脱细胞尿道及其海绵体基质制备的实验研究

目的探索脱细胞尿道及其海绵体基质的制备方法.方法取健康壮年兔完整尿道及其海绵体组织,以Triton-X 100与NH3H2O联合提取法进行脱细胞处理.标本做HE染色,组织学观察分析脱细胞效果.结果脱细胞处理11天后,成功获得脱细胞及其海绵体基质,所得基质外观良好.HE染色观察无细胞存在,弹力纤维排列规整,间隙较大,结构无破坏.结论利用Triton-X 100与NH3H2O联合提取法可成功制备完整无细胞尿道及其海绵体基质,为尿道再造修复提供崭新思路.     

一种新的脱细胞阴茎海绵体基质的制备方法

目的探索一种新的脱细胞阴茎海绵体基质的制备方法。方法取健康壮年兔完整阴茎海绵体组织，以Triton-X100与NH3·H2O（氨水）联合提取法进行脱细胞处理。标本作HE染色，组织学观察分析脱细胞效果。结果脱细胞处理25天后，成功获得脱细胞海绵体基质。所得基质外观良好。HE染色观察无细胞存在，弹力纤维排列规整，间隙较大，结构无破坏。结论利用Triton-X100与NH3·H2O联合提取法可成功制备完整无细胞阴茎海绵体基质。     

海绵体脱细胞基质和平滑肌细胞相容性的研究

目的探讨海绵体脱细胞基质（ACCM）与人脐动脉平滑肌细胞（HUASMCs）的相容性。方法以1％的Triton-X100与0．1％NH3H2O制备ACCM。异体肌肉内埋植实验评价ACCM的生物相容性。分离培养HUASMCs，噻唑蓝（MTT）法测定ACCM浸提液对HUASMCs增殖的影响。将3—5代的HUASMCs接种ACCM，共培养3、5、10d后观察HUASMCs与ACCM复合情况。结果ACCM无细胞残留，异体肌肉内埋植实验证实ACCM生物相容性良好。浸提液实验显示体外培养第4天和第6天，浸提液组A值明显高于对照组（P〈0．05）。HUASMCs能渗人ACCM内部，并分化形成平滑肌柬。结论ACCM与HUASMCs相容性良好，两者复合有望构建组织工程海绵体平滑肌。     

基于心脏全器官脱细胞基质的组织工程支架材料制备与生物学评价北大核心CSCD

目的探讨一种心脏全器官脱细胞方法,并对制备的心脏脱细胞基质支架进行检测与评价。方法通过联合使用胰蛋白酶、Triton X-100等洗涤剂,对成年SD大鼠离体心脏进行主动脉逆行灌流脱细胞处理。对制备的心脏脱细胞基质支架进行大体观察、甲苯胺蓝灌流染色、HE染色、扫描电镜观察、阿利新蓝染色、细胞外基质组分免疫组织化学染色等观察。结果成功制备心脏全器官脱细胞基质支架材料,其保留了原心脏的大体形态;HE染色、甲苯胺蓝染色及扫描电镜观察显示其保留了较好的脉管结构与超微空间构象;阿利新蓝染色及免疫组织化学染色结果显示,其主要的细胞外基质成分,包括Ⅰ型胶原、糖氨聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白保留良好。结论制备的大鼠心脏脱细胞基质支架保留了心脏原有的结构与细胞外基质成分,有望作为全器官心脏体外再造的良好组织工程支架材料。     

人脐动脉平滑肌细胞复合脱细胞基质构建海绵体平滑肌的动物实验研究

目的 探讨脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)与阴茎海绵体脱细胞基质(ACCM)复合构建海绵体平滑肌的可行性.方法 以1%的Triton-X100与0.1%NH3H2O混合液对兔阴茎海绵体进行脱细胞处理,制备ACCM.采用贴块法分离、培养、扩增HUASMC.HUASMC以30×10<'6>/ml密度接种ACCM,细胞-ACCM体外复合10 d后将复合物植入9只5周龄BALB/C裸鼠背部皮下,术后10、20和40 d分别对移植物进行HE染色、免疫组织化学染色和器官浴槽实验,评价其裸鼠体内构建情况.结果 ACCM为白色圆柱状,镜下为富含胶原的疏松多孔结构,不含细胞成分.HUA-SMC与ACCM相容性良好,HUASMC在与ACCM接触部位充分伸展,并沿ACCM窦隙活跃生长.9只裸鼠均存活,植入部位无感染,无植入物排斥发生.随培育时间延长,裸鼠体内ACCM逐渐降解,植入的HUASMC分化形成结构良好、交错排列的平滑肌组织.器官浴槽实验显示,构建组织对去氧肾上腺素和电刺激均表现出收缩功能,去氧肾上腺素和电刺激所诱导的最大收缩力分别为(3.64±0.18)和(2.50±0.21)g.结论 HUASMC作为种子细胞与ACCM复合可构建出具有一定形态和功能的组织工程海绵体平滑肌.     

羊颈动脉脱细胞血管基质的制备及其生物相容性评价

目的研究脱细胞血管基质快速高效的制备方法并对其进行生物相容性评价,为组织工程血管的研究寻找合适的支架材料。方法取20根长50mm新鲜山羊颈动脉经-80℃冷冻、37℃水浴复温,反复冻融3次,在506MPa、4℃条件下超高压处理20min,0.125%SDS中37℃振摇(100r/min)12h,彻底去除细胞后,行HE染色、Masson染色、扫描电镜观察及生物力学测定研究其组织结构的变化;Hoechst33258荧光染色和细胞DNA残留量分析评价脱细胞效果;通过接触细胞毒性实验、MTT活性测试及皮下埋植实验对制备的脱细胞血管基质进行生物相容性分析。皮下埋植实验取清洁级SD大鼠10只,体重200～230g,分为2组(n=5),实验组于大鼠背部皮下埋植结合物理化学方法处理的脱细胞血管基质,对照组埋植单纯物理方法处理的脱细胞血管基质,分别于术后1、2、3、4、8周取出行HE染色观察。结果 HE染色及Masson染色显示脱细胞血管基质无细胞成分残留,保持较完整的胶原成分;扫描电镜观察血管表面以胶原为主,适合细胞黏附;Hoechst33258荧光染色脱细胞血管基质材料未见明显阳性核染色;苯酚-氯仿提取脱细胞血管基质残留DNA含量,电泳检测分析显示其中DNA含量较正常血管显著降低;生物力学检测示脱细胞血管基质最大荷载时的应力及应变与正常血管比较差异无统计学意义,保持了正常血管的力学特征;接触细胞毒性实验与MTT法测定示脱细胞血管基质与细胞有良好的黏附性,细胞毒性为0～1级;实验组皮下埋植术后8周材料周围基本未见炎性细胞,对照组仍有明显淋巴细胞浸润。结论经反复冻融、超高压及小剂量SDS处理的脱细胞血管基质是一种构建组织工程血管的理想支架材料。     

人关节软骨脱细胞基质的制备

目的制备人关节软骨脱细胞基质。方法切取人关节软骨,对之冷冻干燥后,采取化学去污剂TritonX100及DNA酶和RNA酶等试剂制备脱细胞的人关节软骨。做HE、番红0及软骨蛋白聚糖(aggrecan)免疫组化染色等方法进行检测。结果HE染色、番红0染色均显示细胞陷窝内己无细胞结构番红花0染色阳性;软骨蛋白聚糖免疫组化染色阳性。结论人关节软骨冻干后,经去污剂酶等处理方法可脱去软骨的细胞成分,并且保留了软骨细胞外基质,成功制备了人关节软骨脱细胞基质。     

尿道细胞外基质的研制

目的 探讨尿道细胞外基质(ECM)的制备方法。方法 采用4因素3水平，9次实验的正交设计[L9(3^4)]。切取37只兔的尿道，27条按正交设计随机分为9组行尿道脱细胞处理，试验重复3次。采用HE染色及计算机图像分析对尿道基质进行残余细胞成分计数，统计分析获得最佳方法：0．4％胰蛋白酶、l％甲醛加0．2％戊二醛、40U／ml DNA酶(A3B2C3方案)。另l0条兔尿道制备成尿道ECM并用于同种异体尿道缺损修复实验；分别于修复术后l0d，3、6及24周取材观察缺损修复处组织再生情况。结果 各组脱细胞后残余细胞成分量均不相同，第7、9组未发现细胞残余成分；制备的尿道ECM经扫描电镜分析未发观细胞残片。缺损修复实验术后10d，基质中见单层上皮细胞，且有血管长入ECM中，但管径较小，基质和受体尿道连接处有炎性细胞浸润；3周时尿道ECM管腔已完全被上皮细胞覆盖；6周时可见平滑肌细胞再生，炎性细胞消失。24周后基本结构近似正常。结论 制备尿道细胞外基质中3个关键条件的最佳水平为A3B2C3，即在尿道脱细胞处理过程中采用0．4％胰蛋白酶、1％甲醛加0．2％戊二醛、40U／ml DNA酶。     

比较不同处理方法对脱细胞真皮渗透性的影响

目的比较不同处理方法对猪脱细胞真皮渗透性的影响。方法对猪脱细胞真皮分别进行冷冻干燥、机械打孔、戊二醛交联三种处理，比较处理前后孔隙率的变化，并将100出浓度为1&#215;10^6／ml的成纤维细胞悬液分别接种于无处理脱细胞真皮基质（ADM）及经3种处理后ADM上，于1、3、5、7d用MTT法测定其OD值，每组各取接种1周后的复合皮行HE染色观察。结果猪脱细胞真皮的平均孔隙率为65．61％，冷冻干燥后为67．85％。机械打孔后为71．37％，经戊二醛交联后为66．11％。MTT试验的生长曲线图显示，成纤维细胞在打孔后ADM上黏附增殖优于其他组。切片HE染色显示，经打孔处理后，细胞可部分渗透至ADM内，其他组细胞仅在其表面爬行且膜片不完整。结论机械打孔法能提高猪脱细胞真皮的渗透性，可用于组织工程皮肤的构建。     

猪主动脉脱细胞基质的简化制备及生物学评价

目的应用酶法制备猪主动脉脱细胞基质，并评价其生物学性能。方法取新鲜屠宰的16根肉猪降主动脉，长10～12cm，应用0．1％胰蛋白酶和0．01％EDTA于37℃震荡条件下脱除细胞成分，HE和Masson染色行脱细胞基质的组织学观察，扫描电镜和透射电镜观察超微结构改变。应用单轴拉伸方法比较脱细胞前和脱细胞后48、96和120h时材料两断端厚度、极限抗张强度（ultimate tension stress，UTS）和断裂伸长率（strain of failure，SOF），绘制应力-应变曲线。取成年杂种犬3只，体重20～30kg，雌雄不限。将脱细胞前后片状主动脉基质埋植于犬脊柱两侧皮下，分别于埋植后1、3和6周取材，行HE染色观察，参照半定量的Wakitani评分法，对取材时的大体形态、浸润细胞种类和数量、新生血管等指标进行比较，观察宿主炎性细胞反应和脱细胞基质变化。将犬内皮细胞种植于猪脱细胞基质，HE染色和扫描电镜观察细胞相容性。结果HE染色和电镜检查显示在96h可将新鲜猪主动脉细胞成分脱除，Masson染色显示细胞外纤维成分保留完整。脱细胞前后的动脉基质厚度、UTS和SOF差异均无统计学意义（P〉0．05），但UTS显示降低趋势，SOF则呈现增加趋势，应力-应变曲线呈现力学强度降低和延展性增加的变化趋势。犬皮下埋植，各组脱细胞标本炎性细胞浸润明显减轻，6周时以成纤维细胞浸润为主，且基质中见新生毛细血管。半定量组织学评分，在大体观察、浸润细胞种类和数量方面与脱细胞前比较有统计学意义（P〈0．05）；新生血管数量比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。HE染色和扫描电镜显示种植的内皮细胞可在基质表面形成单细胞层。结论应用0．1％胰蛋白酶和0．01％EDTA持续振荡96h制备的猪主动脉脱细胞基质，在生物力学、免疫原性和细胞相容性方面可满足血管组织工程的需要。     

脱细胞基质与血管内皮细胞体外相容性的研究

目的 将猪血管内皮细胞和异体猪血管脱细胞基质相结合，探讨开发一种制备血管移植物的新方法。方法 分别利用0．1％胰蛋白酶、0．02％乙二胺四乙酸钠(EDTA)和1．0％Triton X—100对猪主动脉作用24小时和176小时进行脱细胞。异体猪血管内皮细胞分离出来并进行体外细胞扩增，再将脱细胞的血管内表面种植上血管内皮细胞。通过光镜和扫描电镜检测脱细胞血管基质是否存在细胞成分和内皮细胞是否生长其上。结果 酶—化学除垢剂的脱细胞方法几乎使细胞完全脱落，且基质纤维的三维结构变得疏松。体外扩增的异体猪血管内皮细胞可以种植在脱细胞基质上并且具有伸展和增殖功能。结论 Triton X—100和胰蛋白酶制备的脱细胞基质与异体猪血管内皮细胞具有良好的生物相容性，能结合到一起并在体外生成血管移植物。     

Long-term study of male rabbit urethral mucosa reconstruction using epidermal cell

Aim： To investigate the transformation of characteristics of epidermal cells from foreskin which were used to reconstruct male rabbit anterior urethra in combination with acellular collagen matrices. Methods： In three rabbits, autologous foreskin epidermal cells were isolated, expanded in vitro, and seeded （inoculated） onto a tubular acellular collagen matrix, acquired from allogeneic rabbit bladder submucosa. A urethral mucosal defect was created, and urethral reconstruction was performed with the tubular acellular collagen matrix seeded with epidermal cells. Results： On gross examination at 12 months following the procedure, the mucosa of the urethral grafts appeared lubricous and smooth. Urethrography showed that a wide urethral caliber had been maintained without any sign of strictures. Histological examination showed a transitional cell layer in the graft without evidence of a margin between the graft and the host tissue at 12 months postoperatively. Conclusion： Epidermal cells seeded onto acellular collagen matrices can be successfully used to reconstruct urethras that have defects and are transformed to transitional epithelial cells.     

曲拉通X-100对制备猪胸主动脉脱细胞血管基质影响的实验研究

目的为将内皮细胞和平滑肌细胞种植于脱细胞血管基质(Acellular Tissue Matrix,ACTM)上形成组织工程化血管提供实验依据.方法用曲拉通(Triton)X-100等试剂制备猪胸主动脉ACTM,并寻找曲拉通X-100的最佳浓度.取家猪的新鲜去除外膜胸主动脉56根,随机分成7组,每组分别浸入不同浓度的曲拉通 X-100中作用144 h～240 h.标本作HE弹力纤维染色,大体、光镜及透射电镜观察.结果经上述试剂处理后,光镜及透射电镜检查显示,制备出的猪胸主动脉脱细胞血管基质由胶原纤维、弹力纤维和某些不可溶的、变性细胞器构成.曲拉通 X-100最佳浓度为1%.时间为176.25 h±5.5 h.结论本方法可成功制备猪胸主动脉ACTM,1%曲拉通 X-100是制备血管ACTM的良好试剂.     

人包皮脱细胞基质组织工程化尿道的可行性研究

目的:为人包皮脱细胞基质作为尿道组织工程修复材料提供依据。方法:制备人包皮脱细胞基质,对其进行组织学观察、细胞毒性以及体内实验,检验其作为尿道材料的安全性和组织相容性。结果:制备的人包皮脱细胞基质,细胞去除完全,用原代包皮上皮细胞测定其细胞毒性,结果显示细胞相对增值率在75%～99%之间,细胞毒性为1级,符合国家标准,回植体内后,随着时间的延长,人包皮脱细胞基质与尿路上皮细胞结合完好,正常尿道复层结构层次逐步恢复。结论:人包皮脱细胞基质抗原性低,相容性好,可以作为组织工程尿道的支架材料。     

骨骼肌无细胞基质的制备及其生物相容性研究

目的细胞外基质是脂肪组织工程材料的研究热点之一。通过探讨骨骼肌无细胞基质的制作方法及生物相容性,为其在脂肪组织工程中的应用奠定基础。方法取健康成年小香猪新鲜骨骼肌组织,横切成厚2～3 mm的组织块,采用低渗-去垢剂法脱细胞处理。处理后采用HE染色、Masson三色染色、免疫组织化学染色及扫描电镜检测骨骼肌无细胞基质是否有细胞成分残留,并观察其基本结构;应用MTT法检测骨骼肌无细胞基质细胞毒性。取乳腺癌患者自愿捐赠脂肪组织,分离培养人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs),从形态学、流式细胞学和成脂、成骨分化能力方面进行鉴定。将骨骼肌无细胞基质与第3代hADSCs共培养,于培养后第1、3、5、7天通过细胞活性检测材料上细胞黏附、扩散和增殖情况,了解其与细胞之间的相互作用。结果 HE、Masson、免疫组织化学染色及扫描电镜观察显示骨骼肌无细胞基质肌纤维去除完全,无细胞核残留,基质结构保留完整;大量连接成网状的胶原纤维呈多孔隙样结构,规则排列。MTT检测示骨骼肌无细胞基质细胞毒性为1级,细胞相容性好。细胞活性检测示hADSCs在骨骼肌无细胞基质上能很好地伸展,且能与周围基质黏附,进入基质内部并相互交织。结论经脱细胞处理的骨骼肌无细胞基质具有良好生物相容性,可能作为脂肪组织工程的支架材料。     

Urethral replacement using epidermal cell-seeded tubular acellular bladder collagen matrix

OBJECTIVES: To investigate the feasibility of replacing urinary epithelium cells with foreskin epidermal cells to reconstruct engineered anterior urethra with an acellular collagen matrix. MATERIALS AND METHODS: Acellular collagen matrices were generated from allogeneic rabbit bladder submucosa. In nine rabbits, autologous foreskin epidermal cells were isolated, expanded in vitro, and labelled with 5-bromo2'-deoxy-uridine (BrdU) before seeding onto a tubular acellular collagen matrix (1.5x1 cm). In male rabbits, a urethral mucosal defect was created, and urethroplasty performed with a tubular acellular collagen matrix seeded with epidermal cells (nine rabbits) or with a matrix with no cell seeding (nine rabbits; control group). Urethrography was done at 1, 2 and 6 months after grafting. The urethral grafts were harvested and analysed grossly and histologically. RESULTS: In the control group, gross views and urethrography revealed stricture of repaired defects at the different sample times. In the experimental group, a wide urethral calibre was maintained with no sign of strictures. Histology in the control group showed a single layer of epithelium cells with disorganized muscle fibre bundles in the submucosa layer at 1 month after grafting, and a transitional cell layer surrounded by disorganized muscle fibre bundles at 2 and at 6 months. Grafts seeded with epidermal cells formed a single-layer structure by 1 month, and at 2 and 6 months there were several layers of epidermal cells with abundant vessels in the submucosa. There was an evident margin between graft epidermal cells and host epithelium at 6 months. The implanted cells expressed keratin, shown by staining with anti-pancytokeratins. Immunofluorescence for BrdU confirmed the presence of implanted epidermal cells at 1 month after grafting; there were fewer positive cells at the implantation site at 2 months. At 6 months, there were several layers of epidermal cells with no signs of BrdU staining. CONCLUSIONS: Urethral reconstruction was better with an acellular collagen matrix seeded with epidermal cells than with the acellular collagen matrix alone. Foreskin epidermal cells seem adequate in replacing urethral epithelium cells for urethral reconstruction.     

Comparison of partial urethral replacement with acellular matrix versus spontaneous urethral regeneration in a canine model

OBJECTIVE: To determine whether acellular matrix could be used for partial urethral replacement and to compare regeneration over acellular matrix versus normal spontaneous urethral regeneration. MATERIALS AND METHODS: The study included 21 male mongrel dogs in which a 3-cm segment including half of the urethral circumference was excised. In 13 dogs (study group), the defect was covered by acellular matrix of the same length and width obtained from female mongrel dogs and prepared to have complete cell lysis with keeping of the fiber framework. In 8 dogs (control group), the urethral defect was not covered by any urethral tissue. In both groups, an 8F feeding tube was kept inside the urethra for a mean duration of 2 weeks. In the study group, dogs were sacrificed at 1 week, 2 weeks, 3 weeks and then one dog every month for 10 months. In the control group, one dog was sacrificed every month for 8 months. RESULTS: All dogs survived the procedure. In the study group, 10 dogs underwent urethrogram; 8 were normal, 1 had diverticulum and 1 had relative narrowing. In the control group, 6 dogs underwent urethrogram; 5 were normal and 1 showed relative narrowing. Histopathological examination of the study group showed gradual regeneration over the acellular matrix with normal appearance at 20 weeks. In the control group, normal healing was observed at 2 months and thereafter. CONCLUSION: Regeneration of all components of the urethra can occur gradually over acellular matrix and is complete at 20 weeks. Regeneration of a urethral defect 3-cm long including half of the urethral lumen is possible with or without acellular matrix.     

应用异体脱细胞尿道基质修复尿道缺损

目的探讨应用同种脱细胞尿道基质修复尿道缺损的可行性。方法将14只雄性新西兰兔分为两组，切除实验组长约1.0～1．5cm的尿道，用相应长度脱细胞尿道基质修复；对照组行假手术。术后行尿道造影并取尿道标本作病理检查。结果12只实验兔的脱细胞基质移植物没有移位。除2例狭窄、2例尿瘘外，其余满意效果。病理检测示，术后3周尿道管腔上皮化，6个月基质中平滑肌及血管再生明显。结论同种脱细胞尿道基质材料可以修复兔尿道部分缺损。     

去细胞猪主动脉瓣叶的获取和内皮细胞的种植

目的　探讨猪主动脉瓣叶去细胞后作为组织工程心脏瓣膜支架的可行性。　方法　经胰酶 - EDTA、表面活性剂和核酸酶处理 ,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分 ,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性 ,并在其表面种植新生牛主动脉内皮细胞 (BAECs) ;分别行大鼠皮下包埋实验。　结果　猪主动脉瓣叶中的细胞成分能完全去除 ,获得完整无细胞的纤维网状支架 ,断裂强度和断裂伸长率无明显变化 ;种植的 BAECs在去细胞瓣叶表面可形成一层连续的细胞层 ,其分泌前列环素 (PGI2 )的能力同直接种植在 2 4孔板中的比较 ,差异无统计学意义 (P>0 .0 5 )。　结论　猪主动脉瓣去细胞后获得的纤维支架可以用来构建组织工程瓣膜 ,适宜于血管内皮细胞的生长。