转石蒜凝集素基因烟草的抗蚜虫性

利用农杆菌介导法将质粒pBILRA转化烟草(Nicotianatabacum L.),该质粒含有由花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)引导的筛选基因新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)及石蒜凝集素基因(lra).通过卡那霉素筛选获得了25株独立转基因烟草植株.Western blot分析表明,石蒜凝集素蛋白在不同转基因植株中表达量不同.对转基因T1代植株的遗传分析表明,lra基因在大多数独立转基因植株后代中以孟德尔3:1的分离比方式遗传.抗虫试验表明,表达较高水平石蒜凝集素蛋白的转基因烟草对桃蚜种群的生长具有明显的抑制作用.首次报道了表达石蒜凝集素基因的烟草对蚜虫具有抗性.石蒜凝集素基因可用于植物抗虫基因工程研究及应用.     

掌叶半夏凝集素基因PPA2抗蚜功能分析

掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta Agglutinin,PPA)基因属于单子叶甘露糖结合凝集素家族,具有抗虫活性。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从掌叶半夏幼叶中克隆到1个新的凝集素基因,命名为PPA2,其开放阅读框长408 bp,编码135个氨基酸,有一个甘露糖保守结合域,包含3个甘露糖专一结合位点。分别构建了由35S启动子和韧皮部特异性启动子At PP2驱动的植物表达载体,农杆菌介导的叶盘法转化烟草后,经鉴定获得了单拷贝插入高表达量的纯合转基因烟草株系。通过Western-blot分析,将获得的转基因纯合株系按蛋白表达水平分成高、中、低3类并进行抗蚜试验,结果表明这些转基因烟草均具有明显抗蚜效果,35S-PPA2转基因植株平均抑蚜率极高,而3种蛋白表达类型的At PP2-PPA2转基因植株普遍低于35S启动子驱动下的转基因植株。PPA2可以作为高效抗蚜候选基因,具有重要的应用价值。     

表达昆虫特异性神经毒素AaIT基因的转基因烟草的抗虫性

经改造的昆虫特异性神经毒素AaIT基因插入植物高效表达载体得到重组质粒pNGY-2。重组质粒中AaIT基因5＇端与烟草花叶病毒(TMV)的Ω序列3＇端融合,受两个串联的35S启动子控制,通过土壤农杆菌LBA4404介导转化烟草NC89,经NPTⅡ选择后再经GUS染色挑选出阳性再生植株,Southern blotting进一步证实了AaIT基因已经整合到烟草基因组中,对棉铃虫(Heliothis armigera)的抗虫实验表明,转基因烟草有显著的抗虫活性。     

绿色荧光蛋白基因(GFP)在抗虫转基因植物研究中的应用(英文)

用合成的cry1Ac基因与绿色荧光蛋白基因 (GFP)构成融合蛋白基因 ,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg ,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下 ,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光 ;经抗虫试验、PCR、Southernblot和Westernblot等检测 ,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因 ,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统 ,简化了抗虫转基因植物筛选程序 ,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

绿色荧光蛋白基因（G卯）在抗虫转基因植物研究中的应用

用合成的crylAc基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)构成融合蛋白基因,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光;经抗虫试验、PCR、Southern blot和Western blot等检测,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统,简化了抗虫转基因植物筛选程序,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

转双抗虫基因烟草的研究

用改造的雪花莲凝集素基因GNAmm与合成的苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白cry1Ac基因构建了带有双价基因的植物表达载体,在该表达载体中这两个基因的转录分别受笋瓜PP2启动子(SPP2P)和CaMV 35S启动子的调控。通过根癌土壤杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。PCR检测及基因组DNA Southern blot\,Slot blot杂交分析的结果表明Gna基因和Bt基因已整合到烟草总DNA中。用Bt毒蛋白抗血清进行Western blot分析,转基因植株均有Bt杀虫蛋白的不同程度的表达。对转化再生烟草的虫试结果表明,在所受试的19株烟草中60%的植株上的棉铃虫在5天内死亡率达到100%,而且存活幼虫的生长发育受到明显抑制;蚜虫抑制生长试验表明,多数转化再生植株具有较强的抗蚜活性,平均能够抑制桃蚜50%～60%的蚜口密度,有的高达80%以上。以上结果表明利用这两个改造过的抗虫基因可以获得既抗虫又耐蚜的转双抗虫转基因植物。     

伪狂犬病毒gD基因在转基因烟草中的表达

将猪伪狂犬病毒 (pseudorabiesvirus ,PRV)最主要的保护性抗原基因gD完整编码区亚克隆到修饰的植物双元表达载体pBI 35SL中 ,使其置于强启动子CaMV 35S doubleenhancer TEV 5′UTR下游 ,构建的转基因植物双元表达质粒经农杆菌介导转化烟草 .PCR检测叶片筛选阳性植株 ,Southern杂交进一步证实gD已整合到转基因烟草基因组中 .固相酶联斑点试验和Western印迹表明 ,gD在烟草获得正确表达并具有抗原性     

高效Bt抗虫基因表达结构的构建及其在转基因烟草中表达行为的研究

构建了高效植物表达载体pBinMoBc,其携带有超强表达复合启动子OM及Ω因子控制下的CryIA?基因,作为对照,本实验构建了含有CaMV35S启动子控制下的CryIA?基因的植物表达载体pBinoBc。分别使用两个植物表达载体转化烟草,ELISA检测表明,在pBinMoBc转基因烟草中CryIA?基因的平均表达水平是pBinoBc的2.44倍,最高可达可溶蛋白的0.255%。抗虫检测结果表明,pBinMoBc转基因烟草与pBinoBc转基因烟草相比,具有更强的抗棉铃虫效果。上述结果表明,OM启动子比CaMV 35S启动子更具有实际应用价值,此结果在植物抗虫基因工程研究中具有重要意义。     

人工合成的植物化猪α乳清蛋白基因在转基因拟兰芥的表达

将一个398bp的植物化的猪α乳清蛋白基因(Lactalbumin,LA)编码区克隆到带有花椰菜花叶病毒的35S启动子的质粒中。对它们进行PCR检测和序列分析,证实这些阳性克隆是实验预期的重组质粒。随即将35S启动子-α-乳清蛋白基因-终止子这一表达单元克隆到双元载体pCG-CB中,用该重组质粒双元载体pCG-CB-Lact转化农杆菌V3101后,以农杆菌法进行拟兰芥植物转化,用除草剂Finale对转化植物进行抗除草剂基因筛选,得到一些抗除草剂的转化植株。对这些抗除草剂植株进行猪α乳清蛋白基因PCR分析,成功筛选到带有猪α乳清蛋白基因并且可以在后代稳定遗传的转基因植物。Western blot蛋白质表达分析,表明猪α乳清蛋白在拟兰芥中成功表达,并且猪仅乳清蛋白被正确加工成天然蛋白。     

棉花乙烯合成基因促进拟南芥和烟草不定根发生的研究

从棉花纤维cDNA中克隆获得乙烯合成基因GhACO3,构建了植物过量表达载体p35S::GhACO3.通过花序侵染法和叶盘法分别转化拟南芥和烟草,利用卡那霉素筛选及分子检测获得转基因阳性拟南芥和烟草植株.结果表明,GhACO3基因已整合到拟南芥和烟草基因组中;经过纯合筛选后获得转基因T2代拟南芥植株;与野生型拟南芥相比,GhACO3基因对拟南芥不定根发生具有显著促进作用;与野生型烟草植株相比,转GhACO3基因烟草不定根发生得到了显著的促进.研究表明,GhACO3基因的过量表达能够促进拟南芥和烟草不定根的形成发育,为进一步探讨GhACO3的生物学功能和进行转基因育种奠定了基础.     

导入Ghabp1基因对烟草叶细胞发育的影响

将棉花生长素结合蛋白基因cDNA与CaMV35S启动子和NOS终止子融合,构建了一个新的表达载体pGABP1-121,采用农杆菌介导法转化烟草,经过分化、筛选和再生,得到了具有卡那霉素抗性的植株。抗性植株经PCR及Southern杂交检测,证明外源目的基因已经整合到烟草基因组中。扫描电镜观察发现转基因烟草与对照相比叶细胞增大,结果表明,棉花生长素结合蛋白基因的表达影响了烟草叶细胞的发育。     

苎麻CCoAOMT基因cDNA反义转化模式烟草'WS38'

苎麻咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CCoAOMT)是其木质素合成过程的一种关键酶,运用克隆的该酶基因cDNA及植物表达载体pBI121、pWM101,分别构建了35S启动子控制的苎麻CCoAOMT基因反义cDNA基因质粒(pBI121-antiBnCCoAOMT)和cDNA全长表达质粒(pWM101-BnCCoAOMT),并通过根癌农杆菌介导法将其转化至模式烟草WS38,获得了转基因烟草.对转基因植株进行分子分析和组织学初步研究表明,转反义RNA基因植株叶柄木质素含量较野生烟草或转正义基因烟草叶柄木质素含量降低.说明运用反义RNA技术对CCoAOMT基因的表达进行基因工程调控,一定程度上可以对木质素的合成产生干扰,为获得低木质素或木质素组分改良的苎麻基因工程奠定基础.     

导入Ghabpl基因对烟草叶细胞发育的影响

将棉花生长素结合蛋白基因cDNA与CaMV35S启动子和NOS终止子融合,构建了一个新的表达载体pGABPl—121,采用农杆菌介导法转化烟草,经过分化、筛选和再生,得到了具有卡那霉素抗性的植株。抗性植株经PCR及Southern杂交检测,证明外源目的基因已经整合到烟草基因组中。扫描电镜观察发现转基因烟草与对照相比叶细胞增大,结果表明,棉花生长素结合蛋白基因的表达影响了烟草叶细胞的发育。     

绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼细胞中的表达

主要研究绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼(缘管浒苔)细胞中的表述.应用绿色荧光蛋白基因、抗除草剂bar基因、CMV 35S启动子和SV40双启动子构建了质粒载体PSV-bar-ZsGeen,采用改进的PEG法将质粒载体PSV-bar-Zs-Geen导入到缘管浒苔原生质体中,经过细胞培养发育再生藻株,通过除草剂筛选出阳性藻株,且转化率达38.58％,进一步PCR分子检测和显微荧光检测表明,绿色荧光蛋白基因在转基因植株中得到表达,为今后转基因浒苔研究奠定基础.     

烟草花叶病毒装配起始位点反义RNA表达型中间载体的构建

利用基因工程方法培育抗病毒植物新品种的途径之一,是在植株中建立一个产生病毒基因组功能片段的反义RNA的系统。本工作设计并合成了一段烟草花叶病毒(TMV)装配起始位点反义RNA的基因,再以pBR 325为基本质粒,构建了包含带有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和PolyA信号的反义RNA表达单元,以及为筛选转基因植株所必须的NPT-Ⅱ表达单元的中间载体,为以后经土壤农杆菌而获得转基因烟草植株打下了基础。     

隐地蛋白(cryptogein)基因定点突变及其广谱抗病烟草转化植株的获得

用PCR法从隐地疫霉 (Phytophthoracryptogea)基因组DNA中克隆了cryptogein(Cry)基因。将Cry基因的 13位赖氨酸 (K)突变成缬氨酸 (V) ,获突变基因CryK13V ,并将其构建于CaMV35S启动子控制的植物表达载体上。通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草 ,经卡那霉素抗性筛选获 33株再生植株 ,PCR检测和Southern杂交分析表明CryK13V基因已整合到烟草基因组中。接种试验结果表明 ,转基因烟草植株对黑胫病菌、赤星病菌和野火病菌等的抗性均有提高。Northern杂交分析表明 ,微弱的CryK13V基因在转化植株中的表达就足以激活PR1和OPBP1等防卫反应相关基因的表达 ,而且表达丰度与转基因植株的抗病性有着一定的正相关性。研究结果还表明 ,隐地蛋白13位上的赖氨酸在诱导细胞死亡中起着关键的作用。     

北非蝎昆虫毒素AaHIT1基因的原核表达和转基因分析

将北非蝎昆虫毒素 (AndroctonusaustralisHectorinsecttoxin ,AaHIT1)基因克隆入温度诱导表达载体pBV2 2 0 ,并在宿主菌E .coliDH5α中进行诱导表达 .表达定位分析发现 ,AaHIT1大部分存在于包涵体中 .蛋白质N 端测序证实了体外表达的AaHIT1蛋白的正确性 .将AaHIT1基因转化入烟草中并获得了转基因植株 ,基因组PCR、RT PCR及Northern印迹分别证实AaHIT1基因已正确地插入到烟草基因组中并已得到表达 .抗虫实验表明 ,该转基因烟草对白粉虱有明显的抗性 .该研究为蝎毒AaHIT1的生物学毒性实验以及获得抗虫转基因作物奠定了基础     

利用烟草表达人源性胰岛素样生长因子1

构建了由花椰菜花叶病毒35S启动子引导人源性胰岛素样生长因子1基因(igf-1)的表达载体pCAM-BIA1301-35S promoter-igf-1-nos,并利用根癌农杆菌LAB4404介导,将其导入烟草。经潮霉素抗性筛选、GUS检测和PCR鉴定,获得17棵转基因植株。RT-PCR分析结果显示,igf-1能够在转基因烟草中正常转录。本试验为利用烟草以及其他双子叶植物高效表达便于分离纯化的IGF-1药用蛋白研究奠定了重要的基础。     

双价抗虫基因叶绿体共转化植株抗虫性及其后代表型分析

利用基因枪法将含有水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC)基因烟草叶绿体表达载体和含有苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白基因(Bt cry IAc)烟草叶绿体表达载体,共转化烟草叶绿体,获得壮观霉素抗性植株。转基因植株抗棉铃虫试验表明,转双价抗虫基因植株比转单一抗虫基因植株具有更强的杀虫活性。转基因植株后代Southern检测及其遗传学分析试验证明,双价抗虫基因可以稳定地遗传给后代,且表现为叶绿体特有的母系遗传规律。 Abstract:The Bt gene and OC gene were cotransformed to tobacco chloroplast with particle bombardment method and spectinomycin resistance tobacco seedlings were obtained.Bioassays showed that the transgenic tobacco containing both genes had enhanced toxicity to the larvae of cotton bollworm (helicoverpa zea) by comparison with the plants containing only Bt or OC gene.Southern-blotting analysis and genetic analysis of progenies showed that the Bt and OC gene expressed and was inherited maternally to the progenies.     

两种凝集素基因在转基因烟草中表达的研究

构建了含尾穗苋凝集素基因(ACA)的cDNA序列和改造后的雪花莲凝集素基因(GNA)的植物表达载体pBACG。在此表达载体中,ACA和GNA基因的表达分别由35S启动子和CoYMV启动子控制。通过农杆菌介导,将ACA和GNA基因转化到烟草中,经卡那霉素筛选获得60株转化再生植株。对PCR检测呈阳性的50株植株进行接蚜虫实验,结果表明,其平均抑虫率达83．9％。Southern blotting分析表明,ACA和GNA基因都已整合到烟草基因组中。Western blotting结果显示这两个基因在不同植株中都可表达其相应的蛋白质,但表达水平不同。部分Western blotting分析呈阳性植株的抗蚜性与T0代相近,达85．3％,说明这两个基因的抗蚜功能可以稳定遗传。