来氟米特对肝星状细胞增殖和胶原合成的影响

目的:研究来氟米特活性代谢物A771726对肝星状细胞(HSC)增殖和胶原合成的影响.方法:用链蛋白酶和胶原酶原位肝灌注、Nycodenz密度离心法分离大鼠HSC和Kupffer细胞,制备Kupffer培养上清液(KCCM),并以不同浓度、不同培养时间的CCl4损伤的KCCM作为刺激因素观察了A771726对HSC增殖(3H-TdR掺入法)和胶原合成(3H-Pro掺入法)的影响.ELISA法测定KCCM内TGF-β、TNF-α和IL-1含量.结果:HSC和Kupffer细胞得到较好的分离.CCl4损伤的KCCM显著增加HSC增殖和胶原合成,并且稀释度为1:2的KCCM在培养7 d时,对HSC增殖和胶原合成的刺激作用明显.A771726(0.001～10 μmol/L)对CCl4损伤的KCCM刺激HSC增殖和胶原合成有不同程度的抑制作用,并且A771726(0.001～10 μmol/L)明显抑制CCl4损伤KCCM内升高的TGF-β、TNF-α和IL-1水平.结论:CCl4损伤的KCCM可明显刺激HSC增殖和胶原合成,而A771726对此有明显的抑制作用,并且与其抑制致HSC激活的因子如TGF-β、TNF-α和IL-1分泌有关.     

红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞中Wnt信号通路的影响及其意义探讨

目的:通过观察经红景天甙、乙醛处理后的大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)增殖速度的变化以及细胞内Wnt信号通路中主要下游分子及目的基因mRNA表达和蛋白水平的改变,探讨Wnt信号通路在HSCs中的作用,以及红景天甙对大鼠HSCs Wnt通路和细胞增殖的影响.方法:用红景天甙及乙醛处理体外培养传代的大鼠HSCs [1],MTT法绘制细胞生长曲线,采用RT-PCR和Western blot的方法分别观察Wnt信号通路中β-catenin和细胞周期蛋白DI(Cell cycle protein D1,CyclinD1)及相关指标的变化.结果:从各组细胞生长曲线的对比发现:红景天甙处理组细胞的增殖速度相对于单用乙醛组明显降低.单用乙醛刺激的大鼠HSCs中,Ⅰ型胶原(Collagen α1) [2]、β-catenin和CyclinD1的mRNA表达和蛋白合成均明显增强(P＜0.05),红景天组中Cyclin D1和β-catenin的mRNA表达和蛋白合成均出现不同程度的下降(P＜0.05).结论:Wnt信号通路参与了乙醛刺激的大鼠HSCs活化,红景天甙可能是通过降低大鼠HSCs中Wnt信号通路的活性,从而抑制乙醛刺激的大鼠HSCs的增殖.     

内毒素对原代大鼠肝星状细胞表达结缔组织生长因子影响机制的研究

目的研究内毒素（LPS）与其刺激的Kupffer细胞（KCs）培养上清（KCCM）及NF—κB通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）对大鼠原代肝星状细胞（HSCs）表达结缔组织生长因子（CTGF）的影响,探讨LPS刺激HSCs表达CTGF的机制。方法分离培养原代大鼠HSCs、KCs。培养72h的KCs经1mg／LLPS刺激48h后收集上清标记为KCCM1。未经LPS刺激的上清标记为KCCM0。将培养72h的HSCs随机分为空白对照组、KC—CM0组、LPS组、KCCM1组、PDTC组、（PDTC＋LPS）组、（PDTC＋KCCM1）组。各组HSCs经相应的处理48h后,Westernblot检测各组HSCs表达CTGF水平,ELISA检测培养上清中I型胶原含量。结果各组HSCs中CTGF蛋白表达水平为：空白对照组（1．95-±0．67）、KCCM0组（2．15±1．10）、LPS组（4．56±4．16）、KCCM1组（5．21±3．23）、PDTC组（0．06±0．02）、（PDTC＋LPS）组（0．10±0．08）、（PDTC＋KCCM1）组（2．77±4．08）。LPS与KCCM1作用于HSCs后CTGF表达增加（P〈0．05）;PDTC几乎可以完全阻断正常及LPS刺激的HSCs表达CTGF（P〈0．01）,但只能降低KCCM1组CTGF的表达（P〈0．05）：KCCM1组HSCs上清中I型胶原的含量增加（P〈0．05）。结论LPS可直接通过HSCs内的NF—κB通路使其表达CTGF水平上调,LPS刺激的KCs还可能通过其他途经使HSCs表达CTGF水平上调。     

Erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Ⅰ型胶原分泌及TGF-β1 mRNA的表达

目的:探讨细胞外信号调节激酶(Erk)信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞(HSCs)Ⅰ型胶原分泌及TGF-β1表达的影响.方法:用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流,Metrizamide密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞,采用ELISA法定量测定PD98059阻断乙醛激活的肝星状细胞Erk活性后HSCs培养上清Ⅰ型胶原,RTPCR检测HSCs中TGF-β1mRNA.结果:PD98059在20μmol/L时可影响HSCsⅠ型胶原分泌及TGF-β1表达,但无统计学意义(P>0.05),50,100μmol/L抑制作用明显(P<0.05或P<0.01),呈剂量效应关系;TGF-β1表达与Ⅰ型胶原分泌呈正相关(r=0.93).结论:Erk信号传导通路是调控乙醛刺激的HSCsⅠ型胶原分泌及TGF-β1表达的重要通道,通过减少TGF-β1自分泌过程可能是PD98059抑制Ⅰ型胶原分泌的途径之一.     

AcSDKP对大鼠活化HSCs增殖及分泌细胞外基质的影响

目的 通过N-乙酰基-丝氨酸-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)干预,观察其对活化肝星状细胞(HSCs)的增殖以及合成和分泌细胞外基质(ECM)的影响.方法 大鼠原代HSCs分离、培养和鉴定后,分别给予0.01、0.1、1、10、100 nmol/LAcSDKP进行干预,设立空白对照组.MTT法检测AcSDKP干预对HSCs增殖的影响;RT-PCR技术检测活化HSCs Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)mRNA表达;酶联免疫法检测培养细胞上清液透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)含量.结果 与空白对照组相比,1、10 nmo/L AcSDKP干预显著抑制活化HSCs的增殖;1、10 nmol/L及0.1～100 nmoI/L AcSDKP的干预,分别显著抑制HSCs Col Ⅰ mRNA和ColⅢmRNA表达;0.1、1、10 nmol/L和0.1、1 nmol/L AcSDKP干预可分别显著抑制培养上清液HA和LN的表达.结论 本实验发现,AeSDKP可抑制活化HSCs合成和分泌ECM,并呈现一定的剂量依赖性,以浓度为1 nmol/L时作用最为显著.其作用机制可能与抑制HSCs增殖而使合成和分泌ECM的HSCs数量减少有关.     

AcSDKP对大鼠活化HSCs增殖及分泌细胞外基质的影响

目的通过N-乙酰基-丝氨酸-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)干预,观察其对活化肝星状细胞(HSCs)的增殖以及合成和分泌细胞外基质(ECM)的影响。方法大鼠原代HSCs分离、培养和鉴定后,分别给予0.01、0.1、1、10、100nmol/LAcSDKP进行干预,设立空白对照组。MTT法检测AcSDKP干预对HSCs增殖的影响;RT-PCR技术检测活化HSCsⅠ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)mRNA表达;酶联免疫法检测培养细胞上清液透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)含量。结果与空白对照组相比,1、10nmol/LAcSDKP干预显著抑制活化HSCs的增殖;1、10nmol/L及0.1～100nmol/LAcSDKP的干预,分别显著抑制HSCsColⅠmRNA和ColⅢmRNA表达;0.1、1、10nmol/L和0.1、1nmol/LAcSDKP干预可分别显著抑制培养上清液HA和LN的表达。结论本实验发现,AcSDKP可抑制活化HSCs合成和分泌ECM,并呈现一定的剂量依赖性,以浓度为1nmol/L时作用最为显著。其作用机制可能与抑制HSCs增殖而使合成和分泌ECM的HSCs数量减少有关。     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学

目的 研究化学合成的小干扰RNA(483 siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达及细胞生物学特性的影响.方法 以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483siRNA转染培养72 h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组.收集孵育96 h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT-PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量.结果 与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调(92±5)%,α-SMA染色阳性细胞减少(58±6)%,细胞增殖活性下调(18±5)%,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调(53±6)%和(41±7)%;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低(48±5)%和(33±8)%.结论 483 siRNA能显著下调原代HSCsCTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌.提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力.     

枯否细胞条件培养基及混合血清对肝星状细胞HSC-T6的刺激作用

目的探讨枯否细胞条件培养基(KCCM)、混合的新生牛血清(NBS)和大鼠血清(RS)对肝星状细胞(HSC)增殖和胶原合成的促进作用.方法采用KCCM、单纯NBS及混合血清刺激大鼠HSC-T6细胞,用3H-TdR和3H-脯氨酸掺入法检测HSC增殖活性和胶原合成状况.结果不同刺激剂作用48 h后,HSC均体积增大,胞突增多延长,核分裂像增多.48 h的3H-TdR和96 h的3H-脯氨酸掺入明显增加.结论混合血清对HSC-T6的综合激活作用较KCCM和单纯10% NBS的作用明显,能明显促进其增殖和胶原合成,是有效的肝纤维化体外模型.     

乙醛刺激大鼠肝星状细胞活化的动力学分析

目的:从动力学角度分析乙醛刺激大鼠肝星状细胞活化的时间变化,以确定大鼠肝星状细胞活化的最佳时间,从而为后续肝纤维化的相关研究提供实验数据。方法:培养大鼠肝星状细胞,同步化处理12h,随机分为乙醛刺激组和对照组。其中乙醛刺激组细胞加入乙醛(终浓度200μmol/L)分别刺激12h、24h和36h,每12h补加一次乙醛;对照组加入等量培养基。采用MTT法测定各组细胞增殖;ELISA法检测Ⅰ型胶原蛋白、纤维黏连素;Western blotting检测α-SMA的表达。结果:加入乙醛后,细胞的增殖活性随时间的延长而增强,24h细胞增殖活性达最高峰;ELISA测定结果显示,乙醛刺激组较对照组有明显上调;Western blotting检测结果,乙醛刺激组明显促进α-SMA表达量上调,且在24h达高峰。结论:乙醛可激活大鼠肝星状细胞且活化的最佳作用时间为24h。     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学

目的研究化学合成的小干扰RNA(483 siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483siRNA转染培养72 h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96 h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT-PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调(92±5)%,α-SMA染色阳性细胞减少(58±6)%,细胞增殖活性下调(18±5)%,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调(53±6)%和(41±7)%;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低(48±5)%和(33±8)%。结论483 siRNA能显著下调原代HSCsCTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。     

红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞激活后功能的影响

目的:观察红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖、细胞周期、Ⅰ型胶原蛋白分泌及TGFβ1 mRNA表达的影响.方法:常规细胞培养,红景天甙对乙醛刺激的HSC进行处理;以MTT比色法检测细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞周期,ELISA法检测HSC内Ⅰ型胶原蛋白的分泌,RT-PCR方法检测HSC内TGFβ1 mRNA表达.结果:红景天甙可明显抑制乙醛刺激的HSC增殖;抑制乙醛刺激的HSC由G1→S期转化;抑制HSC内Ⅰ型胶原蛋白分泌和TGFβ1 mRNA表达.结论:红景天甙抗肝纤维化与抑制HSC增殖,Ⅰ型胶原蛋白分泌和TGFβ1 mRNA表达有关.     

JNK信号通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的: 初步探讨JNK信号通路调控乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(HSC)增殖的分子机制.方法: 体外培养大鼠HSC株,用c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)特异性阻断剂SP600125对乙醛刺激的大鼠HSC株进行处理,以MTT比色法检测细胞增殖,Western-blotting检测磷酸化JNK(p-JNK)水平的变化.结果: 乙醛刺激后HSC内p-JNK的水平升高,增殖明显;SP600125对乙醛刺激的HSC对p-JNK的水平有明显下调作用,同乙醛组相比有显著性差异.{MVI比值[(36.0±3.4),(24.2±1.8),(3.2±0.9)]vs (47.6±8.6),P<0.05},强度呈剂量依赖关系;同时具有抑制细胞增殖的作用: 空白对照组及乙醛组中吸光度(A)为(0.07±0.01)和(0.16±0.02),两者有显著性差异(P<0.01),经不同剂量的SP600125(20,60,100 μg/L)处理后吸光度值下降[分别为(0.13±0.01),(0.12±0.01),(0.12±0.01)],同乙醛组相比有显著性差异(P<0.05),细胞抑制率分别为19.3%,22.4%,28.6%.结论: JNK活性变化与乙醛刺激的大鼠HSC的增殖呈正相关,抑制JNK活性可影响HSC的增殖,提示JNK信号传导通路在调节HSC的增殖中起着重要的作用.     

JNK信号通路在乙醛刺激的肝星状细胞凋亡中的作用

目的: 观察用特异性c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)特异性阻断剂SP600125阻断JNK信号传导通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)凋亡的影响.方法: 体外培养大鼠HSC株;用不同浓度的SP600125(20,60,100 μg/L)对乙醛(200 μmol/L)刺激的大鼠HSC进行处理,分别以DNA片段凝胶电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡,用Western Blotting法检测JNK激酶的活性变化.结果: 不同浓度的SP600125(终浓度为20,60,100 μg/L)对乙醛刺激的HSC内p-JNK的水平有明显下调作用,强度呈剂量依赖关系,同乙醛组相比有显著性差异[MVI: (35.6±0.9),(24.4±1.1),(3.4±0.2) vs (48.2±0.9),P<0.05];同时SP600125具有促进HSC凋亡的作用: 空白对照组及乙醛组中细胞凋亡率为[(2.0±0.2)%和(6.0±0.5)% ,两者有显著性差异(P<0.05)],经SP600125处理后细胞凋亡率上升[分别为(11.1±0.4)%,(26.9±0.9)%,(33.1±1.3)%,P<0.05],同乙醛组相比有显著性差异(P<0.05).结论: SP600125通过阻断JNK通路促进HSC凋亡,故JNK信号通路可能参与了HSC的凋亡.     

转录因子ZEB1与乙醛刺激后大鼠肝星状细胞增殖的关系分析

目的:探讨转录因子ZEB1与乙醛刺激后大鼠肝星状细胞增殖的关系.方法:培养大鼠肝星状细胞并将其随机分为实验组(乙醛终浓度200μmol/L)和对照组(加入等量培养基),分别培养6h,12h,24h.利用MTT法检测各时间点的各组细胞增殖情况;ELISA试剂盒检测各组细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白含量变化;Western blotting检测细胞提取蛋白包括ZEB1、α-SMA的表达情况.结果:乙醛刺激大鼠肝星状细胞后,细胞增殖明显;Ⅰ型胶原蛋白、ZEB1及α-SMA等蛋白的表达上调,且细胞增殖程度与Ⅰ型胶原蛋白、ZEB1及α-SMA等蛋白的表达上调呈正相关.结论:乙醛刺激大鼠肝星状细胞后ZEB1通过参与大鼠肝星状细胞EMT过程,从而使细胞增殖,EMT与酒精性肝纤维化的发生发展有一定的关系.     

Erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Ⅰ型胶原分泌的研究

目的　探讨Erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Ⅰ型胶原分泌的影响。方法　用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流 ,Metrizamide密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞 ,采用PD980 5 9阻断乙醛激活的肝星状细胞Erk活性 ,以ELISA法定量测定细胞上清Ⅰ型胶原。结果　PD980 5 9在 2 0 μmol/L时可影响HSCⅠ型胶原分泌 ,但无统计学意义 (P >0 0 5 ) ,5 0、10 0 μmol/L抑制作用明显 (P <0 0 5或P <0 0 1) ,呈剂量 效应关系。 结论　PD980 5 9对乙醛刺激的HSCⅠ型胶原分泌具有抑制作用 ,提示Erk信号传导通路是调控乙醛刺激的HSCⅠ型胶原分泌重要通道。     

p38MAPK信号通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的观察用特异性p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB203580阻断p38MAPK信号通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法体外培养大鼠HSC株,用SB203580(浓度为5、10、20μmol/L)对乙醛(浓度200μmol/L)刺激的大鼠HSC进行干预,分别以酶标仪及流式细胞仪检测HSC增殖、凋亡及周期的变化。结果不同浓度SB203580对HSC增殖有抑制作用,增殖抑制率分别为21.6%、27.0%、31.5%,与乙醛对照组有显著差异(P<0.05),且呈剂量效应关系;对HSC凋亡有促进作用,凋亡率分别为(13.7±0.3)%、(14.9±0.2)%、(16.1±0.2)%,凋亡率逐渐增加,与乙醛对照组有显著差异(P<0.05),且呈剂量效应关系;可以明显阻滞乙醛刺激的HSC由G1期进入S期,G1/G0期细胞比例逐渐增高[(29.1±1.9)%、(35.5±3.4)%、(46.0±2.6)%],S期细胞比例逐渐降低[(53.4±2.6)%、(48.4±3.6)%、(43.8±1.1)%],与乙醛对照组有显著差异(P<0.05),呈...     

气相色谱法测定药物中间体2-甲基咪唑中乙醛的残留量

目的:建立药物中间体2-甲基咪唑中乙醛残留量的测定方法。方法:采用气相色谱法,液体进样,以Agilent DB-624（75 m × 530 μm × 3 μm）为分析柱,FID检测器;恒温:50 ℃,保持5.5 min;N2流量为6 mL·min-1;后运行:温度为240 ℃,保持10.5 min, 流量为8 mL·min-1。采用外标法。结果:液体进样可以避免高温条件下的基质效应对乙醛测定的影响,乙醛在1.36~ 188.96 μm·mL-1内线性关系良好,R2=0.999 9,方法的回收率在99.74％~102.87％且RSD（n=9）=1.19％,最低检出限为0.55 μm·mL-1。结论:气相液体进样法操作简单、专属性强、重现性强、灵敏度高,可以用于乙醛残留量的检测。     

Alcohol and acetaldehyde metabolism in Caucasians, Chinese and Amerinds.

Ethanol (0.4 to 0.8 g/kg in 30 minutes) was given by mouth to 102 healthy young volunteers (37 Caucasian men, 21 Caucasian women, 20 Chinese men and 24 Ojibwa men). Venous blood concentrations of ethanol and acetaldehyde 60, 90, 120 and 150 minutes after the end of drinking were measured by gas chromatography. The calculated rates of ethanol metabolism in the Caucasian men and women did not differ, but the overall group means for subgroups of Caucasians (103.6 mg/kg-h), Chinese (136.6 mg/kg-h) and Ojibwa (182.7 mg/kg-h) with decreasing postabsorption values differed significantly from each other. Mean acetaldehyde values paralleled the rates of ethanol metabolism: Ojibwa, 14.6 mug/ml; Chinese, 10.0 mug/ml; and Caucasians, 9.4 mug/ml. The high rate of ethanol metabolism in Amerind subjects differs from previous findings. Habitual level of alcohol consumption, proportion of body fat and genetic factors appear to account for most of the group differences.