水牛HSD17B1基因启动子荧光素酶报告基因载体构建与分析

试验旨在筛选水牛HSD17B1基因启动子活性区域及影响因素,并预测其转录结合因子,为探究该基因在水牛繁殖性能中的调控机理提供理论依据。以水牛血液基因组DNA为模板,PCR扩增得到3个HSD17B1基因启动子活性区域序列,并定向克隆至pGL3-promoter载体;将重组质粒转染到水牛卵泡颗粒细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性,并探究其与促黄体素（luteinizing hormone,LH）和促卵泡素（follicle stimulating hormone,FSH）的关系;利用生物信息学方法对HSD17B1基因启动子区进行转录结合因子预测。结果显示,本试验成功克隆了3个不同长度的HSD17B1基因启动子片段,并成功构建了双荧光素酶报告载体。经不同长度启动子片段的活性检测发现,pGL-pro-HSD17B1-1500活性最强,证实－866/－1 500 bp为HSD17B1基因核心启动子区域,表明该区域对HSD17B1基因转录调控有重要作用。荧光素酶活性检测结果显示,添加LH可增强HSD17B1基因启动子活性。生物信息学分析发现,HSD17B1基因启动子区存在6个转录因子结合位点：Sp1（－2 327/－2 317 bp）、HOXA4（－2 162/－2 146 bp）、Sp1（－1 409/－1 395 bp）、Sp1（－1 391/－1 380 bp）、Sp1（－1 345/－1 319 bp）和GATA1（－812/－801 bp）,但无CpG岛,有1个TATA-box和2个CAAT-box。本研究成功构建了HSD17B1基因启动子荧光素酶报告载体,确定了HSD17B1基因启动子核心区域,并证明LH可增强启动子活性。     

HSD17B12基因对湖羊垂体细胞促性腺激素合成的影响

旨在探索湖羊垂体中17β-羟类固醇脱氢酶12(HSD17B12)基因对垂体激素分泌的影响.本研究挑选体重相近(40 kg左右)且健康的性成熟湖羊公羊(9月龄)3只,采集垂体组织进行HSD17B12基因CDS区扩增及蛋白同源性分析,确定其CDS区序列.利用免疫组化分析HSD17B12在性成熟雄性湖羊垂体中的表达定位.体外...     

猪HSD11B1和MyoG基因多态性与妊娠期长短的关系

选择HSD11B1和MyoG2个基因作为影响妊娠期长短的候选基因。在7个中外猪群体中采用PCR-RFLP技术研究了HSD11B1和MyoG2个基因多态性与妊娠期长短的关系。HSD11B1基因的PCR-Bsh1236Ⅰ-RFLP分析结果表明：清平猪、新清平猪母系、大白猪、长白猪、杜洛克猪、中国瘦肉猪新品系DIV1和DIV2系猪群中A等位基因的频率分别为0.538、0.752、0.522、0.941、1.000、0.889和0.594;除DIV2外,HSD11B1不同基因型与妊娠期长短无显著关系（P〉0.05）。MyoG基因的PCR-MspⅠ-RFLP分析结果表明：清平猪、新清平猪母系、大白猪、长白猪、杜洛克猪、中国瘦肉猪新品系DIV1和DIV2系猪群中M等位基因的频率分别为1.000、0.534、0.370、0.115、0.094、0.382和0.243;清平猪中只存在MM基因型,其他群体中3种基因型皆有分布;新清平猪母系MM比NN基因型母猪妊娠期要短,且在经产长白猪中差异极显著（P〈0.01）。     

生殖激素控制卵泡细胞凋亡的研究进展

研究表明颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因,而颗粒细胞凋亡涉及许多因素,其中生殖激素,如GnRH、FSH、LH、P4、E、A、GH、Mel、inhibin、activin、follistatin等间接地和直接地对卵巢卵泡细胞凋亡发挥重要的综合控制作用,因此正确理解激素对体内、外卵泡及颗粒细胞发育和衰亡的调节网络具有很重要的理论和实践意义。     

水牛HSD17B1基因克隆分析及其真核表达载体构建

为了阐明水牛17β-羟类固醇脱氢酶1 (17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1,HSD17B1)基因对水牛繁殖性能的影响,本试验采用了3'-RACE克隆获得HSD17B1基因,并对其核苷酸序列和蛋白质序列进行了生物信息学分析,通过构建其真核表达载体并转染293T细胞验证所构建载体的准确性。结果表明,水牛HSD17B1基因编码区长954 bp,3'-UTR区长58 bp,编码317个氨基酸。BLAST分析显示水牛HSD17B1核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、犬、非洲象和人的相似性分别为100%、100%、92%、94%、87%、87%和87%,系统进化树分析结果表明,HSD17B1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性。蛋白质分析结果表明HSD17B1蛋白呈弱酸性,无信号肽,亚定位于细胞质,存在type1_17beta-HSD-like_SDR_c、PRK05993、LPOR和FabG等结构域。试验成功构建了水牛HSD17B1基因真核表达载体pEGFPN1-HSD17B1,转染293T后,产生较强的绿色荧光信号,表明能够形成HSD17B1-EGFP融合蛋白。水牛HSD17B1基因的克隆及其真核表达载体的成功构建,为今后阐明HSD17B1基因在水牛卵泡及胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了理论基础。     

CDK2和P53在细胞中心体复制与调控中的作用

中心体是真核生物重要的细胞器,其复制与调控异常可能是体外胚胎发育异常的重要原因,而CDK2和P53是调控中心体复制的关键且必要因子,在细胞中心体复制调控中起核心作用。作者简要介绍了中心体的功能和复制过程,重点综述了CDK2、P53及其相关因子在中心体复制调控中的作用,对研究体外受精胚胎和克隆胚胎的发育异常具有一定的理论意义。     

卵巢颗粒细胞自噬研究进展

卵巢颗粒细胞(granulosa cells, GCs)是雌性动物卵泡发育的基础保障。过去人们普遍认为GCs凋亡能调控卵泡发育。然而;近年来研究发现GCs自噬也能调控卵泡发育。在畜牧养殖行业中;卵泡发育的优劣与雌性动物繁殖率的高低息息相关;直接影响养殖场经济效益。目前;越来越多研究表明miRNAs是调控GCs自噬的因素之一。因此;本文将从GCs的来源、结构和功能、GCs自噬对卵巢的重要性、卵巢GCs自噬相关的miRNAs及其对卵泡发育的调控作用等方面的研究进展进行综述;以期为今后相关研究提供参考。     

咖啡酸对玉米赤霉烯酮诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用

卵巢颗粒细胞通过与卵母细胞相互作用及其自身分泌作用为卵泡的形成和发育成熟提供特殊的微环境.多种有害刺激可引起颗粒细胞凋亡和代谢失调从而降低卵母细胞质量,对胚胎的形成产生负面影响.玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)是畜禽养殖业中常见的造成卵巢颗粒细胞损伤的霉菌毒素,且缺少有效治疗药物.因此,本试验用ZEA造成...     

BMP4/SMAD4通过下调GJA1基因表达影响绵羊卵巢颗粒间隙连接活性

旨在探索骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4, BMP4)对绵羊卵巢颗粒细胞中间隙连接蛋白基因(gap junction protein alpha 1, GJA1)表达的影响及其分子调控机制。本研究利用廊坊市屠宰场收集的2~4岁健康绵羊卵巢分离颗粒细胞;采用免疫荧光染色技术定位GJA1在颗粒细胞中的分布。将细胞随机分为4组;分别添加0、10、50和100 ng·mL^-1浓度的重组BMP4蛋白;每组3个重复;培养24 h;利用CCK-8法评估细胞活性;RT-qPCR和Western blot研究BMP4对GJA1的mRNA和蛋白表达水平的影响。为探究BMP4调控GJA1表达的潜在机制;将细胞随机分为3组;每组3个重复;除对照组外分别添加10 μmol·L^-1 BMP I型受体抑制剂(Dorsomorphin)和干扰小RNA敲除SMAD家族蛋白4(SMAD family member 4, SMAD4);均添加100 ng·mL^-1的BMP4处理细胞24 h;RT-qPCR检测GJA1和SMAD4表达量;Western blot分析测定GJA1和SMAD4表达水平以及SMAD1/5/8的磷酸化水平;最后利用划痕染料示踪试验检测绵羊卵巢颗粒细胞之间的间隙连接活性。结果显示;BMP4显著抑制了绵羊卵巢颗粒细胞中GJA1表达和间隙连接活性(P < 0.05);此抑制效应在添加Dorsomorphin和敲除SMAD4后显著减弱(P < 0.05);同时;BMP4处理显著增加了SMAD1/5/8的磷酸化水平(P < 0.05)。综上;BMP4通过SMAD1/5/8-SMAD4信号转导调控GJA1表达进而影响颗粒细胞间隙连接活性;本结果增加了对绵羊BMP/SMAD通路调控颗粒细胞间隙连接活性的了解;为改进体外卵泡成熟方法和高繁母羊的分子育种提供了基础。     

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组(P<0.01),输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组(P<0.05),其他组织未达到差异显著性(P>0.05)。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组(P<0.05),P4含量在12 h显著高于对照组(P<0.05);超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用(P<0.05),48、72 h达到极显著促进作用(P<0.01),并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低(P<0.01)。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。     

干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞乳脂和酪蛋白的影响

通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ（si-HSD17B4）基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 mRNA在水牛各个组织中的相对表达量。合成3条水牛HSD17B4小干扰RNA （siRNA）和1条对照si-HSD17B4-nc （si-nc）,并筛选干扰效果最佳的片段和时间。si-HSD17B4转染水牛乳腺上皮细胞后,通过酪蛋白试剂盒检测酪蛋白的表达情况,通过甘油三酯测定和油红O染色检测甘油三酯含量,通过实时荧光定量PCR检测干扰HSD17B4基因对甘油三酯、脂肪酸合成以及氧化相关基因表达的影响。结果表明,HSD17B4基因在水牛心脏和卵巢中相对高表达,且显著高于其他组织（P<0.05）。3条HSD17B4 siRNA片段均能有效地抑制HSD17B4基因的表达,其中si-HSD17B4-1干扰效果最佳,HSD17B4 mRNA表达量极显著低于对照组（P<0.01）;最佳干扰时间为24 h。酪蛋白检测结果显示,干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成无影响。甘油三酯测定结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中甘油三酯含量上升,差异显著（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中的脂滴明显增多。实时荧光定量PCR检测结果显示,干扰HSD17B4基因会使FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2、PLIN2、BTN1A1基因表达量上调,分别上调9.28（P<0.01）、1.36（P<0.05）、1.17（P<0.05）、1.83（P<0.01）、1.60（P<0.01）和2.17（P<0.01）倍;同时使PPARA、SREBP1C、SCD、ACSS2、ACACA、AGPAT6、LPIN1、XDH、ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因表达量下降,分别下调至50.55%（P>0.05）、61.15%（P<0.01）、84.91%（P<0.01）、89.34%（P<0.01）、21.88%（P<0.01）、86.48%（P<0.01）、25.35%（P<0.01）、27.24%（P<0.01）、41.74%（P<0.01）、22.17%（P<0.01）、62.70%（P<0.01）和70.33%（P<0.01）。结果表明,HSD17B4基因在水牛组织中广泛表达;si-HSD17B4高效抑制HSD17B4基因在水牛乳腺上皮细胞中的表达,未检测到干扰HSD17B4基因对乳腺上皮细胞酪蛋白的影响,干扰HSD17B4基因上调了FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2基因的表达,从而促进甘油三酯的合成,同时降低ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因的表达,减少脂肪酸β-氧化。