LAMP技术在食品致病菌检测中的研究进展

环介导的恒温扩增(LAMP)是近年来发展起来的一种新的恒温核酸扩增技术,该技术具有特异性强、敏感性高、反应快、设备简单等特点,已被应用于病原菌诊断、食品致病菌检测等领域的研究。本文重点阐述了近年来国内外学者应用LAMP技术在食品致病菌检测中的研究进展。     

基于酶联适体竞争法检测谷物制品中真菌毒素的研究

核酸适体作为一种新型分子识别元件,具有可体外合成、易修饰、稳定性好等优势,被认为是抗体的良好替代物.自玉米赤霉烯酮(ZEA)核酸适体被成功筛选以来,基于核酸适体与靶标的高特异性结合,构建了酶联适体间接竞争法检测玉米赤霉烯酮的新方法.ZEA与ZEA适体互补链DNA1竞争性结合酶标板上固定的ZEA适体,未结合的DNA1链被...     

四环素抗性基因tet(A)荧光RAA检测方法的建立及应用

为了实现快捷、准确检测抗生素抗性基因，提高环境监测与治理能力，建立了一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided amplification, RAA)的四环素抗性基因tet(A)的快速检测方法.该检测方法以tet(A)基因序列保守区为靶序列，设计其RAA引物，筛选并优化RAA引物探针，建立荧光tet(A)-RAA快速检测方法.结果表明，该tet(A)-RAA法在39℃恒温条件下30 min内即可特异性实现对tet(A)基因片段的有效扩增，与无抗性细菌均无交叉反应.且采用该方法对18个环境样品进行检测，阳性率为100%,与qPCR方法检测结果一致.该四环素抗性基因tet(A)的检测方法灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简便，可用于对抗性基因tet(A)的快速检测，也为开发其他抗生素抗性基因快速检测方法提供了参考.     

一种松材线虫快速检测的新技术

利用新型的等温扩增技术实现了松材线虫的快速检测。研究中通过改进核酸提取方法,只需95℃处理5min就能完成线虫核酸释放。通过在反应开始前加入核酸扩增显色染料,实现了扩增结果的肉眼可视化判定。实验结果表明;整个等温扩增反应过程只需50min,可以检测单条线虫,反应只需恒温进行。因此,该方法为松材线虫的快速检测提供了一种简单、有效的工具。     

溶藻弧菌的依赖于核酸序列恒温扩增检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖于核酸序列恒温扩增(NASBA)检测体系,对溶藻弧菌进行检测。采用溶藻弧菌的hsp60基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测溶藻弧菌的NASBA检测法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明:所建立起的NASBA检测方法,灵敏度为6.9×102 cfu.mL-1,高于普通PCR方法。溶藻弧菌的依赖于核酸序列恒温扩增检测方法具有较高灵敏度和和良好特异性,并且对仪器要求更低,用普通恒温设备即可进行反应,具有广阔的推广前景。     

一种新孢子虫病实时RPA快速检测方法的建立及应用

犬新孢子虫(Neospora caninum)引起的新孢子虫病严重影响着养牛业的发展,目前对于该疾病尚无有效治疗的药物或疫苗.为了提高对新孢子虫病的诊断及预防,根据犬新孢子虫中特异性保守基因NC-5建立了一种新型实时RPA检测方法;同时进行了特异性以及敏感性试验,并应用该方法对国内养牛场收集的32份临床样品进行了检测.结果表明:所建立的实时RPA检测方法结果准确、操作便捷,仅需25 min即可得到检测结果.在特异性试验中仅有犬新孢子虫发生了特异性扩增,其余对照病原体在检测中均未有扩增结果;在敏感性试验中最低检测限为37拷贝/反应;在32份临床样品试验中有16份阳性样品,与已有检测技术相比,准确率达100％.说明该方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优势,为新孢子虫病的快速检测奠定了基础.     

迟缓爱德华氏菌等温扩增快速检测方法的建立

迟缓爱德华氏菌是一种危害淡水及海水水产动物的致病菌,可感染包括鳗鲡、牙鲆、罗非鱼、鲤鱼等在内的多种水产鱼类,极易给水产养殖业造成严重的经济损失.现有的迟缓爱德华氏菌检测方法须借助实验室条件才能完成,检测过程较为复杂.建立一种简便的、无需依赖实验室条件即可快速检测迟缓爱德华氏菌的方法,对水产养殖业预警和该病菌引发病害的防治具有重要指导意义和实用价值.针对迟缓爱德华氏菌的基因组设计了特异性引物和探针,建立了重组酶聚合酶扩增与侧向流试纸条(RPA-LFS)相结合的检测方法,评价了该方法的特异性和灵敏度,并使用人工模拟样本进行了方法验证.结果显示,RPA-LFS法在37℃孵育20 min即可完成核酸扩增步骤,整体检测时间不超过40 min,与参试的嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌这8种水产和食品中常见的致病菌不发生交叉反应,对迟缓爱德华氏菌培养物的检测限为单次反应1个菌落形成单位(CFU),在富集培养后,可检出1×101 CFU/g人工污染样本中的迟缓爱德华氏菌.该方法具有良好的特异性和灵敏度,不依赖精密仪器,是一种快速、便捷的迟缓爱德华氏菌检测方法,具有良好的应用前景.     

PCR-核酸薄膜层析法检测创伤弧菌

采用自行建立和优化的PCR-核酸薄膜层析检测体系,对创伤弧菌(Vibriovulnificus)进行检测。采用创伤弧菌的vvhA基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测创伤弧菌的PCR-核酸薄膜层析检测法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明,所建立起的检测法灵敏度为3.6×102 cfu·mL-1,比PCR-琼脂糖凝胶电泳检测方法高一个数量级。创伤弧菌的PCR-核酸薄膜层析检测方法具有较高灵敏度和良好特异性,操作简单,检测速度快,同时又保护了操作人员的身体健康,具有广阔的推广前景。     

河南省交通通达水平对新型冠状病毒传播的影响

为研究河南省交通通达水平和交通管制对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)传播的影响,本文以新冠肺炎(COVID-19)作为流行病传播研究对象,分析交通管制前后累计病例的空间分布状况;采用公路密度、铁路密度、航空站点通航城市数量、离武汉距离等指标计算各县市区交通通达水平;采用地理加权回归分析方法探究交通通达水平对新型冠状病毒传播影响力大小的空间差异。结果表明:(1)新冠肺炎确诊病例呈现在河南南部集中、北部零星分布的特征,而交通通达水平在北部以郑州、洛阳为中心形成高值区片区,在南部南阳、信阳两市辖区形成孤立的较高值区。(2)交通管制进一步促进确诊病例从地市下辖各县向市辖区集中。(3)较高的交通通达水平对病毒传播具有加速作用,影响力高值区集中于郑州—南阳—信阳"L"型区域,而商丘市在采取强有力的交通管制之后,传播影响力下降明显。(4)距离因素虽然对南阳、信阳辖区内的病毒传播有一定加剧作用,但是整体传播趋势仍然受交通通达水平影响。     

锁核酸和不对称扩增辅助的等位基因多重引物识别KRAS基因突变的研究

RAS突变的检测为指导结直肠癌的预测和预后提供了有力的工具。探讨一种简洁、低成本的用于检测KRAS基因突变的多重引物等位基因识别方法(multiplex primer allelic discrimination, MP_mAD)。利用不对称扩增和含锁定核酸(locked nucleic acid, LNA)的等位基因特异性引物、以及共同的反向引物和探针,进行多重孔检测和参考孔检测,以多重检测和参考检测的扩增循环数值差(ΔC_q)来判定结果。同时使用福尔马林固定石蜡包埋组织(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues, FFPET)样本或在野生型基因组DNA背景下混合质粒进行非临床性能评价,并采用Kappa检验比较MP_mAD与Sanger测序的结果一致性。该方法对KRAS热点突变检测灵敏度至少为3%;凝胶电泳也验证了方法的特异性;重现性的变异系数(coefficient of variation, CV)<15%;同源基因检测未观察到交叉反应。通过分析115例FFPET标本...     

基于双适体识别化学发光成像技术检测血小板衍生生长因子

以血小板衍生生长因子(PDGF-BB)为研究对象,利用核酸适体与其特异性识别作用,采用辣根过氧化物酶(HRP)作为标记物,催化luminol-H_2O_2化学发光体系,通过化学发光成像技术建立PDGF-BB双适体识别生物传感器,实现对PDGF-BB的高灵敏检测。线性范围是0~10nmol·L~(-1),检测限0.87nmol·L~(-1);且具有良好的选择性,可实现人体血浆等复杂样品中PDGF-BB的特异性检测。     

嗜水气单胞菌RPA-LFS快速检测方法的建立

根据嗜水气单胞菌的气溶素(aerolysin,aerA)基因设计了特异性引物和探针,基于重组酶聚合酶扩增结合侧向流试纸条(RPA-LFS),建立了嗜水气单胞菌的快速检测方法.结果显示:建立的嗜水气单胞菌RPA-LFS检测方法在37℃孵育20 min即可完成;与其他水产养殖与食品安全致病菌无交叉反应;检测限为单次反应10 CFU.结果表明,建立的RPA-LFS检测嗜水气单胞菌的方法具有快速、特异、灵敏等优点,不依赖精密仪器,适用于实验资源有限的嗜水气单胞菌现场检测.     

应用依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测副溶血性弧菌

以副溶血性弧菌的tlh基因为目的片段设计特异性引物,成功建立了恒温条件下快速检测副溶血性弧菌的依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)的检测法,进行了特异性和灵敏度实验,并与普通PCR方法进行了比较。该HDA检测方法最低检测限为19.9ng·mL-1,与普通PCR方法相当。副溶血性弧菌的HDA检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。     

定量检测幽门螺杆菌感染的胶乳比浊试剂研究

将重组表达的幽门螺杆菌(Hp)上的尿素酶B(UreB)蛋白与黏附素(HpaA)蛋白通过化学反应,偶联到聚苯乙烯微球上,并置换到保存液中,制备出幽门螺杆菌的抗体检测试剂2(R₂)。结合抗原抗体反应特性及降低血清中非特异性吸附,制备出幽门螺杆菌的抗体检测试剂1(R₁)。R₁与R₂搭配使用构成了定量检测人血清中幽门螺杆菌的抗体检测胶乳试剂盒。可以发现,制备20 mL胶乳R₂,包被幽门螺杆菌UreB蛋白与HpaA蛋白各1.6 mg,同时聚苯乙烯微球粒径为190 nm时,试剂效果最好。该试剂盒通过对1 000例常州本地随机临床样本与室间质评样本进行评测,发现常州本地随机临床样本的阳性率为34.6%,室间质评样本的检测结果与上海临床检验中心公布结果一致,试剂盒性能较好。     

基于核酸适配体的荧光传感器检测赭曲霉毒素A

为了实现对食品中赭曲霉毒素A的快速检测,利用带有羧基荧光基团(FAM)的核酸适配体(Apt-FAM)与带有黑洞猝灭基团(BHQ1)的互补链cDNA-BHQ1,构建了简单、快速检测食品中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)的荧光传感器。研究结果表明：当OTA不存在时,Apt-FAM通过碱基互补配对与cDNA-BHQ1结合,荧光基团FAM靠近猝灭基团BHQ1,通过荧光共振能量转移作用抑制荧光基团FAM的信号;当OTA存在时,OTA与Apt-FAM结合形成G-四链体单链结构,G-四链体远离cDNA-BHQ1,荧光信号增强。通过试验条件的优化,选择最优检测条件：互补链为cDNA1-BHQ1、孵育时间为60 min、cDNA与Apt用量比为1∶1、反应体系的pH值为7.4。在最优检测条件下,传感器检测OTA的线性范围为0.5～100 ng/mL,线性方程为y=31.934 98+41.714 94lg(C_OTA),R²=0.997,最低检出限为0.13 ng/mL。利用该传感器检测玉米粉和葡萄酒样品中的OTA,平均回收率分别为100.0%～...     

快速实时荧光定量PCR检测猪繁殖与呼吸综合症病毒方法的建立

为建立一种快速准确检测猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的基于TaqMan实时荧光定量PCR方法,根据猪繁殖与呼吸综合症病毒的ORF7保守序列分别设计引物和TaqMan探针,在常规PCR的基础上,设计并优化基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测PRRSV的方法。结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR体系相关系数大于99%,扩增效率为97%,具有良好的线性关系。利用建立的方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本脑炎病毒(JEV),结果均为阴性,说明此方法具有较好的特异性。灵敏度试验表明该方法检测极限为5copies/μL;应用建立的方法对58份血清样本和60份组织样本进行检测,共检测出14份阳性血清和10份阳性组织。这些结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的PRRSV实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、灵敏度、重复性,可为临床检测PRRSV提供更高效的技术平台。     

毛细管电泳法测定饮料中的铅

应用毛细管区带电泳 (CZE)法 ,采用 1 0mmol/L咪唑作为背景电解质 ,1 0mmol/Lα -羟基乙酸作为选择性改性剂 ,在pH4.0 ,分离电压为 2 5kV ,柱温为 2 2℃的电泳条件下 ,采用间接紫外检测 ( 2 1 4nm) ,在 4min内分离测定了饮料中的铅 .方法简便、快速、灵敏度高、重现性好、测定成本低 .     

压电型分子印迹传感器对棉酚的检测

为了减小棉酚检测的检测周期,降低检测成本,以分子印迹修的银晶振作为传感器敏感元件,提出了一种新型压电分子印迹传感器.通过对棉酚和其相似物的检测,证实了压电型分子印迹传感器的灵敏性和特异性.结果表明:该传感器的最低检测限为6μg·L~(-1),检测范围为6~16μg·L~(-1)(相关系数R~2=0.999 6),响应时间为15min;在特异性检测中,该传感器对棉酚的响应频率显著高于相似物.     

人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的SAA1定量检测新方法.利用大肠杆菌BL21(DE3)原核表达人血清淀粉样蛋白A1(SAA1),根据BL21(DE3)表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段,构建表达载体pET-28a-SAA1,采用CaCl2法制备BL21(DE3)感受态,热激转化法将pET-28a-SAA1转入到BL21(DE3).经表达条件优化,获得重组蛋白最佳诱导表达条件:温度30℃,时间6h,转速180rpm/min,培养基pH 7.0,IPTG浓度0.4mM,诱导表达后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,Ni柱纯化、透析、浓缩从而获得浓度为8.09mg/ml,纯度为85%的SAA1.同时,结合胶体金标记技术,建立了SAA1胶体金免疫层析试纸检测方法,线性范围0.16~500μg/ml,最低检测限0.16μg/ml,该研究为临床体外诊断SAA1快速检测提供技术基础.