糖尿病基因治疗的实验研究I.人胰岛素基因真核细胞表达…

为有效开展糖尿病基因治疗，作为第一步，本研究构建了人胰岛素原基因与表达载体ＰＲＣ／ＣＭＶ的重组体。首先，从质粒ＰＢＣＡ中酶切回收２６０ｂｐ的人胰岛素原基因片段，利用中间载体ＰＢＳ．ＳＫ构建了含人胰岛素原基因片段的过渡质粒ＰＢＳ．ＩＮＳ，在此基础上构建了真核细胞表达的人胰岛素基因重组体ＰＲＣ／ＣＭＶ．ＩＮＳ。     

卵巢癌的p53基因治疗实验研究——人野生型p53基因真核细胞表达质粒的构建

目的 :本实验构建了人野生型 p53基因与真核表达载体 pc DNA3的重组体 ,为进行卵巢癌基因治疗研究打下基础。方法 :利用分子生物学基因克隆技术从质粒 p GEX-p53中用双酶切下目的片段 ,挤压法回收与 pc DNA3构成重组体。结果 :成功的构建了人野生型 p53基因真核细胞表达质粒。结论 :带有两个不同的酶切位点的目的片段定向克隆的方法使重组体的构建高效简便 ,挤压法回收目的片段经济有效。     

重组人胰岛素原基因质粒在糖尿病鼠体内表达的安全性初步研究

目的初步研究重组人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(RHPGP)在糖尿病大鼠体内的安全性。方法将三碘甲腺原氨酸(T3)和肝细胞生长因子(HGF)注射入糖尿病鼠体内后,导入RHIGP,检测血糖、血清谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN),进行24h饥饿试验以及组织病理学检测和逆转录病毒复制完整型病毒(RCR)的检测。结果实验组大鼠血糖明显下降,饥饿试验中未有低血糖事件发生;实验组动物的ALT、ALB、CRE和BUN与正常组大鼠无统计学差异;病理检测光镜下未见癌细胞及异形核细胞;未检测到野生型逆转录病毒。结论我们构建RHIGP体内表达实现了安全性调控;RHIGP应用于活体动物是安全的。     

人胰岛素原基因胰外表达重组体的构建及鉴定

目的:构建胰外表达成熟胰岛素的重组体.方法:将人胰岛素原基因进行二处突变,突变后的胰岛素原基因与逆转录病毒载体pLXSN重组并转染肝癌细胞.提取肝癌细胞基因组DNA,PCR方法鉴定人胰岛素原基因与载体重组结果及在肝癌细胞基因组中整合情况.同时测定成熟胰岛素的表达.结果:胰岛素原基因已整合到肝癌细胞基因组.突变的胰岛素原可被广泛存在的furin酶识别,在培养基内检测到较高浓度的成熟胰岛素.结论:成功构建胰外表达成熟胰岛素的突变人胰岛素原基因逆转录病毒重组体.     

人生长激素的真核细胞表达质粒的构建及鉴定

目的　构建人生长激素的真核细胞表达质粒。方法　用双酶切从 pUC19-GHcDNA中克隆出生长激素基因 ,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3中 ,行酶切和测序以鉴定。结果　重组的真核细胞表达质粒 pcDNA3-GHcDNA所含的GHcDNA序列和插入方向均正确。结论　本实验所构建的重组真核细胞表达质粒 pcDNA3-GHcDNA为进一步研究GH在体内表达的生理和病理作用有一定意义     

人胰岛素原C肽基因高效表达载体的构建

目的：构建一种快速、高效的人胰岛素原C肽基因的表达载体，为有效地提高重组C肽的产量奠定了基础。方法：以人胰岛素原C肽的基因序列为基础，运用DNA重组技术构建出含5个拷贝的头到尾连接的C肽基因片段的高效表达载体。结果：通过酶切鉴定和DNA测序分析证实，实验成功地构建了人胰岛素原C肽基因的表达载体pMAL—C2E—C5.结论：人胰岛素原C肽基因表达载体pMAL—C2E—C5的成功构建，为进一步研究在大肠杆菌中表达人C肽融合蛋白，继而获得高产的单体C肽奠定了基础。     

基因重组人胰岛素和动物胰岛素治疗糖尿病的疗效比较

近年来许多研究表明，胰岛素不仅对治疗1型糖尿病治疗是必需的，而且对治疗2型糖尿病，越早使用胰岛素治疗亦显得十分重要。为观察人胰岛素诺和灵R和动物普通胰岛素治疗糖尿病的疗效和不良反应。我院2002年1月至2003年8月共收治2型糖尿病患者74例，现将观察结果报道如下。     

重组人胰岛素基因在大鼠肝癌细胞中的调节表达

目的:探讨转染含有葡萄糖反应元件(GLRE)的重组人胰岛素基因大鼠肝癌细胞中不同葡萄糖浓度下胰岛素的分泌情况。方法:利用含有重组质粒[PLXSN-(GLRE)3-BP-1MpINS]的逆转录病毒转染大鼠肝癌CBRH7919细胞,筛选出阳性细胞克隆,调整葡萄糖浓度,测定培养液中胰岛素值。结果:转染后38 h,葡萄糖浓度为0,5,15,25 mmol/L,胰岛素分泌量分别为(5.03±0.72),(9.57±0.49),(32.60±1.96),(43.90±2.30)IU/L,各组间差别显著(P<0.05);转染后1个月,在上述葡萄糖浓度下,胰岛素分泌量分别为(3.57±0.21),(5.30±0.20),(16.27±0.87),(23.23±1.12)IU/L,各组间差别显著(P<0.05)。结论:构建的重组人胰岛素基因具有随培养液中葡萄糖浓度升高调节胰岛素分泌的能力。     

基因重组人胰岛素过敏2例

利用基因重组技术生产出来人胰岛素不仅与人体分泌的胰岛素结构完全相同 ,而且纯度更高 ,比以前临床上广泛应用的主要从牛和猪胰脏提取的普通胰岛素的过敏反应少 ,甚至在一些对普通胰岛素严重过敏的病人换用基因重组人胰岛素仍能达到良好疗效[1 ] 。我们从 1996年起一直使用诺和诺德公司生产的诺和灵系列 ,降糖效果不错 ,病人依从性好 ,副作用少 ,受到患者欢迎。但在临床应用过程中 ,我们仍发现两例过敏现象 ,报告如下。1　临床资料　　病例 1:男性 ,76岁。患者 1985年诊断为糖尿病 ,长期口服降糖药治疗。 1986-1997年因糖尿病血糖控制不良 …     

壳聚糖介导人胰岛素基因在糖尿病鼠体内外表达的研究

目的研究壳聚糖介导人胰岛素基因在糖尿病鼠体内外转染及表达。方法采用壳聚糖体外转染鼠成纤维细胞,对转染后72h的细胞应用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达。27只糖尿病大鼠随机分为3组(pCMV.INS组、pCMV组、生理盐水组),体内转染通过尾静脉注射糖尿病大鼠,检测空腹血糖和胰岛素。结果pCMV转染细胞无胰岛素表达,pCMV.INS转染大约10%的细胞有胰岛素表达;pCMV.INS转染大鼠血浆胰岛素显著高于生理盐水对照组(P<0.01)和pCMV对照组(P<0.01)。结论人胰岛素基因可通过壳聚糖直接转染至糖尿病大鼠体内发挥治疗作用及壳聚糖可能是一种很有前途的基因载体。     

人胰岛素突变体基因的融合表达

目的　以 pTXB1作为融合表达载体 ,构建人胰岛素突变体 (M insulin)的基因表达克隆 ,表达及纯化。 方法　基因合成胰岛素突变体的cDNA序列 ,酶切后装入融合表达质粒 pTXB1,基因测序正确后转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,诱导表达 ,初步纯化。结果　融合蛋白的分子量约为 330 0 0 ,表达量占菌体总蛋白的 5 0 %以上。融合蛋白主要以包涵体的形式存在 ,洗涤包涵体后融合蛋白的纯度达到 85 %以上。Western blot表明表达蛋白具有胰岛素抗原活性。活性测定显示 ,每升诱导培养后的菌液表达产物中 ,具有的放射免疫活性为 0 .5U。结论　成功地构建了人胰岛素突变体的融合表达体系 ,为进一步的研究奠定了基础。     

基因重组人胰岛素治疗糖尿病63例疗效观察

我科应用合成人胰岛素及胰岛注射笔治疗糖尿病63例，观察治疗效果及治疗达标时与动物胰岛素(普通胰岛素)治疗在日用量等方面的差别，现报告如下：     

非胰岛素依赖型糖尿病与胰岛素基因实验研究

从非胰岛素依赖型糖尿病患者外周血的白细胞中提取ＤＮＡ，以胰岛素基因５‘－末端上游的某一ＤＮＡ序列为引物，对特定的靶序列进行体外扩增，即ＴａｑＤＮＡ聚合酶链反应，将其扩增产物进行电泳分离，在紫外分析仪下观察结果并与正常人对照，发现１例ＮＩＤＤＭ的Ｍ患者胰岛素有所改变，提示此型糖尿病患者的胰岛素基因改变可能是导致ＮＩＤＤＭ遗传因素之一。     

非胰岛素依赖型糖尿病与胰岛素基因实验研究

从非胰岛素依赖型糖尿病（NIDDM）患者外周血的白细胞中提取DNA．以胰岛素基因5’－末端上游的某一DNA序列为引物，对特定的靶序列进行体外扩增，即TaqDNA聚合酶链反应（PCR），将其扩增产物进行电泳分离，在紫外分析仪下观察结果并与正常人对照，发现16例NIDDM的M患者胰岛素基因有所改变，提示此型糖尿病患者的胰岛素基因改变可能是导致NIDDM遗传因素之一。     

人胰岛素原突变体重组逆转录病毒及稳定包装细胞系的构建和鉴定

目的　构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　采用PCR重叠延伸定点突变技术 ,将普通细胞内Furin蛋白酶的识别和切割位点Arg X Lys Arg 样序列 ,引入人胰岛素原C肽两端 ,同时加上信号肽、Kozak序列和酶切位点并克隆至逆转录病毒载体 pLXSN中 ,测序正确后转染包装细胞PA317,经G4 18筛选后挑选稳定生产病毒的细胞株 ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果　测序证明胰岛素原cDNA的 5个预定位点成功突变 ,其上游加上了信号肽和增强表达的Kozak序列 ;G4 18筛选重组pL mPIN SN转染PA317细胞抗性克隆 ,其病毒滴度为 2 .6× 10 5CFU/ml,而且基因组PCR和病毒液的RT PCR都显示有 2 86bp的条带 ,提示构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功。结论　成功构建了携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及包装细胞系 ,为进一步胰岛素基因治疗糖尿病的实验研究奠定了基础     

人胰岛素基因在幼仓鼠肾细胞中的表达及降血糖实验研究

目的: 构建并筛选人胰岛素基因真核高效表达载体.方法:常规法构建重组质粒pEF1α-ImINS.将重组质粒pEF1α-ImINS和胰岛素其他3个重组质粒分别转染幼仓鼠肾(BHK)细胞,经G418筛选,阳性克隆传至20代,分别用放射免疫和免疫组化技术分析胰岛素和(或)胰岛素原在BHK细胞中表达的情况.并用重组质粒pEF1α-ImINS转染BHK细胞的阳性克隆20代的PBS细胞悬浮液(5×107个/只)及其培养上清(0.5 ml/只)对昆明小鼠行腹腔注射,通过对注射前后小鼠血糖值测定,分析转基因产物降血糖的生物学效应.结果:胰岛素的表达量最高为7.984 μIU/ml ,胰岛素表达水平的灰度值在BHK细胞质中为177.5±15.10,细胞核中为150.3±21.43;昆明小鼠注射pEF1α-ImINS转染BHK克隆细胞株的悬浮液后6 h与注射前24 h血糖值比较,差异极显著(P<0.01).结论:BHK细胞中重组质粒pEF1α-ImINS是胰岛素表达量最高的质粒;pEF1α-ImINS转染的克隆细胞株在小鼠体内有胰岛素表达,并且对正常小鼠有降血糖的作用.     

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染半月板细胞的实验研究

我们在实验中观察了不同区域半月板细胞在体外单层培养时的形态差异，并采用脂质体介导人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF—Ⅰ)基因转染半月板细胞，以期为生物学方法修复半月板缺损提供基因修饰的种子细胞。     

肌肉注射大鼠胰岛素原基因治疗糖尿病大鼠的研究

目的:研究肌肉注射大鼠胰岛素原基因重组表达质粒转基因治疗对糖尿病大鼠血糖和胰岛素分泌的影响.方法:链脲佐菌素(STZ)诱导SD大鼠糖尿病模型,经肌肉注射将大鼠胰岛素原基因重组表达质粒pCMV/proinsulin DNA裸质粒直接导入糖尿病大鼠体内,与转染同等剂量pCMV空载质粒的对照组比较,观察糖尿病大鼠血糖的影响以及体内胰岛素表达的变化.结果:①接受肌肉注射重组质粒的治疗组(A组)糖尿病大鼠血糖下降约4 mmol/L,且能维持1～2周,血浆胰岛素水平明显升高,并持续表达2周;②肌肉注射胰岛素原基因治疗后,治疗组血糖明显低于接受pCMV空载质粒对照组(B组)和糖尿病对照组(DM组)(P＜0.05),治疗组胰岛素浓度也明显高于这两个对照组(P＜0.05);③肌肉注射治疗组大鼠的骨骼肌能检测到大鼠胰岛素原基因mRNA的表达,而对照组则为阴性;治疗组大鼠胰腺胰岛素原基因mRNA的表达量也明显高于对照组;④免疫组化结果显示,肌肉注射治疗组大鼠骨骼肌组织可见胰岛素表达,而对照组则无表达;治疗组胰腺组织胰岛素含量较对照组明显增高.结论:糖尿病大鼠裸质粒肌肉注射转基因治疗可获得胰岛素的有效表达,并有效降低糖尿病大鼠的血糖水平.     

重组人胰岛素治疗胰岛素抗体阳性的糖尿病患者临床观察

糖尿病患者应用外源性动物胰岛素治疗可能产生胰岛素抗体（ＩＡｂ） ,这将对糖尿病的治疗产生不利影响。笔者对治疗后产生ＩＡｂ的糖尿病患者使用重组人胰岛素进行治疗 ,效果较好 ,报道如下。糖尿病患者３１例 ,男性２０例 ,女性１１例 ,年龄１５～７８岁 ,平均５１．５±２４．４岁 ,病程３月～２９年 ,平均７．５±５．６年。其中２型糖尿病２５例 ,１型糖尿病６例 ,均使用了猪胰岛素 ,其中单用猪胰岛素者９例（１型糖尿病６例 ,２型糖尿病３例） ,猪胰岛素联合磺脲类降糖药２２例（均为２型糖尿病） ,均因空腹血糖（ＦＢＧ）控制不佳而入…