色谱最新研究亮点

1 多维分离技术新进展 一维色谱是目前最常用的分离分析方法,然而对于复杂体系如蛋白质组,采用一维分离模式其分离度远远不能满足要求.Giddings理论告诉我们:对于分离机理相互正交的二维分离系统(如色谱),峰的容量应该为两个色谱柱峰容量的乘积.因此,多维分离系统是解决复杂分离体系的一个最佳选择.在多维色谱中二维气相色谱发展较快,目前全二维气相色谱仪业已商品化,其峰的容量达到104以上.而二维液相色谱,尤其是正相/反相二维液相色谱技术发展较为缓慢,其主要的技术瓶颈在于第一维色谱(正相)分离后的流动相严重干扰第二维色谱(反相)的分离.     

临床化学上氨基酸、有机酸及核苷类的二维薄层色谱多相分离

在同一块薄层板上多相二维分离３０余种氨基酸、４０余种非挥发性有机酸和２０余种碱基。核苷类化合物。应用一对新的展开剂,用紫外灯－吖啶试剂－镉茚三酮试剂组合显色定位分析,改良了尿液非挥发性有机酸的溶剂萃取。尿液中此三类化合物提取物的多相二维色谱分离效果良好。     

反相/亲水色谱法分析糖苷类化合物

根据皂苷、黄酮苷等糖苷类化合物的结构特点,采用亲水色谱模式分析该类化合物,以弥补反相色谱模式分离结构类似糖苷类化合物选择性的不足。首先选择14个糖苷类化合物,比较了反相色谱柱(XAqua C18)和亲水色谱柱(Click XIon)的分离效果,评价了反相/亲水色谱的正交性,并构建了反相/亲水二维体系用于西洋参样品的分离。结果表明,糖苷类化合物在反相及亲水色谱柱上均有很好的保留,但两者具有不同的分离选择性,14种物质在反相和亲水柱的出峰顺序有较大差异,在反相色谱中不易分离的人参皂苷Rg1和Re在亲水色谱柱可获得很好的分离,反相/亲水模式分离糖苷化合物具有很好的正交性。以构建的RPLC/HILIC二维色谱体系分离西洋参样品,有效地提高了分离能力及峰容量,有利于后续更多极性及微量化合物的制备、结构表征与活性研究,且该方法操作简便、流动相兼容性好,可作为糖苷分离分析、制备的有效手段,也可以为其他中药复杂体系的分析提供参考。     

反相/亲水色谱法分析糖苷类化合物

根据皂苷、黄酮苷等糖苷类化合物的结构特点,采用亲水色谱模式分析该类化合物,以弥补反相色谱模式分离结构类似糖苷类化合物选择性的不足。首先选择14个糖苷类化合物,比较了反相色谱柱(XAqua C18)和亲水色谱柱(Click XIon)的分离效果,评价了反相/亲水色谱的正交性,并构建了反相/亲水二维体系用于西洋参样品的分离。结果表明,糖苷类化合物在反相及亲水色谱柱上均有很好的保留,但两者具有不同的分离选择性,14种物质在反相和亲水柱的出峰顺序有较大差异,在反相色谱中不易分离的人参皂苷Rg1和Re在亲水色谱柱可获得很好的分离,反相/亲水模式分离糖苷化合物具有很好的正交性。以构建的RPLC/HILIC二维色谱体系分离西洋参样品,有效地提高了分离能力及峰容量,有利于后续更多极性及微量化合物的制备、结构表征与活性研究,且该方法操作简便、流动相兼容性好,可作为糖苷分离分析、制备的有效手段,也可以为其他中药复杂体系的分析提供参考。     

薄层色谱实验的改进及教学探讨

以对二甲氨基偶氮苯和反式偶氮苯的混合物作测试样,在薄层板上点样后于单一溶剂和不同比例的混合溶剂中展开,考察样品极性和溶剂极性变化对薄层色谱分离效果的影响;以乙酰苯胺和苯甲酰胺作测试样,点样展开后分别在紫外灯下和碘缸中显色,让学生能够熟练掌握一些常用的薄层色谱显色方法;对实验过程中的一些关键性问题,如物质极性与展开剂的选择、显色方法和分离效果等进行了教学方法探讨。     

引言

反相液相色谱(RPLC)是当前色谱分离中应用最为广泛的色谱模式,依靠疏水固定相与溶质之间的疏水相互作用实现弱极性和中等极性化合物的高效分离。但是,RPLC 对极性化合物(如寡糖、强极性寡肽、药物等) 的保留很弱,甚至不保留。反相离子对色谱(RPIC)、离子交换色谱(IEC)和正相色谱(NPLC)等可以作为RPLC 的补充,用于极性化合物的分离。然而,它们又各自存在一定的局限性,不能满足当前复杂样品的分离和表征需求。
亲水作用色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)作为一种分离极性化合物的液相色谱模式,其概念最早由Alpert 于1990 年提出。HILIC 的主要特征是使用类似于NPLC 的极性固定相和水/有机溶剂(通常是乙腈)作为流动相,其中水是强洗脱溶剂。与NPLC 类似,在HILIC 模式下化合物的保留时间随其极性增强而增加。HILIC越来越受到关注和重视,一方面是因为强极性化合物的分离问题引起了各个研究领域的重视,包括药物分析、食品分析及蛋白质组学等领域都不同程度地涉及极性化合物的分离问题;另一方面是由于HILIC 具有其自身的优势。首先,HILIC 模式对强极性和亲水性化合物具有很好的保留和分离选择性,是解决各类强极性和亲水性化合物分离问题的可靠手段。其次,HILIC 模式使用的流动相体系相对简单,操作方便,而且克服了NPLC 的流动相溶解性差、保留时间对流动相中水含量十分敏感以及质谱兼容性差等问题。此外, HILIC的分离机理与RPLC 完全不同,两者的分离选择性有很好的正交性,适合用于构建HILIC-RPLC 二维色谱系统,是解决复杂样品分离问题的有效手段之一。近十年来,HILIC分离材料、分离原理和分离方法开发等领域均取得了巨大进展,在食品、药品、天然产物、蛋白质组以及代谢组学等分离分析中的应用日益广泛和成熟。     

反相高效液相色谱分离杨树皮中酚酸化合物

对于酚酸化合物的分离,过去多用正相薄层色谱法,但效果不甚好。近来国外学者开始采用反相薄层色谱及反相液相色谱分离,效果大大提高。本文使用两种方法,在反相高效色谱柱上完成了对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸,包括对香豆酸和阿魏酸异构体的分离,并研究了上述化合物的保留值与流动相中有机相比例的关系。     

胶束薄层色谱及其应用

1979年美国D.W.Armstrong等开始研究胶束薄层色谱(Micellar Thin Layer Chromatography)。胶束薄层色谱是用低浓度的表面活性剂的水溶液(或非极性有机溶液并含有少量水)作展开剂,常以聚酰胺、氧化铝、硅胶或硅烷化的硅胶作固定相的一种薄层色谱。胶束薄层色谱分正相胶束薄层及反相胶束薄层两种。     

基于双回路技术的二维色谱在线/离线接口设计与评价

双回路技术是一套机械传动组件和流路系统,具有自动进样和馏分收集的双重功能。本研究基于双回路技术设计了一种二维液相色谱在线/离线接口,用以有效连接两种不同分离模式构建分离系统,提高系统峰容量,并对其功能进行了评价。以4种芳香族化合物为分离对象,利用设计的接口连接1套液相色谱系统,实现了进样、馏分收集、再进样纯度分析的多重操作集成;连接2套液相色谱系统,采用强阳离子交换模式对5种蛋白质样品进行初步分离,收集难分离组分,并通过再次进样到反相色谱模式的分离系统中,组分得到良好分离。进一步基于此接口连接1套强阳离子交换系统和1套微柱反相色谱系统,对牛血清白蛋白酶解产物进行在线二维分离,以1 m AU为积分阈值,共识别292个色谱峰。新型在线/离线接口可灵活实现样品微量制备、难分离组分的精细拆分和复杂样品的二维分离,为二维色谱系统的构建及分离研究提供了有力工具。     

蛋白质高效分离两维色谱柱的选择优化

为了构建高效的离子交换/反相二维液相色谱(IEC/RPLC)分离平台系统,提高复杂蛋白质样品的分离效率,对色谱柱进行了评价与筛选。通过对实际人肝蛋白质样品的分离效果的比较,选择确定了TSKgel DEAE-5PW弱阴离子交换色谱柱(WAX)作为第一维色谱分离柱;考察了同一规格的10支代表性反相色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 30 nm, C4、C8或C18),通过评价其对尿嘧啶、硝基苯、萘和芴的分离性能以及对3种标准蛋白质样品的非特异性吸附、对人肝蛋白质样品的WAX馏分的分离效果,最终确定以Jupiter 300 C4反相色谱柱作为第二维色谱分离柱。对两维色谱柱的选择优化为蛋白质高效分离二维液相色谱平台的搭建提供了可靠基础。     

基于巯基-烯点击化学法的β-环糊精固定相多模式色谱保留行为研究

基于巯基硅胶与单取代-6A-烯丙氨基-β-环糊精的巯基-烯点击化学反应,制备了β-环糊精(Click TE-CD)共价键合固定相。元素分析结果表明β-环糊精被成功键合到硅胶表面。以黄酮苷类化合物为模型,考察了Click TE-CD固定相在亲水、反相和超临界流体色谱等分离模式下的色谱保留行为。黄酮苷类化合物保留时间随流动相中乙腈含量的变化呈现典型的U型曲线,表明Click TE-CD固定相具有亲水/反相的双重保留特性。应用几何学方法测得Click TE-CD固定相在反相/亲水、亲水/超临界、反相/超临界混合模式下的正交性分别为69.8%、50.8%、50.8%。对比复杂中药样品降香提取物在反相、亲水、超临界等模式下的分离情况,结果表明Click TE-CD固定相在分离中药复杂样品方面具有极大潜力,可以在一根色谱柱上通过分离模式的改变,实现二维液相色谱的分离。Click TE-CD固定相不同分离模式的分离性能和较好的正交性表明该固定相具有在液相色谱方法发展和二维液相色谱分离方面应用的潜力。     

亲水作用色谱研究及环糊精固定相的应用

目前在诸多领域中,强极性和亲水性物质的分离问题引起了研究者们相当程度的重视。从理论上讲,使强亲水性及强极性的样品在色谱上有适当保留的根本方法应当是使样品被极性的固定相所吸附,并被洗脱剂中极性更强的组分洗脱后富集。由于分离分析和制备中广泛应用的反相液相色谱对极性物质的保留和分离能力相对较弱,故近年来一种新的色谱类型—亲水作用色谱,在极性化合物分离方面的应用得到了越来越多的关注。亲水作用色谱具有流动相组成简单、分离效率较高、与质谱兼容性较好等优势,成为色谱领域研究的热点之一。环糊精及其聚合物作为一种吸附剂在亲水作用色谱固定相中的应用也崭露头角,其以独特的包结性质在分离分析及有机分子识别方面具有重要应用,在多维色谱联用及手性分离方面亦具有一定的潜力。本文对近几年来环糊精作为亲水作用色谱固定相的研究进行了综述,以期提供有价值的参考。     

磺酸甜菜碱型两性离子亲水作用色谱固定相的制备及色谱性能评价

以丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEA)和1,3-丙磺酸内酯为原料,合成了含磺酸甜菜碱型两性离子的N,N-二甲基-N-丙烯酰氧乙基-N-丙基磺酸铵(DMAEAPS)功能单体,通过原子转移自由基聚合(ATRP)技术将其接枝到硅胶表面,制备了磺酸甜菜碱型两性离子色谱固定相(Sil-DMAEAPS)。研究了该固定相对安息香、维生素B6、芸香叶苷、对香豆酸和咖啡酸5种极性溶质的亲水作用色谱分离性能。结果表明,在典型的亲水作用色谱条件下,极性溶质的保留主要由静电作用和亲水作用控制;而在典型的反相色谱条件下,极性溶质则表现出反相柱的分离特征。与ZIC-HILIC商品柱进行对比,自制色谱柱对5种极性溶质表现出不同的分离选择性。将自制色谱柱用于芦丁片中芸香叶苷含量的测定,操作方法简单,为极性样品的分离提供了新方法。     

高效液相色谱讲座（Ⅵ）化学键合固定相色谱（下）

6—4 反相色谱 反相色谱通常是指以具有非极性表面的担体为固定相,以比固定相极性更强的溶剂系统为流动相的色谱分离。一个典型的例子就是在十八烷基硅烷键合相上用甲醇/水混合溶剂冲洗。“反相色谱”是相对于“正相色谱”而言的,在后一种情况下,使用极性固定相(如硅胶)和非或弱极性的流动相     

高温二维液相色谱系统的构建及其评价

在二维液相色谱中, 第二维的分离速度是制约其发展的重要因素. 升高色谱柱温度可以有效降低流动相粘度, 加快溶质在两相间的传质速率, 有效加快分析速度. 以离子交换色谱法(WAX)为第一维分离模式和反相色谱法(RP)为第二维分离模式, 十通阀和两个捕集柱为接口, 通过将第二维色谱柱温度升高到80 ℃和提高流量到3 mL/min, 构建了高温WAX/RP二维液相色谱系统. 以4种标准蛋白的酶解物为样品评价系统的分离性能, 第一维共有33个馏分被捕集并导入到第二维分析, 高温二维液相色谱系统识别出187个色谱峰.     

高温正相色谱/反相色谱(HTNPLC/RPLC)二维联用系统的构建与应用

为解决含水正相色谱与反相色谱联用过程中的谱带展宽问题,以高温正相色谱(HTNPLC)为第一维,室温反相色谱(RPLC)为第二维,分别建立了切割模式的二维液相色谱(HTNPLC-μRPLC)和全二维液相色谱(HTNPLC×RPLC)系统.样品首先在第一维(CN色谱柱)进行正相分离,第一维洗脱产物选择性地或者交替存储在十通阀上的定量环中,然后切换十通阀将定量环内存储的样品组分转移到第二维(C18色谱柱)进行反相分离.该系统降低了第一维切割组分在第二维柱头的扩散,提高了分离度以及分离效率.采用多环芳烃混合物和天然植物甘草提取液对该二维液相色谱系统进行了评价.     

人参皂苷正相薄层色谱二维分离的优化

 在薄层色谱分离人参皂苷的两种互补性的流动相组分比例与皂苷比移值呈相关关系的基础上 ,以薄层色谱分离中距离最小的两点之间的距离Dmin为优化标准 ,对人参皂苷的二维分离结果进行预测和优化。通过计算机扫描不同流动相组成下的Dmin值得到的三维网络图显示出的最大Dmin下的二维流动相的组成 ,即为达到最佳二维分离结果的流动相组成。以优化的流动相对皂苷进行二维展开 ,分离结果与预测结果吻合 ,且比一维展开分离出了更多的新的皂苷组分。     

色谱最新研究亮点（第7期）

1多维分离技术新进展 一维色谱是目前最常用的分离分析方法,然而对于复杂体系如蛋白质组,采用一维分离模式其分离度远远不能满足要求。Giddings理论告诉我们：对于分离机理相互正交的二维分离系统(如色谱),峰的容量应该为两个色谱柱峰容量的乘积。因此,多维分离系统是解决复杂分离体系的一个最佳选择。在多维色谱中二维气相色谱发展较快,目前全二维气相色谱仪业已商品化,其峰的容量达到104以上。而二维液相色谱,尤其是正相/反相二维液相色谱技术发展较为缓慢,其主要的技术瓶颈在于第一维色谱(正相)分离后的流动相严重干扰第二维色谱(反相)的分离。最近,中国科学院大连物理化学研究所的关亚风教授课题组研制出一种新型二维液相色谱接口真空辅助动态气化接口,并将其成功地用于正相/反相二维液相色谱系统。该接口设计简单,由一个真空辅助气化环组成。该气化环与真空泵相连构成真空辅助气化环境。在二维色谱过程中,正相色谱流出的流动相(有机溶剂)经过该接口时通过真空挥发除去,而分离组分能够流入第二维色谱柱。他们对该接口的工作条件进行了优化并对其性能进行了考察。研究表明,在第一维流动相流速达到1 mL/min时该接口能够有效地除去第一维流动相,而非挥发性分析物质在该接口中几乎没有损失。他们将构建的正相/反相二维液相色谱系统成功地用于原油和煤焦油复杂样品的分离分析。我们相信这种新型的正相/反相二维液相色谱系统在复杂体系分离分析如蛋白质组、天然药物和生物流体具有潜在的应用前景。详见: J Chromatogr A, 1 July 2010, doi: 10.1016/j.chroma.2010.06.053。 在多维分离中,二维凝胶电泳具有分离效率高的特点,目前仍然是蛋白质组学研究的重要手段之一。然而,由于二维凝胶电泳重现性差,分析时间长,不能自动化,远远不能满足当今蛋白质组学研究的要求。与传统的电泳技术相比,毛细管电泳具有分离效率高、样品用量少、分析时间短、能够自动化等特点,是发展多维电泳方法的理想选择。最近,美国华盛顿大学的Dovichi教授课题组对二维毛细管电泳模式进行了尝试,构建了等电点聚焦/十二烷基磺酸钠(SDS)区带毛细管电泳系统。该系统的分离模式与传统的二维凝胶电泳基本相近,第一维采用等电点聚焦分离模式, 第二维采用SDS区带电泳分离模式。在二维毛细管电泳中,蛋白质样品首先经过等电点聚焦分离后,依次进入第二维SDS区带电泳分离通道。 该系统第一维等电点聚焦所需时间约为420 s,在第二维分离中每一馏分样品转移时间为6 s,分离时间为180 s。与传统的二维凝胶电泳相比,二维毛细管电泳方法显著地减少了分析时间和样品用量。他们以荧光标记蛋白质为模型样品,采用激光诱导荧光检测方法对该系统性能进行了考察,获得的峰容量为125。虽然目前该二维分离系统的峰容量远低于传统的二维凝胶电泳,但是我们相信二维毛细管电泳技术应该代表着多维电泳未来的发展方向。详见: Electrophoresis, 5 July 2010, doi: 10.1002/elps.201000151。 2基于癌细胞膜的亲和色谱药物筛选 将生物分子(如酶、辅酶、抗体、抗原等)为配体固载于担体(如二氧化硅)的表面构成的亲和色谱固定相已被广泛地用于生物分子的相互作用和药物的筛选。最近,西安交通大学的贺浪冲教授课题组以细胞膜为配体,制备了一种新型的亲和色谱固定相,成功地用于天然抗癌药物有效成分的筛选。他们所用的细胞膜来自于人的皮肤鳞癌细胞 (human epidermal squamous cells, A431)。该细胞膜中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)呈现过表达现象。EGFR是一种相对分子质量为170000的跨膜糖蛋白,它对调节肿瘤细胞生长、修复和生存、新生血管生成、侵袭和转移具有重要的作用,在大多数肿瘤细胞(如乳腺癌、宫颈癌,肺癌、前列腺癌等)中呈现过表达,已经成为肿瘤治疗和抗肿瘤药物筛选的潜在靶点。该细胞膜亲和色谱原理就是基于EGFR与某些物质(如药物分子)的相互作用。 他们首先提取A431细胞膜,通过吸附作用将细胞膜固载于硅胶载体表面构成亲和色谱固定相,然后构建了基于二维液相色谱的药物筛选系统。在该系统中,第一维采用的是细胞膜亲和色谱模式,第二维采用的是反相色谱模式,紫外吸收和质谱方法分别用于各维的检测。他们将该二维液相色谱系统用于苦参萃取液中抗癌有效成分的筛选,其结果与传统的细胞培养筛选的结果基本一致。与传统的方法相比,细胞膜亲和色谱方法具有样品用量少、分析时间短、能够自动化、同时能对筛选的靶标分子进行鉴定等特点,将在新药的筛选方面有潜在的应用前景。详见: J Chromatogr A, 19 June 2010,doi: 10.1016/j.chroma.2010.06.037。 3动物组织在线液相萃取直接进样的液相色谱系统 在新药物筛选以及临床药代动力学研究过程中,全身放射自显影技术目前是用来检测药物在给药动物体内分布状况的常用方法。然而,全身放射自显影方法不能区分检测药物和它们的代谢产物。最近,美国橡树岭国家实验室的两位科研人员Kertesz和Berkel对液相色谱商品化自动进样器进行改进,构建了一种在线液相萃取表面进样系统,并成功地用于液相色谱/电喷雾离子化质谱联用系统,实现了对小鼠全身组织萃取液中药物和它们的代谢产物的分离检测。该进样系统设计简单,通过一个微型接口将一个普通注射器与自动进样器连接以实现液滴萃取模式。在实际操作时,首先将注射器中萃取剂的液滴与动物组织表面接触实现液相萃取,然后由自动进样器将萃取的样品送入液相色谱/质谱系统。他们以对剂量组和对照组小鼠整体薄层组织切片的4个不同器官(脑、肺、肾和肝脏)中药物心得安 (propranolol)的检测为例,阐明了基于在线液相萃取表面进样的分离技术联用系统的有效性。他们在剂量组小鼠的4个器官中均可检测到药物心得安,另外在肺、肾和肝脏还检测到药物心得安的两个同分异构体代谢物。实验结果与常规的离线萃取进样-液相色谱/质谱方法结果相当。该方法能够对药物在动物体内的分布状况和代谢过程进行有效的检测。通过在线液相萃取实现薄层组织切片表面进样及其与液相色谱分离分析联用扩展了液相色谱/质谱的应用范围。这一方法为新药物筛选提供了一种有效的手段。详见: Anal Chem, 18 June 2010, doi: 10.1021/ac100954p。     

毛细管电中中性溶质在氰基柱上分离机理的研究

 对中性溶质在氰基柱上的毛细管电色谱（CEC）分离特征进行了研究 ,讨论了流动相中有机调节剂种类及其体积分数、缓冲液种类等对溶质迁移速率的影响。通过对样品在氰基柱上的分离行为与其在反相ODS柱和正相SI柱上的分离行为的比较 ,说明中性溶质在氰基柱上的分离机理既具有部分反相特征又具有部分正相特征。受两种机理的影响 ,在不同的操作条件下极性不同的中性溶质在氰基柱上的迁移速率差别很大 ,较一般的正相和反相电中更易出现出峰顺序变化的现象 ,也说明这种分离模式更易于进行分离选择性调节。     

亲水/反相二维制备液相色谱法分离纯化络石藤中的化学成分

建立了亲水/反相二维制备液相色谱(Pre-2D-HILIC/RPLC)分离纯化络石藤中化学成分的分析方法。络石藤药材经醇提、活性炭脱色后用反相固相萃取柱除去色素和强极性物质,最终得到干燥的浅黄色粉末。一维亲水色谱选择Click XIon色谱柱(250 mm×20 mm,10μm)作为固定相,水和乙腈作为流动相,进行梯度洗脱,以紫外触发模式收集馏分,共得到15个组分。二维反相色谱选择C18色谱柱(250 mm×20 mm,5μm)作为固定相,水和乙腈作为流动相,进行梯度洗脱,最终得到14个高纯度化合物,并通过质谱和核磁共振对其进行确认。实验结果表明,该法具有良好的正交选择性,可以有效提高分离度和峰容量,对于分离络石藤等复杂样品具有重要意义。