Bm86基因克隆及鉴定

为了克隆及鉴定新疆南疆地区微小牛蜱Bm86基因,参照Gen Bank登录的微小牛蜱Bm86基因序列,设计了可以扩增Bm86基因完整阅读框架的引物,对微小牛蜱进行总RNA提取、RT-PCR、克隆、测序、序列分析。结果表明,获得的Bm86基因长1 953 bp,与Gen Bank中登录号为M29321、HQ014398的微小牛蜱Bm86基因核苷酸同源性分别为99%、97%,且为一个完整的开放阅读框架。本研究获得的微小牛蜱Bm86基因,为获得基因工程疫苗的候选抗原及中国抗微小牛蜱疫苗制备奠定了基础。     

海南4个地区犬体表蜱种鉴定及其无形体携带情况

为研究海南省犬体表蜱虫的种类及其携带无形体的情况,对4个地区犬蜱进行形态学、分子生物学鉴定及进化分析,且基于16S rRNA和gltA基因,通过PCR检测犬蜱携带无形体的情况。形态学及分子生物学鉴定结果表明,所有蜱类为血红扇头蜱（Rhipicephalus sanguineus）,基于蜱虫线粒体16S rDNA基因的系统发育树表明,研究中所获得的HN-01和HN-02基因序列处于不同的遗传进化分支,HN-01与已知的来自美国的血红扇头蜱(MH018842)处于同一分支,HN-02与来自泰国（KC170744）的血红扇头蜱处于同一分支,与我国甘肃省、北京市所获得的血红扇头蜱（JF979377、KC203362）序列亲缘关系较远。基于扁平无形体（Anaplasma platys）gltA基因的PCR结果表明,犬蜱携带有扁平无形体,其阳性率为1.1%(6/546)。基于16S rRNA基因的PCR检测结果表明,研究中获得的犬体表蜱未携带嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma pagocytophilum）和牛无形体（Anaplasma bovis）。     

新疆南疆部分地区3种璃眼蜱的分子生物学鉴定

旨在对新疆南疆部分地区璃眼蜱属的蜱进行分子生物学鉴定,了解其分布情况。采集新疆南疆部分地区蜱,通过形态学鉴定将璃眼蜱属蜱作为样本,通过12SrDNA和16SrDNA基因扩增、测序及序列分析进行蜱种类鉴定。13个采样点共559只璃眼蜱属蜱,鉴定为3种,分别为小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。     

海南竹柏扁枝植原体基于16S rRNA和tuf基因的分类及系统进化分析

对采自海南省万宁市的表现竹柏扁枝病的竹柏植株总DNA进行植原体16S r RNA基因和tuf基因克隆、测序,分别获得竹柏扁枝植原体16S r RNA基因(1 806 bp,Gen Bank登录号:KJ848639)和tuf基因(845 bp,Gen Bank登录号:KX645669)片段。对竹柏扁枝植原体16S r RNA基因序列进行虚拟RFLP分析,结果表明,竹柏扁枝植原体属于花生丛枝植原体组U亚组(16Sr II-U)成员(相似系数为1.00)。对tuf基因进行序列比对和系统进化分析,结果表明,竹柏扁枝植原体与同属16Sr II组的植原体亲缘关系最近,其次为16Sr I组植原体。本研究从亚组水平上确定了竹柏扁枝植原体的分类地位,并克隆分析了竹柏扁枝植原体的tuf基因,为竹柏扁枝植原体的系统分类和病害防控提供了基础信息。     

中国七省(区)牛蜱的种类鉴定及其携带无形体的分子检测

为了确定牛体表寄生硬蜱的种类及其携带无形体的状况,从河南、湖南、海南、四川、贵州、广东和广西采集牛体表寄生硬蜱572只,通过形态学和分子生物学方法对硬蜱进行种类鉴定;同时用PCR方法检测硬蜱体中无形体感染情况。经形态学和分子生物学鉴定,结果 572只牛硬蜱均为微小扇头蜱,且存在A、B、C等3个分支。基于无形体的16S rRNA基因序列分析的结果表明,微小扇头蜱携带无形体,其阳性率为38.8%(222/572),其中边缘无形体、山羊无形体、扁平无形体和嗜吞噬细胞无形体分别为23.6%(135/572)、7.3%(15/572)、5.3%(42/572)、2.6%(30/572),仅在湖南的牛蜱中发现存在无形体混合感染情况。微小扇头蜱C分支的发现尚属首次,且以边缘无形体感染率最高。     

新疆南疆地区牛羊寄生蜱类调查研究

为了明确新疆南疆牛羊寄生蜱类,有效防制本地区蜱及蜱传病。2013年4~8月期间,采集新疆南疆牛羊寄生蜱样,利用传统分类鉴定方法进行蜱类调查研究。结果表明:共采获蜱1 584只,隶属硬蜱科8个属和软蜱科2个属,以扇头蜱属(Rhipicephalus)和璃眼蜱属(Hyalomma)为羊蜱优势属类,分别占羊总蜱数的57.8%、19.80%;璃眼蜱属(Hyalomma)、扇头蜱属(Rhipicephalus)和血蜱属(Haemaphysalis)为牛蜱优势属类,分别占牛总蜱数的34.18%、30.36%、22.96%。本次调查结果和前人研究结果略有差异。     

枯草芽孢杆菌特异性PCR快速检测方法的建立和应用

参照Gen Bank中登录的枯草芽孢杆菌16S r RNA基因,设计1对引物,扩增片段大小为460 bp的基因片段,该方法对枯草芽孢杆菌检测的灵敏性为1pg总DNA量,对枯草芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,成功地建立枯草芽孢杆菌PCR检测方法,且该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点。     

内蒙古草原革蜱的鉴定、人工饲养及生活史观察

为了解内蒙古草原革蜱的发育生活史,同时为草原革蜱及其蜱传病的研究提供可控、充足的试验材料。对采自内蒙古地区的蜱进行形态学和分子生物学鉴定,以小鼠为唯一供血动物,在实验室自然光照条件下进行人工饲养,观察记录该蜱的生活史周期及生物学特性。结果表明,形态学结合分子生物学方法鉴定为草原革蜱;饱血雌蜱产卵期为13～18 d,日均产卵量约219枚,总产卵量达2 680～4 050枚;蜱卵经25～29 d孵化为幼蜱,孵化率达到93.33%;幼蜱吸血期为4～6 d,蜕化期为4～15 d,蜕化率达到80.89%;若蜱吸血期为4～8 d,蜕化期为12～21 d,蜕化率达到68.10%。说明成功建立内蒙古草原革蜱实验室人工饲养方法,明确从饱血雌蜱产卵至下一代成蜱平均需90.66 d。     

亚洲璃眼蜱成蜱不同发育期miR-451与MIF表达谱的动态分析

【目的】microRNA （miRNA）作为一类内源性的非编码RNA,仅有18-25 nt,其广泛存在于动植物细胞中,可诱导生物基因沉默,参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。以亚洲璃眼蜱为研究对象,对miR-451及其靶基因（巨噬细胞游走因子, MIF）在相互作用关系进行分析。【方法】参考miR-451成熟体序列（AAA CCG UUA CCA UUA CUG AGU UU）来自研究单元亚洲璃眼蜱高通量测序所获得的结果。根据该成熟体序列设计stem-loop及PCR引物,RT-PCR扩增获得蜱源性miR-451序列;并对不同物种来源的miR-451序列特征进行分析。基因合成方法获得抑制miR-451的dsRNA序列,用于亚洲璃眼蜱饥饿成蜱体内注射。参考美洲钝眼蜱MIF基因（登录号：AF289543.2）,设计亚洲璃眼蜱的特异性实时荧光定量引物,以β-actin作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR方法检测注射dsRNA后亚洲璃眼蜱饥饿成蜱不同发育时间点MIF基因的表达水平,以及miR-451的表达谱特征。【结果】琼脂糖凝胶电泳检测miR-451的PCR产物条带与预期大小一致,为72 nt。不同物种来源的miR-451具有较高的保守性,特别是种子序列极度保守,仅在短尾负鼠miR-451成熟体的19位点处存在A→U的突变。miR-451的RNA干扰实验证实,0-30 h miR-451表达逐渐上调,6 h达到最高值,其拷贝数为1.0×108。随后表达丰度逐渐降低。30 h其表达水平与PBS对照组相同。48-60 h miR-451再次出现一个表达上调微小变化过程。而miR-451抑制后的MIF直到30 h才有表达的上调,42 h达到峰值（拷贝量仅为9.0×103）,此后其表达规模受到抑制,48 h时与PBS对照组水平一致。84 h后表达才逐渐上调,直到90 h达到峰值,并呈现正态分布趋势。【结论】利用RT-PCR获得亚洲璃眼蜱成蜱阶段miR-451序列,生物信息学方法分析了miR-451序列在不同物种间具有较高保守性。miRNA的保守性决定其靶标基因的特异性,因此,以上结果提示miR-451在动物细胞中可能扮演重要的生物学功能,是MIF功能发挥的一个重要调控因子。MIF作为miR-451靶标基因,其功能的实现可能受该miRNA的调控。基于此类推测qPCR及RNA干扰分析表明,miR-451参与了MIF的表达调控。且是一种负调控作用。当miR-451表达量升高时,MIF表达量明显下调。此研究首次证实miR-451在亚洲璃眼蜱成蜱发育阶段的表达是一种普遍现象,且对MIF存在负调控作用。这一研究为后期miR-451参与蜱的免疫应答及miR-451与靶标基因的相互作用机制提供了参考。同时证明,miRNA参与基因功能的调控具有一定的特异性和时序性。     

鲢鳙打印病豚鼠气单胞菌主要特性及系统发育学分析

对从鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)鳙(Aristichthysnobilis)打印病病死鱼中分离到的豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae),进行了形态与理化特性等方面较系统的表观分类学指征鉴定。同时择代表菌株(HC960704-1)进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树;HC960704-1的16SrRNA基因序列长度为1416bp(GenBank登录号:AY966888),与GenBank数据库中的气单胞菌16SrRNA基因序列的相似性在98%和100%。     

云纹石斑鱼和赤点石斑鱼杂交子一代线粒体相关基因的母性遗传特征分析

对云纹石斑鱼和赤点石斑鱼及其正反杂交子代的3种线粒体基因(COⅠ、16S rDNA、Cyt b)和核基因Tmo-4c4进行序列分析,其中16S rDNA序列中有明显的插入缺失位点,而其他3个基因序列无插入缺失变异。在12个分析样本中,COⅠ同源序列(387 bp)中共检测到41个核苷酸多态性位点,16S rDNA(529 bp)中有21个核苷酸多态位点,Cyt b(383bp)中有49个核苷酸多态位点。Tmo-4c4(467 bp)有8个核苷酸多态位点。序列差异分析和遗传距离比较结果显示,正反杂交子一代的3个线粒体基因序列与母本基因序列的同源性都为100%,与父本的基因序列同源性分别为COⅠ:90%和89.4%;16S rDNA:96%和96%;Cyt b:87%和87.2%。核基因Tmo-4c4正反交子一代与母本的序列同源性为98.9%~99.6%之间,与父本的同源性为98.7%~99.4%之间,没有明显的遗传差异。以上结果表明了云纹石斑鱼和赤点石斑鱼杂交子一代在3种线粒体基因上严格按照母性遗传的规律,而核基因Tmo-4c4没有明显的遗传偏向性。     

The Midgut Bacterial Flora of Laboratory-Reared Hard Ticks,Haemaphysalis longicornis,Hyalomma asiaticum,and Rhipicephalus haemaphysaloides

Ixodid ticks play an important role in the transmission of a variety of zoonoses of viral, bacterial and protozoan origin, and they also harbor a wealth of microorganisms. To gain more detailed insights into the potential interactions between bacterial flora and tick-borne pathogens, we investigated the midgut bacterial flora of laboratory-reared Haemaphysalis longicornis, Hyalomma asiaticum and Rhipicephalus haemaphysaloides. Based on morphological, biochemical, and 16 S rDNA sequencing results, we identified 15 species belonging to 12 genera in the midgut of the three ticks. The bacterial communities were similar to those found in other studies of hematophagous arthropods. Kocuria sp. was the most frequently isolated species and its 16 S rDNA gene sequence was very similar to Kocuria koreensis P31 T. To our knowledge, this is the first report of the bacterial flora of tick midguts and the results show that there were many different bacterial species in each tick species. Among the most common genera, there may have been a novel species in the genus Kocuria. The results might be the first step for looking for different aspects of the pathogen and tick interaction.     

嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因克隆及系统发育

[目的]确定嗜热蛋白酶生产菌DPE7的系统发育地位。[方法]通过PCR方法扩增出嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因片段,并对其进行了克隆和测序。[结果]对该序列在GenBank中的BLAST结果表明,相似性高于99%的序列中大部分是泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列,其中与Geobacillus toebii T1680的16 S rRNA基因序列相似性达99.60%。对菌株DPE7和其他13株泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列进行系统发育分析,菌株DPE7与其中的4株泥土芽胞杆菌聚类在一起。[结论]经16 S rRNA基因序列同源性比较和系统发育分析,确定菌株DPE7为泥土芽胞杆菌。     

一株放线菌的分子鉴定与抗菌谱研究

[目的]对具有抗菌开发前景的放线菌Q13菌株进行分子鉴定和抗菌谱测定,为其进一步开发和利用提供理论依据。[方法]以Q13基因组为模板,分别利用大肠杆菌和链霉菌属16S rRNA基因特异引物,扩增其16S rRNA基因序列并测序,利用Blast、MEGA等软件进行序列与系统发育树分析,鉴定其分类地位;进一步利用平板对峙试验,测定Q13菌株对玉米小斑病菌等14种植物病原真菌、胡桃肉状菌等2种食用菌病原真菌和双孢蘑菇等10种食用菌的抑菌活性。[结果]获得3条16S rRNA基因序列,GenBank登录号分别为JN593095、JN593096和JN5930957;根据序列分析的结果,确定Q13菌株为Streptomyces flavotricini;Q13菌株对小麦赤霉病菌、稻瘟菌、油菜菌核和绿色木霉具有显著抗性,而对双孢蘑菇、蛹虫草、灰树花、香菇、姬菇和平菇等食用菌菌丝生长无抑制作用。[结论]为开发植物和食用菌病害生防菌提供了理论和试验支持。