桑树成花素基因MaFT的启动子克隆和功能位点分析

FT(flowering locus T)是高等植物开花过程中关键的信号整合因子,主要在叶片维管束中合成,通过运输抵达茎顶端分生组织发挥作用。为了研究桑树FT基因的转录调控机制,以白桑种(Morus alba Linn.)品种新一之幼嫩叶片的基因组DNA为模板,根据NCBI数据库公布川桑(Morus notabilis)全基因组中FT同源序列的上游序列设计引物,PCR扩增获得FT基因的启动子片段,其长度为921 bp,命名为MaF TP。通过PLACE和PlantC ARE在线启动子预测工具分析,该序列中除含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子的核心元件外,还存在脱落酸的响应元件ABRE,生长素响应元件AuxRR-core,水杨酸响应元件TCA-element,生理节律相关顺式作用元件circadian,光响应元件I-box、G-box、MNF1等,以及胚乳表达必需的顺式作用元件Skn-1-motif和抗逆性相关的顺式作用元件W-box、MBS、TC-rich repeats,表明FT基因的转录表达可能受光照、干旱、节律性、脱落酸、生长素、水杨酸等因素的调控,并参与胚乳的形成。将5'端缺失的5段FT启动子序列(从大到小依次为MaF TP903、MaF TP762、MaF TP542、MaF TP289、MaF TP162)分别与报告基因GUS融合构建表达载体,利用农杆菌转化烟草(Nicotiana benthamiana)植株,通过GUS染色对不同长度的启动子活性进行分析,结果表明:除了MaF TP903的活性较弱外,其余启动子缺失片段均能驱动GUS基因高效表达,且表达量相近。依据研究结果推测:MaF TP启动子的762~903 bp区段可能存在MaF T基因转录表达的负调控元件。     

桑树病程相关蛋白基因MuPR1-2的启动子克隆及诱导表达活性

研究桑树抗病关键蛋白基因的启动子及其活性,对阐明基因的功能与表达调控机制十分重要。利用Tail-PCR技术成功地从桑树叶片基因组DNA模板中扩增得到病程相关蛋白基因MuP R1-2的启动子,将之命名为pM uP R1-2。利用PlantC ARE软件分析pM uP R1-2的核苷酸序列,发现其具有多个转录起始所必需的顺式作用元件以及多种转录因子结合位点,另外还包含多种环境因子响应元件。构建由pM uP R1-2启动GUS基因表达的植物表达载体,通过农杆菌介导的烟草瞬时表达及GUS组织化学染色分析pM uP R1-2具有启动子的功能,证实烟草叶片接种Pst DC3000菌液后能驱动下游报告基因GUS表达,pM uP R1-2具有病原菌诱导表达活性。进一步构建pM uP R1-2稳定表达的转基因拟南芥植株,通过GUS组织化学染色与GUS荧光定量分析发现pM uP R1-2不仅具有病原真菌和细菌诱导表达活性,同时具有可被多种激素诱导表达的特性和组织表达特异性。     

猪SP-A基因启动子区的克隆与序列分析

为了探明猪SP-A基因的启动子及其转录调控机制,设计6条特异性引物,采用染色体步移、克隆测序以及序列比对分析,从大白猪基因组中扩增出一段长度为1 033 bp的猪SP-A基因的上游序列(DQ985806),其GC含量约为55%.经过生物信息学分析,确定了其转录起始位点及活性区域;发现在转录起始位点上游-33 bp处存在1个TATA-box,另外还发现了GC-box、CAAT-box、GT-box以及转录起始子;该序列还包含Spl、TF和NF-κB等转录因子结合位点以及1个特殊重复序列5'-CATCACTGT-3'.上述试验结果表明,所克隆的1 033 bp的DNA序列是大白猪SP-A基因的启动子区序列.     

山羊脂肪酸合酶基因(FASN)启动子结构与功能的初步分析

本研究旨在对山羊脂肪酸合酶基因(Fatty acid synthase,FASN)启动子进行结构与功能的初步分析,进而对其转录调控机制进行探讨。采用PCR技术从西农萨能羊基因组DNA中克隆FASN基因启动子,通过缺失分析,构建7个包含不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,转染山羊乳腺上皮细胞和MCF-7细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动活性。结果表明,克隆得到FASN基因的启动调控序列2 589bp,生物信息学分析发现,该启动子序列含有典型的启动转录元件TATA-box和E-box,分别位于转录起始位点(+1)上游-41和-74bp处。报告基因分析表明,启动子核心区域定位在-293～-79bp,在线软件预测发现,该区域含有Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子结合位点。结果显示,FASN基因启动子前端存在负调控元件,Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子可能参与FASN基因的转录调控。     

草地早熟禾PpGA2ox基因启动子的克隆及功能分析

为了研究草地早熟禾(Poa pratensis L.)GA2-氧化酶基因(PpGA2ox)的启动子,利用染色体步移的方法从草地早熟禾中克隆得到1109bp的PpGA2ox基因启动子序列。Plant CARE在线预测结果表明该启动子序列中存在CAAT-box、TATA-box等启动子基本顺式作用元件以及响应干旱胁迫和茉莉酸甲酯诱导的调控元件。构建PpGA2ox基因启动子与GUS报告基因融合的植物表达载体转化拟南芥,阳性植株GUS组织化学染色结果表明PpGA2ox基因启动子可以驱动GUS基因在拟南芥中表达并且表达具有组织特异性。与对照相比,激素处理及非生物胁迫下GUS基因表达量发生变化,推测PpGA2ox基因的表达可受到激素及非生物胁迫调控。     

关岭牛解偶联蛋白3基因5’侧翼区克隆和生物信息学分析

本试验对贵州关岭牛解偶联蛋白3（uncoupling protein,UCP3）基因5'侧翼区进行克隆,并利用生物信息学软件对其1080 bp的克隆序列进行分析,以研究UCP3基因5'侧翼区特异性转录调控元件的调控机制。软件分析发现关岭牛UCP3基因5'侧翼区含有6个可能的转录起始点和33个潜在转录因子结合位点,与东北虎、家猫、印度水牛、藏羚羊、山羊、绵羊UCP3基因5'侧翼区（-196～+100 bp）序列相似性分别为82%、82%、98%、95%、96%和98%;该区域保守性较强,推测转录起始点上游-200～+1 bp可能是其核心启动子区域,该区域在调控基因转录和翻译方面具有共同的作用。试验成功克隆了UCP3基因5'侧翼区序列1080 bp,初步预测了该基因的核心启动子区。     

内蒙古绒山羊角蛋白5基因启动子克隆及序列分析

试验旨在了解角蛋白5(keratin 5, K5)可能的调控序列。本研究根据UCSC公布的牛K5基因5'侧翼区设计PCR引物,扩增了内蒙古绒山羊K5基因部分启动子序列。通过产物纯化、连接、转化,并对测序结果进行了生物信息学分析。结果扩增得到内蒙古绒山羊K5基因启动子序列长度为1452 bp(GenBank登录号为:JQ277735),与牛和人相应序列的相似性分别为91.5%和74%。转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游－101 bp位置;含有两个TATA 盒,分别位于翻译起始位点上游－129—－124 bp(ATAAAA)和－178—－174 bp(TTAAT)位置;通过在线分析软件预测发现(按5'→3')SRY,MZF1,v-Myb,SRY,AP-1,CDP CR,HNF-4,AML-1a,HSF2,AP-4,AP2,AP2,Sp1,Nkx-2,Sp1和GATA-1转录因子结合位点。其中,转录因子SRY(TGTGTTT),和CDP CR(GATTGATGGC)是绒山羊特有的;转录因子HNF-4,AML-1a,HSF2,AP-4,AP2,Sp1,Nkx-2和GATA-1(AGCCATCATG)在绒山羊、牛和人K5启动子上的结合位点高度保守。两个最小增强子分别位于翻译起始位点ATG上游－140—－91 bp和－114—－67 bp位置,含有24 bp(GCGGCTCCCAGGTAACAGAGCCGC)重叠区,预测其与绒山羊K5基因的转录调控有关。试验确定了内蒙古绒山羊K5基因启动子的转录起始位置、转录因子结合位点及最小增强子序列,为进一步研究绒山羊K5基因的表达调控机制奠定了理论基础。     

盐生草HgNHX1基因启动子的克隆及功能验证

为了进一步探明盐生草HgNHX1基因启动子的功能,从盐生草基因组中克隆了HgNHX1基因上游 5'侧翼调控区1523 bp的序列,即HgNHX1基因启动子(pHgNHX1)序列,并利用PlantCARE、PLACE等在线软件对HgNHX1基因5' 端上游序列进行预测和分析,发现该启动子中除具有TATA-box、CAAT-box等核心启动子元件外,还含有多个与盐、干旱、缺水、冷、伤害等逆境胁迫诱导有关的作用元件;同时具有生长素、脱落酸、赤霉素及乙烯等植物激素诱导响应的功能元件,表明分离得到的DNA片段具有典型启动子的一般特征。构建pBI-HgNHX1启动子植物表达载体并转化拟南芥和烟草,利用组织染色法鉴定转基因烟草和拟南芥的 β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)表达模式,发现在转基因拟南芥的各个器官均有GUS 酶的活性,说明pHgNHX1具有一定的组成型启动子活性。     

鸭CD8α基因启动子区的克隆及荧光素酶报告基因重组体的构建

旨在了解分化群α基因可能的调控序列及其转录调控机制。本研究利用基因组步移技术扩增鸭CD8α基因的启动子区序列,使用在线软件进行序列分析;分别将鸭肝炎易感组和抗性组的CD8α基因启动子区定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,利用酶切与测序技术进行鉴定;并瞬时转染细胞,采用荧光素酶报告基因系统检测启动子载体的活性。结果,扩增出一条长度为2 480bp的片段(包含第一外显子56bp,启动子区2 424bp)。经序列分析,鸭CD8α基因启动子区具有典型的TATA-box、GC-box和CAAT-box,其转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-406bp处,且发现了CdxA、Nkx-2、GATA-1、SRY等41个潜在转录因子结合位点。经酶切与测序鉴定,成功构建了鸭CD8α基因荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶报告基因检测系统显示,构建的鸭肝炎易感组和抗性组的报告基因启动子载体具有相当的活性。研究结果为进一步探讨CD8α基因的转录调控奠定了基础。     

青香蕉苹果α-法尼烯合酶基因启动子的克隆及序列分析

α-法尼烯的合成及α-法尼烯合酶基因的表达调控机制的研究在苹果等虎皮病的防治中具有重要作用。本实验利用Tail-PCR技术克隆了青香蕉苹果中α-法尼烯合酶基因的启动子序列,长度为1235bp。序列分析结果发现,该启动子序列含有明显的启动子特征序列TATA-box和CAAT-box,还有含有GARE-motif,TATC-box,TGA element等赤霉素和生长素等激素响应元件,HSE,ARE等热胁迫响应元件,大量的光反应元件G-box,GA-motif,GAG-motif,以及MYB结合位点MBS。序列分析表明该启动子可能受到激素、温度和光的调节。     

苦豆子赖氨酸脱羧酶基因启动子在拟南芥中的表达分析

赖氨酸脱羧酶(LDC)基因是苦豆子中氧化苦参碱(OMA)生物合成的第一个关键酶基因。在已有苦豆子赖氨酸脱羧酶基因(SaLDC)基础上克隆得到该基因上游1260 bp的启动子序列,GenBank登录号为KY038928,前期在苦豆子愈伤组织中的瞬时表达研究显示该启动子具有启动活性。生物信息学分析发现该启动子区域除了拥有启动子区的基本顺式作用元件TATA-box和CAAT-box外,还具有多个与光信号、逆境应答等相关的顺式作用元件。为进一步研究SaLDC启动子的功能,构建了该启动子与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因融合的植物表达载体并通过农杆菌介导遗传转化拟南芥,同时对光诱导和聚乙二醇(PEG)胁迫的转基因拟南芥进行GUS活性染色和定量分析。结果显示,在T₂代转基因拟南芥幼苗的不同生长阶段和成株的各组织器官中均可检测到GUS酶活性,且随幼苗生长时间的延长,叶片中的表达活性下降;在成株叶片和花萼中的表达活性强于根、茎、花瓣和角果。光和PEG胁迫均能诱导转基因拟南芥中GUS的表达;GUS酶活性定量测定显示,短时间的PEG胁迫(1~2 h)GUS酶活性显著上调(P<0.05),而连续胁迫8 h时GUS酶活性下调至最低(P<0.01),比胁迫前下降了28.2%。以上结果表明SaLDC启动子既有时空表达特异性又有组织表达特异性,光诱导和干旱胁迫对结构基因的表达有重要的调控作用。     

关岭牛pEGFP-N3-UCP3重组真核表达载体的构建

旨在构建不含CMV启动子的pEGFP-N3-UCP3重组真核表达载体。利用PCR技术克隆UCP3基因启动子,扩增不含CMV区的pEGFP-N3载体片段,将UCP3启动子与该载体经连接、转化后,挑取阳性克隆进行PCR鉴定及测序鉴定。结果表明,成功地构建了重组载体pEGFP-N3-UCP3,为UCP3基因转录调控机制的研究奠定了基础。     

紫花苜蓿高温诱导启动子pMsMBF1c的克隆与功能分析

植物耐热性受复杂而精细的调控。热诱导启动子能经济、高效的激活或关闭耐热调节途径关键基因的表达,在植物功能基因组研究与现代分子育种技术中起十分重要的作用。以紫花苜蓿耐热候选基因MsMBF1c的编码序列为基础,采用酶切连接的方法分离获得了其上游1748bp序列,生物信息学分析发现该区域具有HSE与GATA结合位点等2个与植物耐热调节相关的保守模体,此外还有5个ABA应答元件(ABRE、MYB2、MIC2、CBF与DPBF)和2个MYB蛋白结合位点,说明MsMBF1c除了参与植物耐热性调节外,还可能参与其他抗逆性调节。构建pBI121-MsMBF1c::GUS双元载体转化野生型拟南芥,荧光定量分析热诱导后的转基因植物中GUS与AtMBF1c基因的表达发现其分别上调了5.4与4.8倍,并且高温诱导下转基因植株的组织化学染色分析同样证明MsMBF1c启动子显著受高温诱导。分离获得紫花苜蓿MsMBF1c启动子序列并转化拟南芥,并且从生物信息学、组织化学染色与基因表达等方面验证该序列能显著被高温诱导,为探讨紫花苜蓿耐热调控机制及通过分子生物技术改善紫花苜蓿耐热性提供理论支撑,最终为培育适应南方高温气候条件的紫花苜蓿新品种提供技术储备。     

柠条锦鸡儿CkNCED1基因启动子的克隆及表达分析

利用染色体步移(Genome walking)技术,克隆柠条锦鸡儿CkNCED1基因上游启动子序列。经顺式元件预测分析,该序列除基本的启动元件之外,还含有2个脱落酸诱导响应元件ABRE、此外还含有多个逆境相关的元件。将CkNCED1基因启动子区连接到pGWB533植物表达载体上,构建Promoter::GUS载体,GUS组织化学染色结果表明,CkNCED1基因在植物的叶、根、茎、花和角果的维管组织中均有表达,且在叶片中表达强度最高。以上研究确定了柠条锦鸡儿CkNCED1基因的表达部位和强度。进一步说明CkNCED1基因在ABA合成调控中发挥重要作用,为深入研究基因功能奠定基础。     

猪PLEl基因启动子克隆及序列分析

通过巢式PCR方法获得猪PI。E1基因5’端上游启动子序列，通过T／A克隆法对PI。E1基因的启动子进行克隆，并对PCR鉴定为阳性的克隆子进行测序，参考人、啮齿类的羧酸酯酶家族的启动子结构，并利用启动子在线分析软件对其进行生物信息学分析。结果成功克隆得到PI。E1基因5’端上游1153bp的调控片段，分析表明该调控区没有CpG岛，也不存在典型的TATA盒结构；有2个转录起始位点分别位于翻译起始密码子ATG上游-39bp和-37bp处，潜在的转录因子结合位点有C／EBP、Spl、USF、CdxA、GATA-X、GATA-1、GATA-2、GATA-3、MZFl、AML-la、SRY、Nkx-2、LyLl、deltaE等。另外还发现了7种基序分别为EGF-1、INTEGRINBETA、CTCKl、ANA—PHYIJATOXIN-1、THIOLASE-3、TUBUI，IN、VWFC-1。研究结果可为进-步揭示PLEl基因转录调控机制提供理论参考。     

杨树木质部特异启动子MDCesAP的改造及功能检测

木质部特异表达的强启动子有助于外源目的基因在植物木质部中高效表达。将2个杨树木质部特异启动子MDCe-sAP串联在一起,置换植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建成pDMDCesAP-GUS植物表达载体,通过农杆菌介导,并采用叶盘法转化烟草,获得烟草抗性植株。β-葡糖醛酸酶(GUS)活性检测结果表明,该串联启动子DMDCesAP具有木质部特异性,有望应用于桑天牛寄主树种的抗虫转基因研究。