凋亡素特异性抗肿瘤效应的分子机制及其应用

凋亡素（apoptin）特异性抗肿瘤效应与其分子结构、在不同细胞的定位、磷酸化调节等多种因素相关。在动物模型实验中，apoptin诱导肿瘤凋亡没有明显的不良反应，是一种非常有潜力的抗肿瘤制剂。     

凋亡素体外抗膀胱癌效应观察及应用前景分析

目的:观察凋亡素诱导不同膀胱癌细胞株凋亡的效果并结合文献评价其临床应用前景.方法:采用凋亡素原核表达载体pBV220/Apoptin、真核表达载体PCDNA3、人膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87及EJ、RT-PCR试剂盒以及质粒提取试剂盒.将原核表达载体中的Apoptin基因克隆入真核表达载体PCDNA3,经双酶切及基因测序鉴定无误后,利用脂质体转染法将真核表达质粒PCDNA3/Apoptin转染膀胱癌细胞株BIU-87及EJ.然后于转染后24h利用RT-PCR观察基因表达情况,并分别于转染后24、48、72h利用透射电镜检测肿瘤细胞超微结构变化、MTT法检测细胞存活率、流式细胞仪TUNAL法检测各组细胞的凋亡率,并对结果行统计学分析.结果:成功构建真核表达载体PCDNA3/Apoptin并转染膀胱癌细胞株BIU-87及EJ.转染24h后,通过RT-PCR法可见凋亡素基因在细胞内表达,并于转染后不同时段观察到实验组细胞发生高效凋亡,并随时间的延长而逐步升高,转染后72h,两种细胞株的凋亡率约为65%,而MTT法所测细胞存活率约为25%.与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).同时通过透射电镜可观察到实验组多数细胞出现凋亡的超微结构变化,如核边集、核碎裂及凋亡小体等.结论:凋亡素可诱导不同的膀胱癌细胞株发生高效的凋亡.考虑到其具有与小分子化疗药物不同的作用机制,我们认为凋亡素有可能成为克服膀胱癌细胞多药耐药性的新途径之一.     

凋亡素体外诱导表达Survivin膀胱癌细胞凋亡效果观察

目的:观察凋亡素对表达Survivin膀胱癌细胞株的作用效果,并结合相应机制探讨其临床意义.方法:利用免疫组织化学法检测膀胱癌细胞株BIU-87中Survivin的表达水平,并计算平均每高倍镜视野中阳性细胞比率.将肿瘤细胞分为单纯细胞组、转染空质粒pCDNA3组及转染pCDNA3/Apoptin组,利用脂质体转染法将真核表达栽体pCDNA3/Apoptin及pCDNA3空质粒转染入膀胱癌细胞中,并于转染后24h通过RT-PCR法检测细胞中Apoptin的表达情况.分别于转染后24、48、72h利用MTT法检测各组细胞存活率,并利用流式细胞仪TUNEL法检测各组细胞的凋亡率.结果:利用免疫组织化学法检测发现膀胱癌细胞株BIU-87中Survivin呈高表达状态,平均每个高倍镜视野中阳性细胞比例约70%,并有较多细胞呈现高表达状态.转染后24h通过RT-PCR法可见Apoptin在膀胱癌细胞中表达.分别于转染后24、48、72h利用MTT法检测各组细胞存活率,发现转染pCDNA3/Apoptin组肿瘤细胞存活率均明显低于对照组,差别有统计学意义(P<0.05);利用流式细胞仪TUNEL法检测各组细胞的凋亡率,发现转染pCDNA3/Apoptin组肿瘤细胞凋亡率均明显高于对照组,差别有统计学意义(P<0.05).结论:凋亡素可在体外诱导高表达Survivin的膀胱癌细胞株BIU-87高效凋亡,结合相关机制表明凋亡素可在一定程度上克服Survivin的抗凋亡作用,因此有可能成为Survivin拮抗的抗肿瘤药物的协同用药选择.     

Livin抗凋亡机制与肿瘤

细胞凋亡是由多种因子介导的细胞主动死亡的过程,对机体或组织维持内环境的稳定和生物体的生长发育、生命周期、衰老死亡都有着重要的作用。凋亡抑制也是肿瘤发生的重要机制,凋亡通路的紊乱、促进凋亡因子的抑制、凋亡因子的过表达以及凋亡基因的表达失控都会导致肿瘤的发生和发展。而且,凋亡紊乱还会导致肿瘤对化疗的抵抗。     

顺铂诱导原代培养人膀胱癌细胞的凋亡

目的：探讨顺铂诱导原代培养膀胱癌细胞发生调亡变化的特征及机制。方法：以0-100umol/L浓度顺铂处理原代培养膀胱癌细胞12-72小时,应用MTT法检测细胞增殖抑制变化。分析其与凋亡指数（AI）的关系;用光镜和透射电镜分别观察膀胱癌细胞凋亡变化的特征。结果：顺铂能够明显地诱导膀胱癌细胞凋亡,具有一定范围内的作用时间和药物浓度依赖性,与细胞增殖抑制密切相关。膀胱癌细胞凋亡的镜下特征为胞膜完整,胞浆浓缩,核碎裂、萎缩或边积,胞浆外突形成凋亡小体。结论：证实顺多功能铂诱导膀胱癌细胞广泛性凋亡是它产生杀瘤效应的途径之一。     

膀胱肿瘤细胞凋亡及其对预后的影响

目的 :探讨细胞凋亡与膀胱癌临床生物学行为的关系。方法 :采用末端脱氧核苷酸转移酶介导缺口末端标记法 (TUNEL)进行膀胱癌细胞凋亡的检测。结果 :49例膀胱癌标本共有 43例 (87 76 % )发生细胞凋亡 ,细胞凋亡指数为 (45 6 6± 12 49) % ,细胞凋亡指数大小与病人年龄、性别、肿瘤大小、数目无关 (P >0 0 5 ) ,与肿瘤分级、分期呈负相关 (P <0 0 1) ,即肿瘤“瘤级”和“瘤期”越高 ,则细胞凋亡越少 ,易复发肿瘤其细胞凋亡指数明显小于不复发肿瘤 (P <0 0 5 )。结论 :膀胱癌细胞凋亡与肿瘤分级、分期及预后有关。膀胱癌细胞凋亡减少提示肿瘤分化差、易浸润 ,且病人预后较差。     

重组hB7—2卡介苗对人外周血免疫细胞抗膀胱肿瘤作用的实验研究

目的探讨分泌人共刺激分子B7—2的重组卡介苗（rBCG）对人外周血单个核细胞（PBMC）IFN-α表达、免疫增强及杀伤膀胱癌细胞的作用。方法SDS—PAGE和ELISA检测rBCG的表达产物hB7—2;rBCG和野生型BCG（wBCG）分别与PBMC共同培养,以单纯PBMC为对照,在不同时段收集培养液上清,经ELISA法检测上清液中IFN—α的表达水平;将BCG激活杀伤细胞（BCG activated kille rcell,BAK细胞）与人膀胱癌EJ细胞共同培养,采用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验检测活化免疫细胞对膀胱癌细胞的杀伤作用。结果ELISA法检测出培养上清液hB7—2含量为3．8U／ml。rBCG诱导PBMC产生细胞因子的表达明显高于同浓度的wBCG组（P〈0．05）;rBCG诱导的PBMC抗癌效应高于对照组诱导的抗癌效果（P〈0．05）。结论rBCG诱导人PBMC高表达IFN-α,并通过增强人PBMC细胞的作用来提高抗膀胱肿瘤作用。     

紫杉醇对人膀胱移行上皮细胞癌的体外作用

目的:观察紫杉醇对人膀胱移行上皮癌细胞系增殖、细胞凋亡以及p53、bax、bcl-2和caspase3基因表达的影响。方法:体外培养膀胱移行细胞癌细胞系BIU-87、5637、T24、EJ细胞;用MTT法检测紫杉醇对各种癌细胞生长抑制的影响;用流式细胞技术(碘化丙啶)检测紫杉醇对癌细胞周期影响;流式细胞仪Annexin-V法测定细胞凋亡率;流式免疫荧光检测用药前后p53、bax、bcl-2、和caspase3基因表达变化。结果:紫杉醇对体外培养的膀胱移行细胞癌细胞系均有抑制作用,具有时间和浓度依赖性;低分级肿瘤和倍增时间长的细胞系对紫杉醇敏感性高;紫杉醇作用5637和EJ细胞24小时,导致细胞G_2期71.29%与64.57%的阻滞;1μg/ml作用5637细胞12、24、48小时,凋亡率分别为5.0%、12.9%、及27.6%;免疫荧光显示p53、bcl-2表达没有显著性变化,而bax、caspase3却随紫杉醇时间延长表达升高。结论:紫杉醇对膀胱移行细胞癌具有抑制作用,细胞分级低、倍增时间长的癌细胞系对紫杉醇更敏感。紫杉醇阻滞细胞于G_2/M,诱导bax表达上调可能是产生膀胱癌细胞凋亡的原因。     

siRNA介导的survivin基因沉默诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡的研究

[目的]研究siRNA（small interference RNA）对人膀胱癌BIU-87细胞凋亡和survivin基因表达的影响。[方法]利用Ambion公司设计软件，设计并体外转录合成针对survivin基因的3个特异性siRNA，通过脂质体将siRNA转入BIU-87细胞，分别采用MTT和DNA原位末端标记（TUNEL）法检测siRNA对BIU-87细胞生长抑制率（IR）和凋亡指数（AI），半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blotting检测siRNA对survivin mRNA及其蛋白表达的影响。[结果]转染后的siRNA1～3组的BIU-87细胞的IR（41.84%、56.21%、54.13%）和AI（21.98%、36.54%、31.34%）均分别显著高于正常对照组（1.98%和3.17%）（P＜0.05），survivin mRNA及其蛋白表达水平均显著低于对照组；其中siRNA2～3对BIU-87细胞的IR、AI和survivin表达的抑制作用均显著高于siRNA1。[结论]体外转录合成的siRNA可抑制BIU-87细胞survivin的表达，诱导BIU-87细胞凋亡，从而抑制BIU-87细胞生长，为siRNA介导的膀胱肿瘤基因沉默提供实验依据。     

PTS(抑瘤仙)体外抗瘤作用研究

目的　研究抗瘤新药PTS(抑瘤仙 )体外对肺癌细胞、耐药肺癌细胞及对正常支气管上皮细胞的作用 ,为其临床应用提供理论依据。方法　以大细胞肺癌株NCI H 460、耐药大细胞肺癌株H 460 /cDDP及正常支气管上皮细胞株 16HBE为实验对象 ,采用 2 4h活细胞跟踪法、MTT法及台盼蓝拒染记录细胞生长曲线法 ,进行PTS的体外抗瘤作用研究 ,同时以DDP(顺铂 )为阳性对照 ,PBS(平衡盐液 )为阴性对照。结果　PTS对受到直接损伤的肺癌细胞及耐药肺癌细胞均有杀伤作用 ,具有抗瘤作用和一定的抗耐药性。与DDP比较 ,PTS有更强的抗瘤作用 ,对于H 460细胞在第 48h 5 0 0mmol的DDP杀伤率为 62 .1% ,1/2 0 0的PTS为 81.3 % ;而PTS对于正常人支气管上皮 16HBE细胞的影响较小 (DDP为 3 9.5 % ,PTS为 2 1.6% ) ,具有较高的选择性。PTS应用后立即起效并达高峰 ,作用持续时间短。结论　PTS体外抗瘤作用明显 ,并具有选择性和一定的抗耐药性     

过表达Numb基因对人膀胱癌5637细胞周期和增殖的影响

目的：：探讨 Numb 基因对人膀胱癌细胞周期和增殖能力的影响及相关机制。方法：选取人膀胱癌细胞5637为研究对象,采用 Numb-ORF 表达质粒转染细胞为实验组,设置阴性对照和空白对照组。采用荧光定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹技术检测各组中 Numb 基因和细胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）的表达;采用流式细胞技术检测各组的细胞周期;采用酶标仪检测细胞在490nm 的吸光度值,评价各组细胞的增殖活力。结果：实验组 Numb的△CT 值为1.58±0.41,阴性对照组为5.66±0.53,空白对照组为5.81±0.47,差异有统计学意义（F ＝77.39, P ＝0.00）;实验组 Cyclin D1的△CT 值为4.92±0.73,阴性对照组为2.59±0.33,空白对照组为2.45±0.26,差异有统计学意义（F ＝11.70,P ＝0.01）。实验组中 G0／G1期细胞的比例（％）为49.76±7.07,明显高于阴性对照组的36.52±3.32和空白对照组的38.21±2.06,差异有统计学意义（F ＝7.17,P ＝0.03）。增殖实验中,实验组24 h 的吸光度值为0.35±0.08,明显低于阴性对照组0.52±0.06和空白对照组0.55±0.04（F ＝9.03,P ＝0.02）。结论：Numb 基因可以提高 G0／G1期细胞比例,抑制膀胱癌细胞增殖,其机制可能是通过抑制 Cyclin D1表达实现。     

光动力作用对膀胱癌细胞生长影响的体外实验研究

目的观察光动力治疗(PDT)对体外培养的人膀胱癌细胞的杀伤效应以及形态改变,同时探讨光敏剂(PhtofrinⅡ)浓度与杀伤效应的关系。方法将膀胱癌细胞(T-24)分组进行培养,扩增至一定数目后,加入光敏剂,然后用激光照射,绘制细胞生长曲线,观察PDT对肿瘤细胞生长的抑制情况,同时进行细胞形态学观察。结果癌细胞生长随光敏剂用药剂量不同而受到不同程度抑制;显微镜下见治疗后癌细胞结构受到破坏。结论体外光动力治疗可明显抑制膀胱癌细胞的增长,其效应与光敏剂浓度呈正相关。     

As2O3对人膀胱癌细胞株BIU-87作用的体外研究

目的　观察三氧化二砷 (As2 O3 )对人膀胱癌细胞株BIU 87的作用 ,并探讨其作用机制。方法　采用四氮唑蓝(MTT )法检测As2 O3 不同浓度、不同作用时间对BIU 87细胞株的生长抑制率 ;流式细胞术 (FCM )检测不同浓度As2 O3 作用 72h后细胞中凋亡相关蛋白Fas、bcl 2的表达及细胞周期变化。结果　As2 O3 可有效抑制BIU 87细胞株的生长 ,具有浓度、时间依赖性特点。Fas、bcl 2的表达与As2 O3 浓度增高分别呈正、负相关 (P <0 .0 5 ) ,且随As2 O3 浓度增高Fas、bcl 2的表达呈负相关 (P <0 .0 5 )。随As2 O3 浓度增高细胞周期被阻滞在G0 /G1期。结论　As2 O3 可有效抑制人膀胱癌BIU 87细胞株的生长增殖 ,阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡可能起了重要作用     

环氧化酶-2 抑制剂Nimesulide对膀胱癌T24细胞体外生长的抑制作用

 目的 观察环氧化酶-2（COX-2）抑制剂Nimesulide（NIM）对人膀胱癌T24细胞株体外生长的影响，并探讨其作用机制。方法 采用细胞形态学、MTT法、流式细胞术、吖啶橙-溴化乙啶双染法（AO-EB）等技术检测NIM对体外培养的人膀胱癌细胞株T24生长的抑制效应。结果 细胞形态学观察可见NIM对T24细胞生长具有明显的细胞毒作用；MTT法、流式细胞术分析显示NIM能明显抑制T24细胞的增殖，且呈剂量、时间依赖关系；细胞周期分析表明，NIM能使T24细胞G0／G1期细胞比例升高，S期和G2／M期细胞比例下降；流式细胞DNA直方图上出现典型的亚二倍体“凋亡峰”，细胞凋亡率与NIM作用时间和剂量相关；荧光显微镜检查显示NIM处理的T24细胞AO-EB双染色后，细胞核内可见浓染致密的颗粒荧光，典型细胞可见新月形改变，固缩或片段化的核。结论 COX-2抑制剂NIM对T24细胞生长具有明显的抑制作用，其作用机制可能与阻断细胞周期、诱导细胞凋亡等有关。     

UTI对人膀胱癌T24细胞尿激酶型纤溶酶原激活剂表达的影响

 目的　体外研究尿胰蛋白酶抑制物对人膀胱癌T2 4细胞尿激酶型纤溶酶原激活剂表达的影响 ,探讨UTI抑制膀胱肿瘤侵袭和转移的机制。方法　采用免疫组化和半定量逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)检测不同量的UTI对体外培养的人移行细胞膀胱癌T2 4细胞uPA表达的影响。结果　免疫组化和RT PCR结果均表明 ,UTI能拮抗uPA的表达并呈负的剂量效应关系。结论　UTI能有效抑制人膀胱癌T2 4细胞uPA的表达 ,为UTI抑制膀胱肿瘤侵袭和转移提供了实验依据。     

三种药物对人乳腺癌细胞体外杀伤作用比较

目的 :比较吡柔比星(THP)和阿霉素(ADM)、表阿霉素(EPI)对人乳腺癌细胞的体外抑制及凋亡诱导作用,以及药物杀伤的时效关系。 方法 :采用ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA),比较吡柔比星和阿霉素、表阿霉素对人乳腺癌细胞系MCF-7、T-47D和Bcap-37的生长抑制作用,并绘制细胞存活率-时间曲线;用Annexin V凋亡检测技术检测药物诱导细胞凋亡的情况。 结果 :3种药物对乳腺癌细胞系MCF-7、T-47D和Bcap-37的生长抑制作用呈现明显的剂量依赖性;吡柔比星对其生长抑制作用明显高于阿霉素和表阿霉素,其IC₅₀仅相当于阿霉素和表阿霉素的1/3-1/6,与后两者的差异均具有显著意义(P<0.01);阿霉素和表阿霉素的抑制作用相当,两者IC₅₀无显著性差异(P>0.05)。三种药物对乳腺癌细胞的抑制作用均呈时间依赖关系,低浓度的吡柔比星在短时间内(12h)即具有生长抑制作用,而阿霉素和表阿霉素的起效时间较为迟缓(24-36h),72h后肿瘤细胞的存活率较吡柔比星高10%-20%。3种乳腺癌细胞分别经低浓度的吡柔比星、阿霉素和表阿霉素处理后均可诱导凋亡,其中吡柔比星组的细胞凋亡比例较其它两组为高。 结论 :吡柔比星对乳腺癌细胞具有较好的生长抑制和凋亡诱导作用,其起效时间明显早于阿霉素和表阿霉素。该药良好的抑瘤效果和迅速的起效时间对于提高乳腺癌临床疗效,减轻不良反应有重要的参考和临床应用价值。     

FMNL2基因沉默对人大肠癌细胞体内外增殖及侵袭能力的影响

摘 要：［目的］ 探讨FMNL2基因沉默对人大肠癌细胞体内外增殖及侵袭能力的影响。［方法］ 筛选并建立FMNL2基因沉默的SW80/M5细胞系;荧光定量RT-PCR和Western blot检测干扰效率;CCK8法检测 FMNL2对SW80/M5增殖能力的影响;流式细胞仪检测细胞周期;侵袭小室实验检测其对SW80/M5侵袭能力的影响;裸鼠皮下成瘤实验和脾注射法体内转移实验检测FMNL2基因表达沉默对SW80/M5在体内增殖、侵袭能力的影响。［结果］ FMNL2基因沉默后显著抑制SW80/M5在体内外增殖、转移及侵袭能力（P<0.05）。［结论］ FMNL2与大肠癌多种恶性生物学功能的调控密切相关,可能是潜在的治疗靶点。