含3C蛋白酶切位点的人CD226胞膜外区Ig融合蛋白的真核表达及应用

目的：构建含3C蛋白酶酶切位点的人CD226(PTA1)分子胞膜外区Ig融合蛋白编码基因的真核表达载体，并进行表达和初步鉴定。方法：将人CD226分子的胞膜外区基因，克隆入含3C蛋白酶靶序列的Ig真核表达载体p-3c—Ig中。测序证实后，转染COS7细胞并进行瞬时表达。表达产物经亲和层析件纯化，并通过免疫荧光染色及3C蛋白酶酶切反应进行鉴定结果：经表达和纯化获得CD226胞膜外区的Ig融合蛋白。该融合蛋白可与表达于ECV304细胞表面的CD226配体有效结合。同时，融合蛋白的Fc段亦经3C蛋白酶切除，从而获得CD226胞膜外区的真核表达分子。结论：成功地获得了含有3C蛋白酶酶切位点的人CD226分子胞膜外区Ig真核表达产物，为进一步对CD226分子进行结构和功能研究，以及X线结晶衍射提供了重要条件。     

人CD226(PTA1)分子胞膜外区的原核表达、复性及免疫反应性的鉴定

目的　构建人CD2 2 6 (PTA1)分子胞膜外区的原核表达载体 ,并进行原核表达和复性 ,为该分子的X线结晶衍射及功能学研究提供充足的蛋白来源。方法　将人CD2 2 6分子的胞膜外区基因克隆入原核表达载体pBV2 2 0 ,测序证实后 ,转化宿主菌MC10 6 1 P3并进行温度诱导表达。产物采用稀释加透析法复性 ,亲和层析柱纯化 ,并通过Westernblot和ELISA对其复性效果进行鉴定。结果　温度诱导 7h ,目的蛋白的表达量达宿主菌总蛋白量的 2 3.8% ,其相对分子质量为 30× 10 3,Westernblot及ELISA证实其重折叠和复性是成功的。结论　成功地获得了人CD2 2 6 (PTA1)分子胞膜外区的原核表达产物 ,可用于该分子X线结晶衍射及功能学实验     

人CD226 (PTA1)分子胞膜外区截短体真核表达载体的构建、表达及其识别结构域的分析

目的：确定一套CD226单克隆抗体（McAb）识别CD226分子胞膜外区结构域的部位，方法：应用计算机软件分析CD226子蛋白质序列疏水性，确定其亲水性区域。采用PCR方法扩增CD226分子基因序列，分别缺失相应亲水性区域，构建CD226截短体重组真核组细胞表达载体pcDNA3-PTA1T1和pcDNA3-PTA1T2。测序正确后，转染COS7细胞，抗CD226分子克隆抗体间接免疫荧光染色，流式细胞术检测CD226分子截短体的表达，表达成功后，采用间接免疫荧光染色和流式细胞术分析，用一套CD226McAb检测与截短突变体的免疫反应性，从而确定CD226McAb识别CD226分子结构域的部位。结果：PCR扩增出CD226分子相应目的片段序列，定向克隆入pcDNA3真核表达。CD226McAb Leo A1,New E1T -7均可识别CD226全长分子；Leo A1,New E1,FMU1,FMU2,FMU4和MFU5与截短突变体PTA1T1和PTA1T2均无反应性，FMU3可结合PTA1T1分子，不结合PTA1T2分子；FMU6和FMU7均可结合PTA1T2均无反应性；FMU3可结合PTA1T1分子，不结合PTA1T2分子；FMU6和FMU7均可结合PTA1T1及PTA1T2分子，结论：CD226McAb Leo A1,New E1,FMU1,FMU2,FMU3,FMU4和FMU5识别CD226分子膜膜外区D1结构域，其中FMU3识别的位点位于V1和V2环之间；FMU6和FMU7识别D2结构域。     

CD40突变体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人muCD40胞外段基因序列,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1恒定区基因,分别插入真核表达载体pIRES2-EGFP,采用Superfectin转染CHO细胞,G418筛选出能稳定分泌muCD40Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆。筛选出的阳性克隆经无血清培养后,收集上清进行Western blot检测;并收集细胞进行RT-PCR鉴定,同时用流式细胞仪分析muCD40Ig蛋白与CD40L的结合能力。结果:成功构建了人pIRES2-EGFP/muCD40Ig重组真核表达载体,PCR及Western blot结果显示该CHO基因转染细胞能够稳定分泌人muCD40Ig蛋白;流式检测muCD40Ig融合蛋白能够与CD40L分子结合。结论:获得了能稳定分泌人muCD40Ig的CHO基因转染细胞株,muCD40Ig融合蛋白具有与CD40L结合的能力。     

活化的蛋白激酶C受体1真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建活化的激酶C受体1(RACK1)WD1-4真核表达载体,通过细胞转染和Western blot鉴定其是否在细胞中表达。方法:应用PCR法扩增RACK1蛋白中第1～4个WD40区域的片段,将其与PGEM-T载体连接,测序后再将其克隆至pEGFP-N1中。采用脂质体法将重组质粒转染至293T细胞中,观察其在真核细胞中的表达,并用Western blot法进行鉴定。结果:pEGFP-N1-RACK1(WD1-4)重组质粒经酶切鉴定及测序证实,目的基因的序列完全正确。荧光显微镜观察发现,转染了重组质粒的细胞株可见绿色荧光融合蛋白的表达,Western blot结果进一步证实了上述结果。结论:成功构建pEGFP-N1-RACK1(WD1-4)重组质粒且进行了真核表达,为下一步研究RACK1蛋白的功能奠定了基础。     

hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达

目的:构建人类促甲状腺激素受体(hTSHR)胞膜外区氨基端的两个片段hTSHRf(aa29 ～100)、 hTSHRe(aa101～278)的真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe, 并在CHO细胞中进行表达.方法:RT-PCR法从人甲状腺正常组织的cDNA中扩增hTSHRf和hTSHRe,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5-His-TOPO中, 经酶切、 PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达, RT-PCR扩增转染细胞的cDNA、 Western blot分别鉴定hTSHR在CHO细胞中mRNA和蛋白水平的表达.结果:RT-PCR分别扩增两个片段的阳性克隆株, 所得片段大小与预期一致, 经Western blot鉴定, 相对分子质量(Mr)分别为11900、 23600左右, 与预期的大小相符.结论:真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe构建成功, RT-PCR和Western blot检测证实重组质粒能在CHO细胞中高效表达, 为进一步研究pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe在体内的基因表达, 建立Graves'病的动物模型奠定了基础.     

人PRMT1真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人PRMT1基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法:采用RT-PCR技术扩增人PRMT1全长cDNA;经过双酶切、连接等反应,构建pcDNA3.1(+)-PRMT1真核表达载体,并转化DH5α感受态细胞;用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆;经菌液PCR及测序鉴定重组质粒;瞬时转染A549细胞,采用实时定量PCR检测重组质粒的表达水平及PRMT1对eotaxin-1和ccr-3表达的影响。通过Western blot从蛋白水平检测重组质粒在真核细胞内的表达。结果:RT-PCR扩增的人PRMT1全长cDNA为1136 bp;所筛选出的pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体中插入片段与NCBI GenBank文库中人PRMT1 cDNA的序列完全一致;实时定量PCR和Western blot检测证实重组质粒在A549细胞内可高效表达;并且PRMT1与eotaxin-1和ccr-3的表达呈正相关性。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体,为进一步研究PRMT1基因的作用机制奠定基础。     

人RASSF1A基因的真核表达载体的构建及其表达

目的 通过构建人RASSF1A基因的真核表达载体,为研究其在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞增殖抑制等方面奠定基础.方法 采用RT-PCR从人外周血的单个核细胞RNA中扩增出人RASSF1A基因的全长cDNA,利用DNA重组技术将其插入到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中获得重组质粒.利用脂质体将重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2中,采用RT-PCR.westem-blot检测RASSF1A的瞬时表达.结果 酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF1A基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中,RT-PCR及Western-blot结果显示转染细胞的RASSF1A表达水平上调.结论 成功构建了RASSF1A基因的真核表达栽体pcDNA3.1(+)/RASSF1A.     

miR-21真核表达载体的构建及其活性鉴定

目的:构建miR-21的真核表达载体, 并使其在骨肉瘤MG63细胞中表达, 为研究miR-21对骨肉瘤细胞MG63的作用打下基础.方法:根据miRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共433个碱基序列, 设计PCR引物, PCR扩增, 退火后用T4连接到线性化的pcDNA3.1(+)质粒中, 并对重组质粒进行双酶切、菌落PCR及测序分析, 鉴定完全正确的重组质粒转染骨肉瘤细胞MG63, G418(400 mg/L)筛选4周获得miR-21稳定表达细胞系, 用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcDNA3.1(+)-miR-21可在真核细胞中过表达.结果:成功构建了miR-21的真核表达载体, 并获得稳定转染重组质粒的细胞系.结论:miR-21的真核表达载体在骨肉瘤细胞MG63中稳定高表达, 为进一步研究miR-21在骨肉瘤MG63中的功能及基因调控机制奠定了实验基础.     

人细胞周期蛋白H基因的真核表达载体构建和表达及功能检测

<正>细胞周期蛋白H(cyclin H)是一种含323个氨基酸,相对分子质量(Mr)为38 000的细胞周期调控蛋白,普遍存在于真核细胞中,可与细胞周期蛋白依赖性激酶7(cyclin-dependent kinase 7,CDK7)共同参与细胞周期和基因转录的合理调控,其复合体可以催化各种CDK分子的活化,从而影响细胞增殖[1]。Cyclin H可催化多种CDK(如CDK2、CDK4、     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

人B7-2(CD86) IgV+C段高效原核表达及活性测定

目的克隆、表达B7-2(IgV+C)并进行体外功能测定.方法用聚合酶链反应(PCR)技术从B7-2 cDNA中克隆B7-2(IgV+C),在此基础上构建表达B7-2(IgV+C)的原核表达载体pGEX-4T-3/hB7-2(IgV+C);SDS-PAGE检测蛋白表达,蛋白经变性、复性后在体外协同抗CD3单抗刺激人T细胞,3H-TdR掺入法检测T细胞的活化程度.结果在原核表达载体中成功地克隆了B7-2(IgV+C),SDS-PAGE表明在相对分子质量(Mr)55×103处有hB7-2(IgV+C)/GST融合蛋白的高效表达,其表达量占菌体总蛋白的33%.体外实验证明,此融合蛋白可协同抗CD3单抗刺激人T细胞活化.结论重组蛋白B7-2(IgV+C)在第一信号存在下可活化T细胞,即具有共刺激活性.     

人CD19分子胞外区在大肠杆菌中的表达研究

本实验应用计算机优化设计，利用ＰＣＲ 和分子克隆技术，以ｐＵＣ１９／ＣＤ１９ 重组质粒为模板，扩增出人ＣＤ１９ 分子的胞外区基因，并与表达载体相连，经３０ ℃扩增菌体，４２ ℃诱导，实现了在Ｅ－ｃｏｌｉ 中融合表达相对分子质量（ Ｍｒ） 为４１ ０００ 的蛋白谱带。初步纯化的包涵体可溶于２ ％ ＳＤＳ，为对其单克隆抗体（ｍＡｂ） 的制备奠定了基础。     

HAI-1基因不同功能域的原核表达载体构建及融合蛋白表达

目的:分段克隆1型肝细胞生长因子激活剂抑制因子(HAI-1)基因的功能域并在大肠杆菌中表达,为进一步研究HAI-1的生物学功能打下基础。方法:针对HAI-1的不同功能域设计相应的5对引物,分别扩增KD1、KD1 LDLR、KD2、LDLR KD2和KD1 LDLR KD2片段。将PCR产物克隆至pGEM-TEasy载体中并经测序鉴定。将5个cDNA片段亚克隆至具有6个组氨酸标签(His-Tag)的原核表达载体pIVEX2.3-MCS中。以上述表达不同功能域的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物以Westernblot进行鉴定,并进一步通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的KD1 LDLR KD2融合蛋白。结果:成功地构建了HAI-1各功能域基因片段的原核表达载体。Westernblot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中分段表达了5种HAI-1不同功能域的His-Tag融合蛋白,并通过亲和层析法纯化到了相对分子质量为22200的KD1 LDLR KD2融合蛋白。结论:重组质粒pIVEX2.3-MCS/HAI-1能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化的融合蛋白可用于研究HAI-1不同功能域的生物学作用。     

人CD226基因SNP和启动子序列分析

目的 研究人CD226（PTA1）启动子及其5‘上游调控序列。方法 应用计算机软件预测启动子序列，并分析人CD226基因5‘上游调控序列以及通过RT－PCR的方法研究开放读框中的单核苷酸多态性。结果 CD226基因在－375bp处和－130bp处可能有两个启动子，含有AP－1，Ets-1,Spl,P300,PU.1,PEA3等转录因子结合序列，在编码胞浆区的序列中存在一个单核苷酸多态性位点。结论 CD226基因表达受到多种转录因子和5‘端上游调控序列的调控。     

人CD7胞外区基因在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达人白细胞分化抗原CD7胞外区蛋白。方法 采用PCR技术调整CD7基因的阅读框架,使之与生物素化蛋白基因阅读框架一致,缺失了CD7cDNA基因的起始密码子并增加一个大肠杆菌偏性终止密码子,构建CD7胞外区cDNA和生物素化蛋白基因融合的原核表达质粒PinPointxa3-CD7。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α表达,SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果。结果 融合蛋白的分子量约为30000u,Western blotting结果表明,表达的蛋白质可被抗CD7的单克隆抗体识别。结论 为研制抗CD7基因工程抗体奠定了基础。     

人CD38抗原胞外段基因克隆及表达

目的 克隆并表达人CD38抗原分子的胞外估基因。方法 采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中，扩增CD38全长cDNA，并将其插入pGEM-T载体中。重新设计引物，从重组pGEMT载体中，扩增CD38抗体分子的胞外段基因，再亚克隆到表达载体pET28a( )，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达。结果 经酶切鉴定及序列分析表明，克隆的CD38外段基因的序列与文献^[1,2]的报道完全一致。将该片段亚克隆到表达载体pET28a( ) ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21中获得表达。结论 获得了人CD38抗原分子胞外段基因及其原核表达产物，对进一步制备单克隆抗体，研究CD38分子的功能具有重要的意义。