人源TNF-α抗体基因的克隆与表达

目的:在原核系统中高效表达抗TNF-α单克隆抗体VH/K21,以便进一步研究其生物学功能,预测临床应用前景.方法:以已筛选获得的TNF-α抗体基因VH/K21为模板进行PCR扩增,产物与其表达质粒进行双酶切,连接后克隆进入PET22b(+)/BL21(DE3)感受态中并在该原核系统中实现可溶性表达;对表达产物进行Western blotting、ELISA鉴定.结果:成功克隆与表达出可溶性的高效表达的人源TNF-α单克隆抗体.序列分析表明该克隆具有全新的人源TNF-α抗体基因,它可以特异识别人TNF-α.结论:人源TNF-α单克隆抗体的获得为进一步研制应用于临床的TNF-α人源抗体奠定了基础,也将为其他人源抗体的制备提供理论依据和技术基础.     

Effects of anti-tumor necrosis factor-alpha on colon mucosa immunoregulation of dextran sulfate sodium-induced colitis in mice

目的 探讨抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体对葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎小鼠肠黏膜免疫功能的影响.方法 制备小鼠DSS结肠炎模型,实验分成正常对照组、DSS模型组、抗TNF-α抗体组,每组6只.抗TNF-α抗体5 mg/kg腹腔注射给药,正常对照组和DSS模型组用等量生理盐水腹腔注射,每周2次,注射时间共7 d.每日进行疾病活动指数(DAI)评分,实验结束后取小鼠结肠进行HE染色评分,结肠黏膜匀浆检测髓过氧化物酶(MPO)活性和TNF-α、干扰素γ(IFN-γ)、白介素13(IL-13)和白介素17(IL-17)水平.结果 与正常对照组比较,DSS模型组小鼠出现明显体重减轻、便血和腹泻,DAI评分和HI评分增加(P<0.01),结肠匀浆中MPO活性、TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平均有不同程度的增加(P<0.01).与DSS模型组比较,抗TNF-α抗体组小鼠DAI评分和HI评分明显降低(P<0.01),结肠匀浆中MPO活性、TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平均有不同程度的降低(P<0.01).结论 DSS结肠炎小鼠结肠局部免疫功能紊乱,抗TNF-α抗体具有调节DSS结肠炎小鼠结肠黏膜局部免疫功能的作用.     

康莱特注射液对Lewis肺癌小鼠免疫功能的影响

目的:通过测定小鼠外周血中TNF-α、IL-1、IL-6的活性,探讨康莱特注射液在抗肿瘤的同时对机体免疫功能的影响。方法:50只C57小鼠复制Lewis肺癌模型后,随机分为模型组、CTX组及康莱特低、中、高剂量组。分别腹腔注射相应药物,14天后眼球后静脉取血、离心、取血清。ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1、IL-6的含量;取脾、胸腺组织,称重,计算脾及胸腺指数。结果:与CTX组比较,康莱特低、中、高剂量组的脾、胸腺指数明显提高(P<0.05)。与模型组比较,康莱特高剂量组能明显低降TNF-α、IL-1及IL-6在外周血中的含量(P<0.05);CTX组与康莱特低、中剂量组能明显提高外周血中TNF-α、IL-1及IL-6的含量(P<0.05)。结论:康莱特注射液在杀灭肿瘤细胞的同时,对机体的免疫器官及免疫功能具有保护作用。     

α-亚麻酸对小鼠免疫功能影响的实验研究

目的研究α-亚麻酸增强小鼠免疫力的作用的效果。方法分别以88．8、177．7、355．4nlg／kg·BW剂量的α-亚麻酸（以纯的α-亚麻酸含量计）给小鼠连续灌胃30—35d，检测各项免疫指标。结果α-亚麻酸能提高小鼠的抗体生成细胞数和血清溶血素水平，促进小鼠的单核-巨噬细胞的碳廓清和腹腔巨噬细胞的吞噬能力．促进小鼠的迟发型变态反应，提高小鼠NK细胞的活性。结论α-亚麻酸具有增强小鼠免疫力作用。     

抗肿瘤坏死因子-α抗体对慢性结肠炎小鼠肠黏膜组织内淋巴细胞凋亡的影响

目的:探讨抗肿瘤坏死因子(TNF)-α单抗在阻断小鼠慢性结肠炎发生过程中的作用机制。方法:严重联合免疫缺陷型(SCID)小鼠(n=24)体内植入同基因源性CD45RBhighCD4 T细胞,以诱导慢性结肠炎发生。SCID小鼠造模后均分为观察组和对照组,分别采用抗TNF-α单抗和大鼠免疫球蛋白治疗,剂量均为1mg/只,1次/周,腹腔注射,连续治疗8周。每周记录小鼠的体质量、大便情况和脱肛症状等。SCID小鼠均于造模8周后处死,采集升结肠组织进行组织病理学观察;采用TUNEL染色法检测肠黏膜内淋巴细胞凋亡情况。结果:对照组小鼠均表现为体质量下降,发生腹泻和脱肛,结肠壁增厚,结肠黏膜组织内有大量淋巴细胞浸润,有溃疡发生。观察组小鼠体质量增加,无腹泻和大便稀软现象,结肠黏膜组织结构完整,黏膜和黏膜下层仅有少量的淋巴细胞浸润。观察组小鼠结肠黏膜组织内每高倍视野TUNEL阳性细胞数(56.5±8.2)高于对照组(4.3±0.6)(t=4.521,P<0.001)。结论:抗TNF-α单抗可诱导结肠黏膜内淋巴细胞的凋亡,抑制淋巴细胞功能,从而阻断慢性结肠炎发生。     

牛磺酸对小鼠免疫功能的影响

研究了饮水中加入１％牛磺酸对昆明种小鼠免疫功能的影响。实验分３组；对照组，正常饮水，牛磺酸组，饮水中补充１％牛磺酸，胍乙基磺酸组，饮水中添加１％。牛磺酸组小鼠的单核蚕噬细胞的吞噬功能和体省政府 免疫能力明显高于对照组ＧＥＳ组小鼠的单核吞噬细胞的吞噬功能和体液免疫功能明显对照组     

抗人TNF-α单克隆抗体对银屑病患者血清TNF-α的中和研究

目的:研究抗人TNF-α单克隆抗体对寻常型银屑病患者血清TNF-α的中和效应。方法:应用双抗体夹心ELISA方法检测正常人及患者血清应用单克隆抗体中和前后TNF-α的浓度改变。应用L929细胞检测正常人和患者血清抗体中和前后的生物学活性变化情况。结果:正常人与银屑病患者血清TNF-α的浓度分别为:(3.146±6.184)pg/ml及(62.723±38.379)pg/ml;其生物学活性分别为:(6.817±5.086)%及(57.498±9.125)%。抗体中和后患者血清TNF-α的浓度为:(0.503±1.178)pg/ml;中和后的生物学活性为:(25.378±14.863)%。结论:寻常型银屑病患者血清中TNF-α的浓度及生物学活性均高于正常对照,而抗人TNF-α单克隆抗体在体外可以很好地中和患者血清中TNFα的浓度及其生物学活性。     

双歧杆菌对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障功能及细胞因子的影响

目的观察双歧杆菌活菌制剂对溃疡性结肠炎(UC)大鼠肠黏膜屏障功能及细胞因子的影响,为溃疡性结肠炎的治疗提供理论依据。方法采用饮用DSS(dextran sulfacte sodium)水溶液,建立UC动物模型。饮用DSS的大鼠(n=30)随机分为3组,给予不同的药物治疗,不同药物皆以溶液形式灌胃给药:双歧杆菌治疗组(A组);美沙拉嗪治疗组(B组);模型组(C组),UC模型大鼠每天饮用与药物等体积的生理盐水。同时设立正常对照组(D组):饮用与药物等体积的生理盐水。检测治疗前、后各组大鼠MPO活性、IL-6、IL-8、TNF-α水平,并取肠道标本观察肠黏膜变化情况。结果与模型组比较,治疗后A组、B组髓过氧化物酶(MPO)活性及结肠损伤组织学评分(CMDI)均下降(P<0.05),IL-6、IL-8、TNF-α水平也明显下降(P<0.05),A组与B组间各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论双歧杆菌可通过降低肠道通透性,调节抑制细胞因子,对大鼠DSS结肠炎肠道黏膜发挥保护作用。     

氯化镉对小鼠免疫功能的影响

本实验观察氯化镉对小鼠免疫功能的影响。在小鼠免疫后不同时间一次灌胃１５ｍｇ／ｋｇＣｄＣｌ２时，对Ｄ２组ＤＴＨ有明显抑制作用。在不同剂量多次灌胃试验中，２．４ｍｇ／ｋｇ和４．８ｍｇ／ｋｇ组，镉对ＤＴＨ．ＰＦＣ和淋巴细胞转化均明显抑制作用，以上结果表明氯化镉对小鼠免疫功能有抑制作用。     

基因工程技术制备和鉴定抗TNF-α蛋白Fab抗体

目的 利用基因工程技术制备人源性抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白的可溶性Fab抗体,并鉴定其抗原结合活性及特异性.方法 用固相化的TNF-α蛋白从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选出表达抗TNF-α蛋白Fab抗体的阳性克隆,经酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG高效可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性.结果 成功筛选并表达了人源性抗TNF-α蛋白的Fab抗体,在非还原SDS-PAGE中形成相对分子质量47 kD的条带;Western blot分析证实表达的蛋白即Fab抗体.ELISA筛选出2株抗体(TA-04,TA-13)具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与小牛血清白蛋白无交叉反应.结论 成功表达并鉴定了人源性抗TNF-α蛋白的可溶性Fab抗体,构建了一种基因工程抗体的有效制备途径.为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础.     

葡聚糖硫酸钠致溃疡性结肠炎小鼠模型的建立

目的　建立小鼠溃疡性结肠炎模型。方法　给小鼠自由饮用5％葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液7d后,改为蒸馏水自由饮用10d,如此进行4个循环,每天观察症状。在第1个循环和第4个循环后剖杀小鼠,取出整段结肠行实体显微镜观察及切片组织学研究。结果　所观察的症状、实体显微镜像、组织学病理改变均与人类溃疡性结肠炎类似。结论　此模型制作方法简便,重复性良好,可应用于多种实验研究。     

Lactulose mediates suppression of dextran sulfate sodium-induced colon inflammation

Objective:Assessment of digestion colonic flora lactulose can be induced to produce hydrogen and prove lactulose with a potential anti-inflammatory effects. Methods:We established a mouse model of human ulcerative colitis (UC) by supplying mice with water containing dextran sulfate sodium (DSS). At 7-day, DSS-induced pathogenic outcomes, including loss of body weight, increase of colitis score, pathogenic shortening of colon length, elevated level of TNF-α, IL-1β, malondialdehyde (MDA) and myeloperoxidase (MPO) deficiency in colon lesions, were significantly suppressed by lactulose administration and intraperitoneally injected hydrogen water. Results:After eliminating colon microflora by antibiotics, the anti-inflammatory effects of lactulose were significantly compromised. Histological analysis also revealed that the DSS mediated colonic tissue destruction accompanied by neutrophils infiltration was remarkably suppressed by lactulose and hydrogen water. Conclusion:The present study indicated that lactulose can prevent the development of DSS-induced colitis and alleviate oxidative stress state in colitis.     

葡聚糖硫酸钠致溃疡性结肠炎大鼠模型的建立

目的: 建立大鼠溃疡性结肠炎(UC)模型. 方法: 给SD大鼠饮用40 g/L DSS溶液7 d,然后改正常饮水10 d. 每日进行疾病活动指数(DAI)评分. 于实验8,13和18 d分别处死4～5只,行组织学大体评分、组织病理评分及透射电镜观察. 计算盲肠、回盲部至肛门段结肠、胸腺、脾脏质量指数并测直肠髓过氧化物酶(MPO)含量. 结果:大鼠饮用40 g/L的DSS 7 d均出现腹泻、隐血试验阳性. 可见炎症主要累及黏膜和黏膜下层,部分表面上皮脱落,上皮内杯状细胞减少,隐窝破坏,浸润的炎症细胞以中性粒细胞为主. 伴有MPO升高[(8.84±3.67) nkat/g vs (127.19±27.84) nkat/g, P<0.01]及脾脏增大[(3.45±1.00) mg/g vs (5.07±1.31) mg/g, P<0.05]. 停药后症状及结肠病变逐渐恢复, MPO活性显著降低(P<0.05). 结论:此模型病理改变类似人UC.     

葡聚糖硫酸钠致溃疡性结肠炎小鼠模型的建立

目的 建立小鼠溃疡性结肠炎模型。方法 给小鼠自由饮用5%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液7d后，改为蒸馏水自由饮用10d，如此进行4个循环，每天观察症状。在第1个循环和第4个循环后剖杀小鼠，取出整段结肠行实体显微镜观察及切片组织学研究。结果 所观察的症状，实体显微镜像，组织学病理改变均与人类溃疡性结肠炎类似。结论 此模型制作方法简便，重复性良好，可应用于多种实验研究。     

Protective effect of total alkaloids of Sophora alopecuroides on dextran sulfate sodium-induced chronic colitis

Objective  

To investigate the effect of total alkaloids of Sophora alopecuroides (TASA) on dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.     

二氢杨梅素对小鼠葡聚糖硫酸钠结肠炎的疗效

目的 观察二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)治疗溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的效果并探讨其机制.方法 60只BALB/c小鼠采用随机数字表法分为正常组,模型组,DHM低剂量[50 mg/(kg·d)]、中剂量[100 mg/(kg ·d)]、高剂量[200 mg/(kg·d)]组,5-氨基水杨酸[5-amino saliciylic acid,5-ASA,50 mg/(kg·d)]组.分组当日给予正常组小鼠蒸馏水自行饮用,其余组小鼠给予4％葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液7d诱导急性UC模型.于饮用DSS当日开始,用DHM各剂量组及5-氨基水杨酸组按各组拟定剂量分别进行灌胃处理,连续给药14 d.对比各组疾病活动指数(DAI)、结肠长度、脾脏指数的变化、结肠组织学评分,肠组织TLR2、TLR4和NF-κB的活性以及炎性细胞因子IL-1β、TNF-oα、IL-6表达及MPO、NO、SOD的活性变化.结果 与模型组比较,DHM可显著降低结肠组织中TLR2、TLR4、NF-κB的表达,减少炎性因子如IL-1β、TNF-oα、IL-6水平,同时还能够减少肠组织中MPO、NO活性及增加SOD的活性.其中DHM高剂量组优于低、中剂量组,差异有统计学意义(P＜0.05),治疗效果最明显,其与5-氨基水杨酸组相比差异无统计学意义(P＞0.05),治疗效果相当.结论 DHM可显著缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症,其作用机制可能与抗炎、抗氧化有关.     

参苓白术散对溃疡性结肠炎的抗炎作用及机制研究

目的:探讨参苓白术散是否通过保护肠道黏膜屏障抑制萄聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)诱导的结肠炎大鼠的炎症反应。方法:40只清洁级SD大鼠随机分为正常对照组、DSS模型组、中剂量参苓白术散组、高剂量参苓白术散组和柳氮磺吡啶组。除正常对照组外,大鼠饮用水中添加DSS溶液(40 g/L)自由饮用,治疗组同时灌胃相应剂量的参苓白术散/柳氮磺吡啶。检测大鼠体重、疾病活动指数(disease activity index,DAI)、结肠长度、小肠黏膜渗透性,评价参苓白术散对结肠炎有无治疗作用。酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析大鼠结肠组织匀浆的白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子ɑ(tumour necrosis factor,TNF-ɑ)等细胞因子的含量,探讨参苓白术散对肠道黏膜的保护作用。结果:DSS组中IL-6、TNF-ɑ含量高于正常对照组(P<0.05),而IL-10水平低于正常对照组(P<0.05)。中剂量参苓白术散、高剂量参苓白术散和柳氮磺吡啶组的TNF-ɑ水平明显低于DSS组(P<0.01),且在中、高剂量的参苓白术散组中呈浓度依赖性;高剂量参苓白术散和柳氮磺吡啶组的IL-6水平明显低于DSS组(P<0.05);中剂量参苓白术散、高剂量参苓白术散和柳氮磺吡啶组的IL-10水平明显高于DSS组(P<0.01),且在中、高剂量的参苓白术散组中呈浓度依赖性。结论:参苓白术散可以通过调节肠道黏膜组织中细胞因子的功能,如IL-10、IL-6及TNF-ɑ等,保护肠道黏膜屏障,从而可以缓解DSS结肠炎大鼠的炎症反应。     

Changes of CD8+ T cells in dextran sulfate sodium-induced colitis mice pretreated with oral immune regulation

Background  It has been reported that CD8⁺ regulatory cells could be induced upon oral tolerance. The purpose of this study was to investigate the changes of CD8α⁺ T cells in dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis mice pretreated by oral immune regulation.

Methods  The effects of five low oral doses of colitis-extracted proteins (CEP) on colitis were evaluated by clinical manifestation and histological lesions. The percentages of CD8α⁺ T cells gating on CD3⁺ T cells were evaluated in the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and the spleens by flow cytometry. Differences between the two groups were compared by Student’s t test or Mann-Whitney U test.

Results  Compared to bovine serum albumin (BSA)-fed control mice, administration of CEP resulted in marked alleviation of colitis. The proportion of CD8α⁺ T cells, not only in intraepithelial lymphocytes (IELs) and lamina propria lymphocytes (LPLs) of the large intestine (LI) but also in spleen from CEP-fed colitis mice, was significantly higher than that from BSA-fed colitis mice (LI-IELs: (71.5±5.4)% vs. (60.1±4.3)%, P <0.01; LI-LPLs: (60.7±5.2)% vs. (51.9±4.7)%, P <0.01; spleen: (24.1±3.6)% vs. (20.3±4.1)%, P <0.05; n=8). Mucosal repair in repair-period mice five days after termination of DSS treatment was also accompanied by an increase of CD8α⁺ T cells in large intestinal mucosal lymphocytes (LI-IELs: (72.1±3.7)% vs. (61.5±4.5)%, P <0.01; LI-LPLs: (62.1±5.7)% vs. (52.7±3.6)%, P <0.01; n=8). The proportion of CD3⁺ T cells increased in Peyer’s patches (PPs) and decreased in mesenteric lymph nodes (MLNs) from colitis mice compared to untreated mice, whereas the change pattern of CD3⁺ T cells in PPs and MLNs from CEP-fed colitis mice was just on the contrary.

Conclusion  Improvement of DSS-induced colitis resulted from oral immune regulation is associated with an increase in CD8α⁺ T cells in spleen and large intestinal mucosa.